Revisión bibliográfica sobre las nuevas técnicas de ingeniería de tejidos aplicables a la Odontología.

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1 Asignatura de Anatomía Patológica General y Bucal Javier Martínez Negrín Manuel Muerie Garrido R. Domínguez-Mompell Micó Jesús Pérez Aguirre Alumnos de 2º Odontología Universidad Rey Juan Carlos Correspondencia: Facultad de Ciencias de la Salud Área de Anatomía Patológica Av de Atenas s/n Alcorcón, Madrid Revisión bibliográfica sobre las nuevas técnicas de ingeniería de tejidos aplicables a la Odontología. Las nuevas técnicas de ingeniería genética de tejidos han permitido a los investigadores obtener resultados prometedores en el ámbito de la odontología. Los científicos han conseguido desarrollar células madre embrionarias a partir de células de la piel humana, asignándoles el nombre de Células Madre Pluripotenciales Inducidas (del inglés: Induced Pluripotencial Stemcells "IPS"). Estas celulas no son del todo iguales a las procedentes del cultivo y selección de embriones en laboratorio. El evento no solo ha supuesto un gran avance científico sino que también, amplía significativamente el abanico de posibilidades antes desechadas por los prejuicios éticos y morales. En lo que a la odontología se refiere, no ha habido que esperar mucho tiempo antes de obtener resultados prometedores ya que en contraste con otros tejidos, los dientes y demás tejidos orales parecen ser "fácilmente accesibles" para la cirugía y la ingeniería tisular. Palabras clave: Patología cabeza y cuello; ingeniería de tejidos; odontogénesis; células madre; odontología; BMPs; SCAP; pluripotencialidad; osteogénesis y odontoblastos. 1. TOTIPOTENCIALIDAD. ZIGOTO O EMBRION UNICELULAR. En los momentos posteriores a la fecundación, el embrión unicelular -la primera célula del nuevo individuo-, tiene en su nucleo toda la información genética de un nuevo ser humano, distinto de sus padres. Ese nuevo ser unicelular posee la capacidad de empezar a desarrollar todo un individuo humano. El DNA de ese embrión esta absolutamente legible, se puede expresar toda la información, se pueden leer todos los genes. A las 24 horas se produce la primera división celular. En sus primeros estadios (sus primeras divisiones celulares), el DNA del zigoto tiene la peculiaridad de permanecer puro, sin plegamientos. Por tanto, si separáramos artificialmente las dos primeras células del zigoto bicelular, comprobaríamos que cada célula generará un embrión. Estas células del embrión en sus fases iniciales se llaman CELULAS TOTIPOTENCIALES, es decir, que pueden dar lugar a TODO un individuo (1). 2. PLURIPOTENCIALIDAD A medida que el embrión sigue su desarrollo y se van produciendo más divisiones celulares, las células embrionarias se van diferenciando hacia funciones y estirpes celulares determinados. Esta diferenciación se consigue a través de los plegamientos en el DNA celular, que dejan ilegibles los genes que no va a necesitar expresar esa célula. De esta forma, cuando el embrión ya está en fase de blastocisto (7-14 días postfecundación),, si extrajéramos artificialmente las células de su Masa Celular Interna y las cultiváramos, nunca darían lugar a un embrión completo, sino a estirpes celulares determinadas por los genes que en ese momento se pueden leer. Estas células que tienen capacidad para dar lugar a cualquier estirpe celular, pero no a un embrión completo, las denominamos CELULAS PLURIPOTENCIALES. En el caso descrito, estas células pluripotenciales se llamaría también CELULAS MADRE EMBRIONARIAS o STEM CELL EMBRIONARIAS. En sus sucesivas divisiones, la célula madre embrionaria va perdiendo su capacidad de dar lugar a todos los distintos tejidos, al tiempo que empiezan a diferenciarse, a especializarse hacia un tejido u otro. Las células en su desarrollo poseen dos cualidades básicas: la pluripotencialidad y la diferenciación, que se contraponen: cuanta más pluripotencialidad posee una célula, menos grado de diferenciación tiene, y al revés. 1 Foros de Patología de la URJC

2 La pluripotencialidad, propia de la célula inmadura o indiferenciada, es la capacidad de una célula para convertirse en todas las posibles estirpes celulares. La diferenciación sin embargo es la cualidad por la cual la célula adquiere ya una especialización dentro de un tipo celular concreto que le hace no poder convertirse en otro tipo celular distinto. En el embrión existen gran cantidad de células pluripotenciales que se multiplican a gran velocidad para ir dando lugar las diferentes partes y órganos del individuo. A medida que proliferan esas células, se van diversificando hacia un órgano y otro corporal, produciéndose la especialización: esa célula está ahí con una ubicación, y con un función concreta. Así pues, cuando el feto se encuentra aproximadamente en el 3 mes de vida (fin de la etapa de organogénesis), la mayor parte de sus células ya se hallan diferenciadas según el tipo celular que se necesita para cada órgano. Tras el nacimiento, prácticamente todos los tejidos, sobre todo aquellos que más se renuevan, conservan una cantidad pequeña variable de células pluripotenciales capaces de multiplicarse y poder así proporcionar células con el fin de renovar y reparar los tejidos en los que residen. Esas células formadoras de múltiples células hijas, que están programadas para regenerar el tejido donde residen, se llaman célula MULTIPOTENCIALES. Son otro tipo de células madre o progenitoras (stem cells)(1). 