Revista Mexicana de Fitopatología ISSN: Sociedad Mexicana de Fitopatología, A.C. México

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1 Revista Mexicana de Fitopatología ISSN: Sociedad Mexicana de Fitopatología, A.C. México Gutiérrez Alonso, Omar; Nieto Ángel, Daniel; Gutiérrez Alonso, Juan Gabriel; Delgadillo Sánchez, Felipe; Domínguez Álvarez, José Luis Características Morfológicas, Culturales y Patogenicidad de Aislamientos de Colletotrichum spp. obtenidos de Frutos de Guayaba (Psidium guajava L.) Revista Mexicana de Fitopatología, vol. 20, núm. 1, enero-junio, 2002, pp Sociedad Mexicana de Fitopatología, A.C. Texcoco, México Disponible en: Cómo citar el artículo Número completo Más información del artículo Página de la revista en redalyc.org Sistema de Información Científica Red de Revistas Científicas de América Latina, el Caribe, España y Portugal Proyecto académico sin fines de lucro, desarrollado bajo la iniciativa de acceso abierto

2 24 / Volumen 20, Número 1, 2002 Características Morfológicas, Culturales y Patogenicidad de Aislamientos de Colletotrichum spp. Obtenidos de Frutos de Guayaba (Psidium guajava L.) Omar Gutiérrez-Alonso, Daniel Nieto-Ángel, Juan Gabriel Gutiérrez-Alonso, Colegio de Postgraduados, Instituto de Fitosanidad, km 35.5 Carr. México-Texcoco, Montecillo, Edo. de México CP 56230; Felipe Delgadillo-Sánchez, INIFAP, Campo experimental Bajío, km 6 Carr. Celaya-San Miguel de Allende, Apdo. Postal 112, Celaya, Guanajuato CP 38000; y José Luis Domínguez-Álvarez, Universidad Autónoma Chapingo, Depto. de Fitotecnia, km 38.5 Carr. México-Texcoco, Chapingo, Edo. de México CP (Recibido: Diciembre 5, 2001 Aceptado: Enero 28, 2002) Resumen. Gutiérrez-Alonso, O., Nieto-Ángel, D., Gutiérrez-Alonso, J.G., Delgadillo-Sánchez, F. y Domínguez-Álvarez, J.L Características morfológicas, culturales y patogenicidad de aislamientos de Colletotrichum spp. obtenidos de frutos de guayaba (Psidium guajava L.). Revista Mexicana de Fitopatología 20: Se aislaron cepas de Colletotrichum spp. de frutos de guayaba, almacenados durante 12 días en condiciones ambientales con síntomas de antracnosis, provenientes de Michoacán, México, para comparar características morfológicas de conidios, crecimiento a 12, 20, 28 y 36 C, presencia o ausencia de setas, formación de la fase sexual del hongo, y determinar su relación con el síntoma de antracnosis en guayaba. Los aislamientos correspondieron a Colletotrichum gloeosporioides y presentaron variabilidad en sus características morfológicas, culturales y patogenicidad. Los análisis univariado y multivariado indicaron la existencia de grupos diferentes de C. gloeosporioides, con base en la longitud del conidio y diámetro de la colonia del hongo desarrollado a 20 C. Estos resultados indicaron que posiblemente existe variabilidad genética entre aislamientos de C. gloeosporioides obtenidos de guayaba. Palabras clave adicionales: Colletotrichum gloeosporioides, antracnosis, etiología, variabilidad genética. Abstract. Strains of Colletotrichum spp. from guava fruits with symptoms of antracnosis and stored during 12 days at room temperature collected from Michoacan, Mexico, were isolated and used to compare their morphological characteristics of conidia, growth at 12, 20, 28 and 36 C, setae production, production of the ascigerous state and to determine their relationship with antracnosis symptom in guava fruits. All isolations corresponded to Colletotrichum gloeosporioides and they manifested variability in their morphological, cultural and pathological characteristics. The analysis univariate and multivariate indicated the existence of different groups of C. gloeosporioides based on both conidia length and colony diameter at 20 C. This suggests genetic variability among isolations of C. gloeosporioides obtained from guava fruits. Additional keywords: Colletotrichum gloeosporioides, antracnosis, etiology, genetic variability. Las especies de Colletotrichum