3. MULTIPOTENCIALIDAD La multipotencialidad se define como la capacidad de generar células, pero sólo del tipo celular del tejido al que pertenecen o residen. Estas células existen, y están presentes en la mayoría de los órganos de la economía corporal del adulto, y conviviendo en su órgano con el resto de las células diferenciadas, tiene una propiedad única: dar lugar a los distintos tipos celulares que componen el órgano en el que residen con el fin, por ejemplo, de renovar las poblaciones de células que van envejeciendo. Vamos a ilustrar este fenómeno con un ejemplo. El corazón está compuesto por millones de células de distintas estirpes: células musculares, células endoteliales de revestimiento de los vasos del corazón, células de conducción del impulso nervioso... Muchas de esas células citadas, no pueden dividirse, y si se llegaran a dividir, sólo darían lugar a células iguales a ellas. Ahora bien, se ha descubierto recientemente que existen células en el corazón?células madre cardíacas-, que conviviendo con las antes citadas, tienen la capacidad de dividirse y dar lugar a células de las tres estirpes citadas. Estas células algunos las llaman MULTIponteciales, por su capacidad para dar regenerar células del órgano en el que residen. Algunos autores han llamado a estas células madre de adulto, células madre ORGANO-ESPECÍFICAS, para diferenciarlas de las embrionarias. En el caso que se produzca un infarto de pequeño tamaño, esas células pueden cubrir esa zona infartada con células cardíacas y endoteliales generadas por ellas. Estas células madres también se han encontrado en muchos otros órganos: cerebro, hígado, piel, retina, médula ósea... La capacidad de estas células madre de adulto para regenerar zonas dañadas es muy limitada, y se ciñe sólo a zonas de pequeños infartos. Grandes áreas de infarto no son susceptibles de ser regeneradas por estas células (1). Es la Médula Ósea el "órgano" en el que mejor se conoce la función de estas células madre, como una fuente inagotable para la regeneración de las poblaciones celulares de la sangre(glóbulos rojos y leucocitos...), y como veremos ahora, también de otros órganos corporales. DISTINTAS APLICACIONES EN EL ÁMBITO ODONTOLÓGICO. Las anomalías craneofaciales son frecuentes en la población que asiste a la consulta odontológica. Estas patologías pueden afectar severamente la apariencia, función y aspecto psicológico de un paciente. Aunque se han realizado investigaciones (injertos autólogos, alógenos, materiales prostodonticos) para corregir estos defectos, todos poseen limitaciones inherentes como la morbilidad del sitio donador, la reabsorción del injerto, poca cantidad de tejido propio donador, enfermedades virales de transmisión, incompatibilidad inmunológica, rechazos en la estructura y/o la forma de los injertos, y resultados estéticos deficientes. Las estrategias actuales incluyen la utilización de injertos autólogos y sintéticos. Aunque muchos de estos avances son buenos, presentan limitaciones como por ejemplo, la insuficiente cantidad de tejidos donantes para realizar los injertos, la mala morfología de los injertos (mayor problema en los injertos óseos), además de grandes reabsorciones encontradas luego de los implantes. Con respecto a los materiales sintéticos, el cuerpo siempre trata de encapsular todo objeto extraño produciendo 2 Foros de Patología de la URJC

3 su rechazo, por lo cual se ha llegado a la pregunta Cuál será el material ideal de reemplazo para la pérdida de los tejidos? El estándar de oro seria el mismo tejido natural, por lo cual, se ha llegado a la ingeniería de un tejido nuevo a partir del mismo tejido preexistente. Las estrategias que utiliza la bioingeniería para crear nuevos tejidos y órganos se fundamentan en la combinación de materiales artificiales con moléculas bioactivas que inducen la formación tisular o el crecimiento de células en un laboratorio. Las moléculas bioactivas usadas más frecuentemente son factores de crecimiento o proteínas de matriz extracelular. Esta combinación puede ser realizada mediante procedimientos conductivos, inductivos y de transplante de células. 1. Estrategias conductivas: Utilización de materiales de manera pasiva como las membranas para guiar la regeneración tisular. 2. Estrategias inductivas: Colocación de células o factores como las proteínas morfogenéticas óseas (BMPs) que se activan en el sitio del defecto induciendo la formación de los tejidos. 3. Estrategias de trasplante celular: Trasplante directo de células producidas en el laboratorio. El odontólogo toma una biopsia la envía al laboratorio y allí es colocada en moldes prefabricados, que generan tejido para implantarlo posteriormente en el paciente. Un fallo muy común en las tres técnicas, es el uso del material polimérico el cual sirve como medio de transporte de las células o tejidos fabricados, ya que estos al degradarse van a formar ácidos que afectan el sitio del injerto, por esta razón se están investigando nuevos materiales para realizar la movilización de estos injertos. A lo largo de los últimos años se han estudiado diferentes materiales biodegrables. El principal uso de la cerámica ha sido en la ingeniería de tejidos de hueso, donde modelos porosos con hidroxiapatita han sido utilizados para llevar células osteoprogenitoras derivadas del periostio del hueso medular. Los polímeros sintéticos han sido utilizados de gran manera como materiales para los modelos debido a sus buenas características de procesamiento. Estos materiales tienen un rango de degradación corto (días), o largo (meses). Normalmente, los modelos poliméricos se encuentran en forma de mallas fibrosas, esponjas porosas o hidrogeles. Los materiales para los modelos juegan un papel importante en la estabilidad mecánica, no solo de células individuales sino también en la construcción completa del tejido antes de la síntesis de la nueva matriz extracelular. Es deseable la biocompatibilidad de las propiedades mecánicas del material y de aquellas del tejido. Recientemente, se han desarrollado nuevas estrategias para reemplazar los tejidos afectados, teniendo en cuenta la forma como el cuerpo realiza normalmente los procesos de ingeniería de tejidos: 4. Modelo endógeno: Crear nuevo hueso a partir del conocimiento de procesos naturales. Un ejemplo muy común es el estudio de la distracción osteogénica en la cual se investigan los procesos moleculares que están involucrados para poder utilizar diferentes estrategias en la formación de nuevo hueso. 5. Estrategia de recombinación con bases protéicas: El mayor esfuerzo realizado en esta estrategia se ha basado en la colocación de factores de crecimiento exógenos, para aumentar la inducción de hueso o la cicatrización de un tejido. Muchos trabajos se han enfocado en suplir con factores de crecimiento exógenos para aumentar la inducción ósea o la cicatrización de fracturas. En modelos animales, los factores de crecimiento han sido administrados localmente para aumentar la reparación de defectos craneofaciales de tejido óseo en cráneo, proceso cigomático, procesos alveolares, procesos periodontales y mandibulares. Entre las numerosas proteínas osteogénicas y angiogénicas que han sido investigadas están: el factor de crecimiento transformante ßs (TGF-ßs), la activin A, las BMPs, el factor de crecimiento fibroblástico (FGF-1, FGF-2), factores de crecimiento parecidos a la insulina (IGF), factor de crecimiento derivado de las plaquetas (PDGF) y hormonas de crecimiento (GH). En esta forma se ha utilizado BMP2 recombinante sobre esponjas de colágeno por medio de CT scan y de histología, para aumentar el proceso alveolar en pacientes que requieren aumento óseo de los defectos de las paredes bucales luego de las exodoncias. También se añaden factores de crecimiento directamente a PLA/PGA biodegradables para la fijación ósea en cirugías cráneofaciales. 3 Foros de Patología de la URJC

4 6. Los procedimientos inductivos: Activan células cercanas al tejido por medio de señales específicas. Estos procedimientos se han fortalecido gracias al descubrimiento de factores de crecimiento osteogénicos y angiogénicos. Las proteínas de la matriz extracelular (MEC), también inducen neoformación ósea cuando son colocadas en el sitio del defecto. Estas proteínas tienen la capacidad de dirigir la función de las células residentes y por lo tanto pueden promover la regeneración tisular. Por ejemplo, una preparación de proteínas del esmalte derivadas de tejido de cerdos es utilizada para regenerar tejidos periodontales en humanos, la laminina (otra proteína de MEC) está siendo probada por su habilidad para mejorar la adhesión a los implantes dentales. Para que la inducción tisular sea exitosa clínicamente, los factores biológicos de inducción deben activarse en los sitios deseados por el tiempo necesario. Por esta razón uno de los objetivos de la bioingeniería es diseñar nuevos sistemas de liberación controlada. Se ha demostrado que las células incorporan el DNA liberado y producen cantidades suficientes de proteínas inductivas que promueven la neoformación de tejidos. 7. Estrategias basadas en genes: El objetivo es iniciar la cascada de expresión génica que permita el reclutamiento celular, la diferenciación, la producción de matriz y el ensamblaje ordenado de estructuras para la regeneración de tejidos. Las estrategias genéticas se han mejorado durante los últimos años y los modos de transmisión se pueden dividir en virales y no virales. Dentro de los modos virales, los adenovirus han sido utilizados para los métodos basados en la transferencia genética como medio de transporte para los genes, ya que presentan gran habilidad para infectar las células con los nuevos genes, y además poseen una alta eficiencia de transfección y una gran capacidad transgénica. Se han ermpleado adenovirus para transportar potentes factores angiogénicos (VEGF) y osteoinductores (BMPs) en ratas. Los modos no virales como la transferencia génica mediada por genes liposómicos han sido muy poco utilizados ya que presentan una baja eficiencia en la transferencia de genes. 8. Estrategias basadas en células: Cuando un tejido es incapaz de cicatrizar un defecto, o cuando un tejido u órgano debe ser diseñado in vitro, se necesitan de bloques de células vivas para sus requerimientos. Para que una célula sea funcional en la ingeniería de tejidos craneofaciales, debe seguir ciertos criterios, tales como ser capaz de formar múltiples tejidos, no ser inmunogénica, ser de rápida y fácil expansión en cultivos y ser accesible con mínima morbilidad para el sitio donante. Aunque las stem cells derivadas de embriones cumplen con la mayoría de estos criterios, las controversias académicas y políticas sobre la ética de la obtención de estas células, han conllevado al estudio de las stem cells derivadas de tejidos adultos. Las stem cells derivadas de hueso medular o BMSC, son probablemente las más utilizadas. La nueva y más interesante fuente de stem cells adultas se encuentran en las células de tejido graso obtenidas luego de procedimientos como la liposucción. Estas células tienen la capacidad de diferenciarse a linajes adipogénicos, osteogénicos, condrogénicos o miogénicos. Algunos estudios preliminares sugieren que estas células de tejido adiposo migran hacia lugares de cicatrización ósea, sin embargo los procesos involucrados en la diferenciación de estas células, aún no se han aclarado totalmente. 9. Construcción compleja de tejidos/órganos: Depende del sitio donde se va a fabricar el tejido u órgano. a. Biorreactivos in vitro: utiliza moldes tridimensionales con complejos celulares para trasplantes eventuales. b. Recipientes heterotópicos: utiliza células propias para trasplantes heterotópicos. c. Donador exógeno: utiliza animales como donantes de órganos o tejidos. Actualmente varios laboratorios en diferentes sitios del mundo trabajan en la bioingeniería de tejidos. "Creative Biomolecules, Orquest, Sulzer Orthopedics Biologics, Genetics Institute, Osiris Therapeutics, Regeneron" son algunas de las entidades que investigan en la producción de huesos de mandíbula y extremidades, mediante la fabricación de estructuras artificialmente creadas a las que se le añaden factores de crecimiento y células mesenquimatosas. "Massachusetts General Hospital" y "The University of Texas Health Science Center" en Houston, son algunos de los laboratorios que investigan en el reemplazo de dientes humanos artificialmente creados con células mesenquimatosas, odontogénicas y epiteliales estimuladas con proteínas produci- 4 Foros de Patología de la URJC