afectan a un rango amplio de especies vegetales y causan enfermedades tanto en precosecha como en postcosecha. Las pérdidas postcosecha ocasionadas por este patógeno se presentan principalmente en los trópicos, y es el factor principal que limita la exportación de frutos debido al deterioro de su calidad (Derbyshire y Shipway, 1978). Colletotrichum spp. se ha aislado en una gran diversidad de condiciones ambientales y se ha reconocido como el agente causal de la enfermedad comúnmente llamada antracnosis, la cual afecta frutos, flores, tallos y hojas en un rango amplio de cultivos (Jeffries et al., 1990). La antracnosis, causada por C. gloeosporioides Penz, es una de las principales enfermedades postcosecha en varios cultivos tropicales (Mordue, 1971). En Filipinas se ha reportado a Glomerella psidii (Del.) Sheld. como el agente causal de la antracnosis en guayaba (Ocfemani, 1930), en la India Srivastava y Tandon (1969) mencionaron que esta enfermedad es causada por Gloesporium psidii Delacr.; Smowdon (1990) reportó a Glomerella cingulata, mientras que en Filipinas Quimo y Quimo (1975), reportaron a C. gloeosporioides como el agente causal de la antracnosis en guayaba basándose en características morfológicas y rango de hospedantes. No obstante, existe confusión respecto al agente causal, debido principalmente a que en la mayoría de los reportes no se presentan las características morfológicas, culturales y patológicas del agente causal de la enfermedad. Los objetivos

3 Revista Mexicana de FITOPATOLOGIA/ 25 de esta investigación fueron caracterizar aislamientos de Colletotrichum spp. obtenidos de guayaba, y determinar su relación con el síntoma de antracnosis con base en pruebas de patogenicidad. MATERIALES Y MÉTODOS Los aislamientos de Colletotrichum spp. se obtuvieron de frutos de guayaba con síntomas de antracnosis, los cuales se colectaron en madurez fisiológica de un huerto comercial en Zitácuaro, Michoacán, y se almacenaron en condiciones ambientales durante 12 días. Se seleccionaron seis aislamientos con base en el patrón de crecimiento y color de la colonia en medio sólido papa-dextrosa-agar (PDA). La purificación de los aislamientos se realizó mediante cultivos monoconidiales en PDA. Formación de la fase sexual. De cada uno de los aislamientos se tomaron discos de 5 mm de diámetro del medio de cultivo con micelio del hongo, se colocaron en cajas petri con los medios de cultivo siguientes: PDA, harina de maíz agar, agar nutritivo, Czapeck-Dox ph 7.2, hojuelas de avena agar, harina de avena agar ph 7.0 y extracto de malta peptona agar ph 5.6, incubándose a 24 ± 1 C y luz fluorescente continua durante tres semanas, al término del cual se evaluó la presencia o ausencia de peritecios. De cada aislamiento se colocaron seis repeticiones para cada medio de cultivo. Características de conidios. De cada uno de los aislamientos cultivados en harina de maíz agar durante 7-10 días a 24 ± 1 C y luz fluorescente continua, se preparó una suspensión de conidios (1 x 10 5 conidios/ml) y se depositó 0.1 ml sobre un portaobjeto, se colocó un cubreobjeto y se selló con barniz transparente. De cada aislamiento se midió la longitud y ancho de 100 conidios seleccionados al azar. La forma del conidio se determinó con base en la clave para la identificación de especies de Colletotrichum en semillas (Kulshrestha et al., 1976). Presencia de setas. Se determinó a través de la observación en microscopio óptico, de cada uno de los aislamientos cultivados en los diferentes medios de cultivos para la formación de la fase sexual. La inspección se inició a partir de los siete días de edad de los cultivos y concluyó a los 17. Efecto de la temperatura en el crecimiento micelial. De cada aislamiento se tomaron discos de 5 mm de diámetro conteniendo medio de cultivo y micelio del hongo, se colocaron en cajas petri con PDA y se incubaron a 12, 20, 28 y 36 C en oscuridad durante cinco días. De cada aislamiento se colocaron cinco