5 das por los genes necesarios para crear la estructura dental. Biora, Atrix Laboratories, Creative Bio- Molecules? representan algunas de las firmas que trabajan en la elaboración de esmalte artificial para rellenar cavidades producidas por caries. Ingeniería de Hueso Los defectos óseos secundarios a una lesión, enfermedad, y/o desórdenes congénitos representan un problema importante de salud. Las estrategias actuales que se encuentran dirigidas a sustituir los defectos óseos, incluyen la utilización de injertos autólogos, heterólogos, y biomateriales sintéticos. Aunque éstos injertos devuelven la estabilidad y la función del tejido, todavía existen algunas limitaciones. La bioingeniería ósea utiliza la estrategia conductiva y la inductiva para la regeneración de pequeños defectos óseos. La regeneración tisular guiada (GTR) después de una cirugía periodontal, representa un acercamiento conductivo en la regeneración del hueso. Las BMPs, proteínas relacionadas, y los genes que codifican para estas proteínas permiten que se utilicen estrategias inductivas en situaciones donde GTR no es suficiente. En contraste, la estrategia de trasplante celular ofrece la posibilidad de pre-formar grandes estructuras de hueso (e.j., mandíbulas completas). Éstas estructuras pueden incluso ser desarrolladas totalmente en laboratorios antes de ser utilizadas. Para que la ingeniería de tejidos sea una realidad en la obtención de nuevo hueso con sus características morfológicas y funcionales, será necesario conocer todos los mecanismos involucrados normalmente en su formación normal (células, matriz extracelular, factores biológicos endógenos y exógenos). Recientemente se ha utilizado rhbmp-2 (Proteína morfogenética ósea recombinante junto con células mesenquimatosas provenientes de médula ósea del ratón embebidas en B-tricalcio fosfato(mcs/b-tcp), en la colocación de implantes quirúrgicos y se ha demostrado la neoformación ósea. Esta investigación propone también la distracción ósea como una herramienta eficaz en la producción de tejidos duros por bioingeniería, ya que la estimulación mecánica genera señales de inducción que generan la formación de nuevo hueso. Regeneración de parte de una mandíbula Las malformaciones en la mandíbula de más de cinco centímetros se tratan habitualmente con un autotrasplante de tejido y hueso del propio paciente. La técnica está implantada en numerosos hospitales de todo el mundo pero tiene un efecto secundario que limita de forma significativa su eficacia: la obtención del implante produce una nueva lesión en el esqueleto del afectado que reduce su calidad de vida. Para curar una herida hay que producir otra. En lugar de obtener una muestra de tejido del paciente a partir de la cual obtener el implante, los investigadores escanearon la estructura ósea del afectado mediante tomografía computerizada en tres dimensiones. Con el apoyo de distintas herramientas informáticas, determinaron las dimensiones exactas que debía tener una estructura adaptada a la mandíbula. Los datos recopilados se utilizaron para fabricar una malla de titanio que se rellenó con bloques de hueso, siete mg de una proteína recombinante humana (BMP7) utilizada para estimular el crecimiento óseo y 20 ml de médula ósea del propio afectado, formada por células pluripotenciales, es decir, capaces de convertirse en cualquier tejido si son dirigidas de forma adecuada. En una primera fase la estructura se implantó bajo la axila derecha, en el músculo latísimo del dorso. El propio cuerpo del paciente, de 56 años, se utilizó para incubar y sintetizar una prótesis que reemplazara su mandíbula deteriorada(1). Siete semanas después, se extrajo el implante y se colocó en el lugar para el que había sido diseñado, en sustitución del hueso dañado por el tratamiento contra un tumor. A las cuatro semanas [de la intervención] el paciente disfrutó de su primera cena en nueve años (pan y salchichas). Antes de la reconstrucción sólo era capaz de comer alimentos blandos y sopa. Ésta es la primera evidencia de que la vía de regeneración de tejidos propuesta es eficaz, aunque tendrá que confirmarse en estudios diseñados para ello. Entre tanto, mientras el debate continúa, un paciente que previamente había perdido la mandíbula durante el proceso de destrucción de un tumor ahora puede sentarse y masticar su primera comida sólida en nueve años, corte- 5 Foros de Patología de la URJC

6 Regeneración de un cóndilo mandibular Aunque por ahora sólo se ha probado en animales, este procedimiento de ingeniería tisular para crear cóndilos podría llegar a emplearse para regenerar las estructuras esféricas no sólo de la mandíbula sino también de la rodilla y la cadera, perdidas por lesiones o por enfermedades como la artritis. Figura 1. sía de un nuevo implante que le ha mejorado su calidad de vida. Ingeniería de cartílago La destrucción del cartílago es común en muchas enfermedades y después de un trauma. El diseño de templetes de polímeros con propiedades mecánicas y de degradación ha permitido a la bioingeniería diseñar tejidos cartilaginosos en modelos animales con tamaños y formas definidas (septum nasal y orejas) que potencialmente podrían ser usadas en la reconstrucción craneofacial. Los investigadores han tenido la idea de construir estructuras sintéticas y biodegradables que funcionen como esqueletos en donde las células crecen conformando un tejido. Comercialmente ya está disponible una nueva clase de biomateriales llamados ADMAT (animal derived extracellular matriz) diseñados en forma de prótesis o templetes que movilizan las células propias del organismo y las inducen a reconstruir el tejido reemplazando gradualmente la prótesis. Este proyecto de bioingeniería pretende cambiar el reemplazo artificial de órganos por la regeneración natural de los mismos. Actualmente se están probando clínicamente en humanos las prótesis periodontales. Esta tecnología puede ser aplicada en muchas formas para problemas médicos y dentales (tejidos periodontales, tejido de articulación temporomandibular, hueso). Empleando células madre adultas mesenquimales extraídas de la médula ósea de ratas y valiéndose de sustancias químicas y factores de crecimiento, investigadores indujeron la diferenciación de las células madre en otras capaces de generar cartílago y hueso. Las células fueron separadas en dos capas integradas y encapsuladas en un material biocompatible con textura de gel. Posteriormente fueron moldeadas en forma de cóndilo articular por medio de un molde realizado a partir de la articulación temporomandibular de un cadáver humano. Transcurridas varias semanas, el equipo encontró que las estructuras creadas mantenían la forma del cóndilo mandibular con su tejido interior de tipo óseo y su capa de tejido cartilaginoso en la superficie. Además, varios análisis confirmaron que los nuevos tejidos generados eran en realidad hueso y cartílago, y así presentaban las características que les son propias al ser observados microscópicamente: para el hueso, una matriz de colágeno con depósitos de sales cálcicas y, para el cartílago, colágeno y grandes cantidades de proteoglicanos. Los investigadores insisten en la necesidad de efectuar otros estudios antes de que estos cóndilos desarrollados por ingeniería genética puedan ser empleados terapéuticamente en la clínica. Sin embargo, consideran que con futuras mejoras el proceso podría llegar a ser utilizado en artroplastias totales de cadera y rodilla. "Estos hallazgos representan una evidencia para el futuro desarrollo de cóndilos por ingeniería genética". Ingeniería de Piel y mucosa oral La aplicación más eficaz en la ingeniería de tejidos hasta ahora ha sido el desarrollo de tejidos muy parecidos a la piel. El tejido de la piel es necesario en los tratamientos estéticos de pacientes que han sido severamente 6 Foros de Patología de la URJC

7 desfigurados por quemaduras, en tratamientos radicales de recesiones de cáncer, o en el tratamiento de cicatrices por heridas de bala o cuchillos. Se están cultivando y desarrollando piel en laboratorio tanto con componentes dermicos como epidérmicos, utilizando una combinación de células varios polímeros como medio de transporte. Una aproximación similar se ha desarrollado en el reemplazo de mucosa oral, aunque este procedimiento aun no ha sido definitivo. La ingeniería y trasplantación de mucosa oral y encía son de gran importancia en los injertos periodontales y en los tratamientos de recesiones gingivales. Actualmente las técnicas de ingeniería tisular ofrecen matrices biológicas o aloplásticas reabsorbibles solas o sembradas con células vivas para la reconstrucción tridimensional de los tejidos afectados. Los sustitutos de mucosa oral desarrollados hasta el momento incluyen sustitutos basados en monocapas (tomadas de queratinocitos de mucosa oral o de tejido epitelial o de piel humana cadavérica), sustitutos bicapa (constituidos por una capa de tejido conectivo equivalente a la matriz extracelular y otra capa semejante al epitelio), Co-cultivos organotípicos (capa análoga a la dermis sembrada primero con fibroblastos y después con queratinocitos y expuestas en cámaras de cultivo organotípicas) y Co-cultivo de queratinocitos sobre AlloDerm (queratinocitos cultivados sobre dermis humana cadavérica acelular no inmunogénica). Hasta el momento estos tejidos han sido utilizados en la reconstrucción secundaria de estructuras orales perdidas por tumores, en injertos realizados a pacientes con labio y paladar fisurado y en reconstrucción de tejidos periodontales perdidos por trauma o por enfermedad periodontal. Ingeniería de dentina y pulpa dental La producción de dentina y pulpa dental han sido desarrolladas en modelo animal y en estudios in vitro utilizando las estrategias de ingeniería. El gran potencial de uso de esta ingeniería de tejidos se encuentra en la sustitución de material dentario perdido. La caries es una las enfermedades mas prevalentes en los adultos jóvenes y en los adolescentes, pero hoy en día existen diferentes formas de reestablecer la dentina perdida. Una de las estrategias es inducir la formación de nuevas células provenientes de la pulpa dental utilizando BMPs. La ingeniería de tejido pulpar también puede ser posible utilizando fibroblastos cultivados y el uso de matrices sintéticas poliméricas. Ya se ha demostrado la producción de pulpa artificialmente creada con moléculas bioactivas y agentes inductores condrogénicos en canales radiculares de molares superiores extraídos. Este hallazgo ofrece cambios espectaculares en los tratamientos endodónticos. Regeneración de la pulpa y la dentina en endodoncia La regeneración del complejo pulpo-dentinario sin la eliminación de toda la pulpa: Los tres ingredientes clave de la ingeniería tisular son las señales para la morfogénesis, las células madre para responder a los morfógenos y el soporte o matriz extracelular. En estudios preclínicos se ha desarrollado un método consistente en liberar factores de crecimiento, citocinas o morfógenos con células madre / progenitoras en un soporte en las zonas de lesión tisular para acelerar y/o inducir una regeneración biológica natural. El