cajas para cada temperatura. Al concluir el período de incubación se determinó el diámetro de la colonia. Prueba de patogenicidad. Las pruebas de patogenicidad se realizaron sobre frutos de guayaba en estado de madurez fisiológica; los frutos se desinfestaron con hipoclorito de sodio al 2% durante dos minutos, se dejaron secar y se les hizo una herida de 5 mm de profundidad con aguja de disección estéril. Previamente se preparó una suspensión de conidios en agua destilada estéril (1 x 10 5 conidios/ml) de cada uno de los aislamientos, la cual se asperjó sobre la herida de los frutos. De cada aislamiento se inocularon 50 frutos de guayaba, considerándose cada fruto como una repetición. Los frutos inoculados se mantuvieron en cámara húmeda a temperatura ambiente (24 ± 2 C) durante 15 días. Al concluir este periodo, se evaluó la presencia de síntomas y se compararon con los síntomas iniciales del los cuales se realizaron los aislamientos. Los resultados de la medición de conidios y el diámetro de las colonias en diferentes temperaturas se sometieron a ANOVA y comparación de medias con la prueba de Tukey (p = 0.05); los mismos datos se sometieron a un análisis discriminante en SAS. RESULTADOS Formación de la fase sexual. Después de tres semanas de crecimiento, no se observó la formación de peritecios que caracterizan al estado perfecto (Glomerella cingulata) de algunas especies de Colletotrichum en los medios de cultivo empleados. Características del conidio. Los aislamientos de Colletotrichum spp. mostraron diferencias estadísticas significativas (p = 0.05) en la longitud y ancho de conidios (Cuadro 1). El aislamiento Co-2 presentó la mayor longitud (14.39 ± 0.12 µm) seguido del Co-1 (11.89 ± 0.08 µm); ambos mostraron un ancho similar, pero menor (4.55 ± 0.04 y 4.51 ± 0.02 µm, respectivamente) con respecto a los aislamiento Co-3 (4.70 ± 0.03 µm), Co-5 (4.76 ± 0.03 µm) y Co-7 (4.74 ± 0.03 µm); sin embargo, estos últimos presentaron la menor longitud de conidio (11.46 ± 0.07, ± 0.07 y ± 0.10 µm, respectivamente) junto con el aislamiento Co-6 (11.31 ± 0.07 µm). Las observaciones de la forma de los conidios se realizo en el medio de cultivo harina de maíz agar, debido a que en éste, la apariencia de los conidios se mantuvo estable y homogénea. Los resultados indicaron que los conidios de los seis aislamientos de Colletrichum spp. presentaron forma recta cilíndrica con los extremos redondeados (Fig. 1). Presencia de setas. No se observó la presencia de setas en los aislamientos que se cultivaron in vitro en PDA, ni en los diferentes medios empleados para la obtención de la fase sexual (harina de maíz agar, agar nutritivo, Czapeck-Dox, hojuelas de avena agar, harina de avena agar y extracto de malta peptona agar) (Cuadro 1). Efecto de la temperatura en el crecimiento micelial. Los aislamientos de Colletotrichum spp. mostraron variación en el diámetro de la colonia por efecto de la temperatura; a 36 C ningún aislamiento mostró crecimiento (Cuadro 1, Fig. 2). Cuando los aislamientos se incubaron a 12 C, el crecimiento de las colonias fue escaso; su crecimiento óptimo fue entre 20 y 28 C. La prueba de comparación de medias del diámetro de las colonias indicó que la temperatura de 20 C indujo una marcada diferencia entre los aislamientos evaluados (Cuadro 1), los cuales fueron claramente separados en tres grupos: uno de crecimiento rápido con 60 mm de diámetro (Co-1), otro de crecimiento lento con 42 mm (Co-2) y un grupo de