tejido pulpar contiene células madre / progenitoras que tienen el potencial de diferenciarse en odontoblastos en respuesta a proteínas morfogenéticas óseas (BMPs). Hay dos estrategias para regenerar la dentina. La primera es el tratamiento in vivo, en que las proteínas BPM o los genes BMP se aplican directamente a la pulpa expuesta o amputada. La segunda es el tratamiento ex vivo y consiste en el aislamiento de células madre / progenitoras del tejido pulpar, la diferenciación en odontoblastos con genes BMP recombinantes o BMP y finalmente el trasplante autólogo para regenerar la dentina. Esta revisión está enfocada al progreso reciente en este área y discuta las barreras y los retos para la utilidad clínica en endodoncia. También se ha observado el papel de los odontoblastos en la formación de dentina en los gérmenes dentales y en los dientes adultos. Las proteínas morfogenéticas óseas (BMP), inducen la formación de cartílago y de hueso cuando son implantadas en tejido muscular, y están presentes en la matriz dentinal. La relación entre la diferenciación de odontoblastos y BMP es observada por medio de tinciones de inmunohistoquimica con anticuerpos monoclonales (Mab) contra BMP en cultivos celulares de tejido pulpar dental. Las BMP se expresan 7 Foros de Patología de la URJC

8 en odontoblastos, ameloblastos y matriz dentinal. La incorporación de BMP al cultivo de tejido pulpar dental promueve la diferenciación de células mesenquimatosas en células similares a odontoblastos, incrementa la actividad de la fosfatasa alcalina, e induce la formación de osteodentina y de dentina tubular. Estos hallazgos sugieren que las BMPs juegan un rol importante en la diferenciación de odontoblastos. La pulpa dental tiene la capacidad de generar dentina en respuesta a estímulos nocivos, como la caries. La pulpa dental contiene stem cells progenitoras, que pueden proliferar y diferenciarse en odontoblastos formadores de dentina. Los odontoblastos dañados pueden ser reemplazados por nuevas poblaciones de odontoblastos derivados de stem cells de pulpa. Se han aislado células pulpares de porcinos, y se ha observado la expresión de sialoproteina dentinal (Dspp) y de la metaloproteinasa 20 del esmalte (MMP20). Las células pulpares se diferencian en odontoblastos y son estimuladas por señales morfogenéticas, proteína morfogenética ósea 2 (BMP2). Basandose en este hallazgo in vitro, se diseñó un experimento en perros, en el cual se realizó un transplante autógeno del cultivo de stem cells tratado con BMP2 sobre la pulpa amputada. Se observó que las BMP2 pueden diferenciar directamente las stem cells pulpares en odontoblastos formadores de dentina. Regeneración funcional de un diente en un cerdo. Las células madre (DPSCs, PDLSCs) han regenerado dentina, pulpa y tejido periodontal en ratones inmunodeprimidos, sin embargo en el tejido dental humano no se ha llevado a cavo por la complejidad del mismo. Aunque los tratamientos con implantes dentales han resultado exitosos a largo plazo para la recuperación de la función del diente requieren determinada calidad ósea y estructuras validas para anclarlos. La regeneración radicular mediada por células madre puede suponer la oportunidad de regenerar una bioraiz y sus tejidos periodontales asociados. El propósito de este estudio es explorar el potencial reconstructivo de los dientes en cerdos. En él, el complejo de raices periodontales es creado por las células madre postnatales incluyendo células madre de la papila apical de la raíz (SCAP) y PDLSCs a las que se acoplará una corona de porcelana artificial. Este híbrido supone una estrategia que puede ser aplicable a la regeneración del tejido dental humano. Además, la restauración de dientes funcionales en la especie porcina, podría aportar información para la regeneración de tejido dental humano. La contribución de esta técnica para la formación del ápice radicular y todas sus estructuras, está por demostrar. Ha sido posible la tinción de células madre mesenquimales (moléculas de superficie STRO-1) en el tejido de las papilas radiculares de los dientes humanos, por la zona externa al ápice radicular. Esa zona, puede constituir una buena zona para reclutar células madre progenitoras. Estas células han sido cultivadas a baja densidad formando una clonación de células (CFU/F), unidad formadora de colonias de fibroblastos. Para investigar el potencial de SCAP se intentó la diferenciación de osteoclastos/osteoblastos, en el paso dos del proceso se complementaron con L-ascorbato-2- fosfato, dexametasona y fosfato inorgánico para inducir in vitro la mineralización. Después de cuatro semanas de inducción se formaron nódulos que pudieron verse con la tinción "alizarín red", lo que indicó una acumulación del calcio en la muestra. Además las SCAP son capaces de diferenciarse a otro tipo de células como adipocitos. Para comprovar la capacidad de diferenciación de las SCAP en tejidos dentarios funcionales fue trasladado a ratones inmunodeprimidos con fosfdato de hidroxiapatita, y fosfato tricálcico (HA/TCP) como mensajero. Parte de la estructura de la dentina se regeneró por la acción de la HA/TCP junto con el tejido conectivo. La dentina resultante tenía anticuerpos para las toxinas DSP, también formando células con anticuerpos mitocondriales, tal como si la hubiera formado el propio animal. Se han recogido células SCAP y DPSCs procedentes de un diente humano y se pudo comprobar que se comportaba de igual manera. Según un perfil de ADN cíclico hay muchos genes expresados diferencialmente entre estas dos poblaciones de células madre. Entre estos genes se seleccionaron los supervivientes para que sirvieran de ejemplo y confirmaron su expresión mas alta en SCAP. Se identificó el CD24 como un marcador de superficie específico para las SCAP. Durante la diferenciación odontogénica in vitro SCAP perdió la expresión de CD24 con un máximo regulador de la fosfatasa alcalina. Además, SCAP mostró un aumento significativo 8 Foros de Patología de la URJC

9 de la tasa de absorción de bromodeoxyuridina (BrdU) y el mayor numero de población duplicada. La población de SCAP demostró una elevada capacidad de regeneración tisular, aumentó tanto la actividad de la telomerasa como la DPSCs del mismo diente y mejoró la capacidad de migración de las células (2). En conjunto estos estudios demuestran que las SCAP eran la única población de células madre postnatales distintas de las DPSCs. interior del bloque HA/TCP. Después de la apertura de la sutura quirúrgica, la corona de porcelana se mantiene in situ y es sometida a las distintas funciones de un diente biológico. CT y los análisis histológicos, confirmaron que la estructura raiz-periodonto fue regenerada. Además, las nuevas biorraices formadas, han demostrado una significativa capacidad de aguantar las compresiones como los originales HA/TCP mensajeros, tras seis meses de implantación. Regeneración funcional del diente: la identificación de las SCAP constituye una oportunidad para intentar conseguir la regeneración radicular usando células postnatales jóvenes de gran calidad provenientes de adultos entre años. Para desempeñar un papel funcional válido, la raíz debe conectar con el ligamento periodontal para garantizar la estabilidad y la correcta posición de apoyo sobre el tejido. Por lo tanto, se han utilizado SCAP humanas y PDLSCs para generar dentina y PDL en un HA/TCP mensajero, con el fin de imitar la raíz periodontal bio-fisiológica in vivo. Figura 2. Estos hallazgos, sugieren la posibilidad de utilizar una combinación de SCAP/PDLSCs autóloga conjuntamente con coronas dentales artificiales para la regeneración de dientes funcionales. Ocho semanas después del trasplante las PDLCSs humanas fueron capaces de formar cemento en la superficie de HA/TCP mensajero además de las fibras de Sharpey, que se caracterizan histológicamente a las fibras de colágeno ancladas en el cemento. Estos datos, sugieren que el uso combinado de las poblaciones de células madre mesenquimales sirven de base para la regeneración de la raíz y tejido periodontal. Para lograr la regeneración funcional de dientes, se utilizó la especie porcina, debido a las semejanzas con la organización de tejidos humanos orofaciales. Las SCAP porcinas se cargaron en una raíz con forma de HA/TCP que permite la posterior instalación de una corona de porcelana. Un incisivo inferior fue extraído, y la extracción fue lavaba para retirar restos periodontales. El bloque de HA/TCP que contenía las SCAP fue recubierto con gelfoam que contiene PDLSCs y se insertó en la oquedad dejada por el incisivo inferior y posteriormente se suturó permaneciendo así durante un período de tiempo de 3 meses. La estructura se volvió a abrir quirúrgicamente a los 3 meses después de la implantación y un módulo de corona de porcelana en miniatura prefabricado parecido al incisivo y cementado se insertó en la posición del canal formado en el Se cree que la papila dental contribuye a la formación de dientes y finalmente se convierte en la pulpa de tejido dentro de la cámara pulpar. En este estudio se descubrió que en la papila de las raíces apicales figuran las células madre mesenquimales que parecen tener una mayor capacidad de regeneración de la dentina que las DPSCs. Estos hallazgos sugieren que el desarrollo de este tejido puede constituir un buen recurso de células madre para la regeneración de tejidos. Las SCAP representan un nuevo tipo de células madre multipotentes como demuestra su capacidad de desarrollar odontoblastos, por eso son consideradas las únicas células madre postnatales distintas de las DPSCs. El desarrollo de los tejidos derivados de las SCAP mostró un superior potencial de regeneración de tejidos que las de DPSCs. Las SCAP recogidas de un solo diente son capaces de proporcionar un gran número de células madre, probablemente suficientes para transplantes humanos debido a su alto potencial proliferativo, que se refleja en su alta actividad telomerasa. La regeneración de tejido mediada 9 Foros de Patología de la URJC

10 por SCAP puede ofrecer una prometedora terapia celular basada en la regeneración de raíz. Dado que la mayoría de los tejidos humanos en la etapa de desarrollo no están clínicamente disponibles para el aislamiento de células madre, esta población de células madre de papilas apicales no es utilizada en la práctica de la clínica dental. SCAP pueden aislarse de las extracciones de cordales. Por lo tanto, podría ser posible almacenar estas células madres dentales para un futuro uso autólogo. La regeneración de raíz mediado por célula madre con tecnología de corona clínica puede constituir un enfoque prometedor para la restauración del diente funcional debido a la disponibilidad de células madre dentales de buena calidad tanto para el transplante autólogo a largo plazo como para procedimientos clínicos de implantes dentales. Ingeniería de glándulas salivares La aplicación más excitante del transplante celular es la ingeniería de órganos completos. Esta aplicación genera la necesidad de desarrollar paralelamente una vasculatura de soporte metabólico para estos órganos. Para este propósito actualmente se están investigando dos procedimientos: el transplante de células endoteliales y la liberación de factores de crecimiento angiogénicos en los tejidos creados por ingeniería. Aunque la mayoría de trabajos de investigación en ingeniería de órganos están enfocados al desarrollo de tejidos cuya pérdida pueda ocasionar la muerte del paciente (Hígado, páncreas...) existen otras circunstancias que involucran la pérdida de tejidos donde no se produce la muerte del individuo, pero si se deteriora considerablemente su calidad de vida. A este