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6 28 / Volumen 20, Número 1, 2002 Cuadro 2. Coeficientes canónicos estandarizados de las variables longitud y ancho de conidio, y diámetro de colonia a 12, 20, 28 y 36 C para tres funciones discriminantes (FD). Funciones discriminantes Variables FD1 FD2 FD3 Longitud de conidio Ancho de conidio Diámetro de colonia a 12 C Diámetro de colonia a 20 C Diámetro de colonia a 28 C Diámetro de colonia a 36 C Valor propio Porcentaje de variabilidad explicada de guayaba, correspondieron a C. gloeosporioides (Kulshrestha et al., 1976). A pesar que existió variación en el tamaño de los conidios de los aislamientos crecidos en medio de cultivo harina de maíz agar, éstos fueron menos largos que los de C. gloeosporioides obtenidos de fresa y cultivados en PDA y harina de avena agar (Smith y Black, 1990), o en hoja de fresa agar (Gunnell y Gubler, 1992), excepto en el aislamiento Co-2, que presentó un tamaño similar a los aislamientos en fresa; no obstante, el tamaño del conidio se ubicó dentro del rango de C. gloeosporioides (Kulshrestha et al., 1975; Sutton, 1980). Aunque el género Colletotrichum tiene la capacidad de producir setas, los aislamientos obtenidos de guayaba no las formaron, lo cual coincidió con lo reportado por Smith y Black (1990) con C. gloeosporioides aislado de fresa y en cítricos (Denoyes y Baudry, 1995), debido a que el acérvulo de esta especie puede ser setoso o glabro (Mordue, 1971), lo cual depende de condiciones ambientales (Frost, 1964). A pesar que los aislamientos obtenidos de guayaba correspondieron a C. gloeosporioides, éstos manifestaron diferencias estadísticas significativas (p = 0.05) en el diámetro de la colonia a 20 C, lo que facilitó separarlos en grupos diferentes; lo anterior contrastó con lo reportado por Smith y Black (1990), ya que ellos no encontraron diferencias significativas en el crecimiento de la colonia entre cepas de una misma especie de Colletotrichum, sin embargo, lograron separar a C. acutatum de C. gloeosporioides y C. fragariae a 28 C (Denoyes y Baudry, 1995), temperatura en la cual obtuvieron el crecimiento máximo de las cepas estudiadas; en tanto que todos los aislamientos de C. gloeosporioides obtenidos de guayaba presentaron el mayor crecimiento de colonia a 20 C. Los resultados también indicaron que las cepas obtenidas de guayaba son sensibles a temperaturas elevadas, debido a que no mostraron crecimiento de micelio cuando se incubaron a 36 C; resultados similares reportaron Agostini y colaboradores (1992), con algunas cepas de C. gloeosporioides aisladas de cítricos que presentaron un crecimiento escaso o nulo a 34 C; en tanto que aislamientos de C. gloeosporioides, C. fragariae y C. acutatum obtenidos de fresa manifestaron un crecimiento ligero a 36 C (Simith y Black, 1990). Unicamente los aislamientos Co-1, Co-2 y Co- 3, inoculados a frutos de guayaba, indujeron síntomas de antracnosis similares a los causados por C. gloeosporioides en esta misma especie en Filipinas (Quimo y Quimo, 1975). Tanto el análisis estadístico univariado como el multivariado indicaron diferencias entre los aislamientos de C. gloeosporioides obtenidos de guayaba, lo cual indicó posibles diferencias genéticas. Los aislamientos se separaron en tres Cuadro 3. Distancias cuadradas de Mahalanobis entre aislamientos de Colletotrichum gloeosporioides obtenidos de frutos de guayaba (Psidium guajava L.). Aislamiento Co-1 Co-2 Co-3 Co-5 Co-6 Co-7 Co ** ** ** ** ** Co ** ** ** ** Co ** 37.38** 27.81** Co NS 7.58NS Co NS Co-7 0 z NS, ** =No significativo y significativo a una P = 0.01, respectivamente.

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8 30 / Volumen 20, Número 1, 2002 Smith, J.B. and Black, L.L Morphological, cultural and pathogenic variation among Colletotrichum species isolated from strawberry. Plant Disease 74: Smowdon, A.L A color atlas of post-harvest diseases and disorders of fruits and vegetables. Vol. 1. General introduction and fruits. CRCPRES Inc. Florida, USA. pp Srivastava, M.P. and Tandon, R.N Postharvest diseases of guava in India. Plant Disease Reporter 53: Sutton, B.C The Coelomycetes. Commonwealth Mycological Institute, Kew, Surrey, England. 696 p. TeBeest, D.O., Shilling, C.W., Hopkins-Riley, L. and Weidmann, G.J The number of nuclei in spores of three species of Colletotrichum. Mycologia 81: Tiffany, L.H. and Gilman, J.L Species of Colletotrichum from legumes. Mycologia 46:52-75.