último grupo pertenecen los pacientes que pierden el parénquima de la glándula salival y por ende la capacidad de producir saliva. Los pacientes que reciben radiación ionizante para el tratamiento del cáncer de cabeza y cuello y los pacientes con Síndrome de Sjögren sufren la pérdida del tejido secretor de la glándula salival. Sin saliva estos pacientes experimentan disfagia, caries rampante infecciones mucosas y otras molestias en la cavidad oral. Se ha iniciado un programa piloto para desarrollar una glándula salival artificial. Esta glándula consta de un tubo ciego con movimiento unidireccional para la secreción de fluido. Este fluido es generado a partir de terapia génica. En un experimento realizado en ratas, se transfirió un gen para la secreción de líquidos mediante el virus AdhAQP1. Las ratas experimentales mostraron incremento en los niveles de fluido cercanos a los niveles normales. El reemplazo de las glándulas salivares ha sido estudiado en ratones con éxito, mediante el uso de proteínas "aquaporinas" que permiten la producción de agua por parte de las células. Sin embargo el conocimiento de la cascada de eventos químicos y físicos que ocurren durante el desarrollo normal de los diferentes órganos es hoy en día muy escaso. Los templetes sintéticos o naturales para el cultivo celular que simulan la arquitectura normal y la bioquímica de la superficie de los órganos reemplazados (ej. Colágeno, fibronectina) podrían impulsar el desarrollo de técnicas para el reemplazo de órganos funcionales. La biología de las células madre mesenquimatosas ofrece enormes alternativas terapéuticas que deben seguir siendo investigadas. Es necesario entender profundamente las vías de señalización intracelular, los factores de transcripción y las secuencias de activación genética que controlan la diferenciación de células mesenquimatosas, en células bien definidas y totalmente caracterizadas. La ingeniería de tejidos combinada con el uso de stem cells y con la terapia génica permitirá, en un futuro manipular las proteínas salivales y los patrones de colonización de los microorganismos orales. Es incuestionable que esta ciencia afectará dramáticamente la odontología dentro de los próximos 25 años porque ofrece una poderosa herramienta biológica, química y física para solucionar los problemas clínicos que involucran enfermedad periodontal, caries, tumores, trauma y anomalías dentomaxilofaciales. Desarrollo de la técnica para generar dientes postizos a partir de células madre. Los investigadores de la universidad King s College de Londres recibieron casi un millón de dólares para intentar crecer dientes a partir de células madre. La compañía Odontis, establecida por la universidad, espera ampliar sus investigaciones para realizar pruebas en humanos en dos años, ya de que los experimentos con ratones han tenido éxito: 10 Foros de Patología de la URJC

11 costo de los dientes nuevos no sería mayor al de los implantes sintéticos DISCUSIÓN Una vez conseguido el objetivo de hacer erupcionar un diente, cabría preguntarse como conseguir que este sea el deseado puesto que de entre las 32 morfologías posibles solo una sería la adecuada. Figura 3. Incisivo erupcionado en el maxilar de un ratón adulto tras la implantación de un germen dentario El material, denominado Biotooth consiste en tejido biológico implantable a partir de células madres de cada paciente. Éstas células se tratarían en el laboratorio, diferenciándolas en las células pluripontenciales que dan lugar a todos los tejidos de la pieza dental. En cuanto a la posible viabilidad del nuevo diente influiría negativamente el hecho de que este procediera de células epiteliales de un adulto (con las consiguientes divisiones en su ciclo vital), en vez de las tan controvertidas células embrionarias? Puede que en un futuro se creen bancos de células pluripotenciales con este fin, lo que nos plantea otra incógnita: podrían estas células proceder de individuos de la misma especie realizándose así transplantes antólogos?, y en ese caso sería viable el aprovechamiento de las SCAP contenidas en los cordales de donantes en clínica o por el contrario sería necesario que dichas células proviniesen del mismo paciente? Podrá en un futuro esta nueva terapia genética sustituir a las actuales prótesis artificiales? CONCLUSIONES: Figura 4. Las células madre serán programadas para diferenciarse en dientes que luego se transplantarán al maxilar del paciente donde tenga un espacio. Se estima que harán falta de dos a tres meses para que el nuevo diente se desarrolle completamente. Sin embargo, faltan unos cinco/siete años antes de que la tecnología esté a disposición del público en general. Los dientes vivos son mejores para la salud que los sintéticos puesto que un diente vivo puede conservar la salud de los tejidos aledaños mucho mejor que una prótesis artificial los dientes están vivos, y pueden responder a la mordedura de una persona, se mueven y, al hacerlo, mantienen la salud de las encías y los otros dientes. El Habida cuenta de todas las tendencias de investigación en curso, solo queda esperar que tanto la odontología como la prótesis dental, y muy especialmente esta última, sepan adaptarse a los dramáticos cambios que sus especialidades puedan sufrir. No cabe duda de que nuestro gremio deberá tener muy en cuenta estos grandes avances, puesto que suponen una nueva concepción en la manera de aplicar los tratamientos odontológicos. REFERENCIAS 1. Chai Y, Slavkin Hc. Prospects for tooth regeneration in the 21st century: a perspective. Microsc Res Tech 2003 Apr 1;60(5): Young CS et al. Tissue-engineered hybrid tooth and bone. Tissue Eng 2005 Sep-Oct;11(9-10): Thesleff I. Developmental biology and building a tooth. Quintessence Int Sep;34 (8) : Foros de Patología de la URJC

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