CONTROL BIOLÓGICO DE LA VERTICILOSIS EN PLANTONES DE OLIVO MEDIANTE AISLADOS DE PSEUDOMONAS SPP.

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1 OLI-09 CONTROL BIOLÓGICO DE LA VERTICILOSIS EN PLANTONES DE OLIVO MEDIANTE AISLADOS DE PSEUDOMONAS SPP. JESÚS MERCADO BLANCO 1, ELENA TEJEDOR GONZÁLEZ 1, DOLORES RODRÍGUEZ JURADO 2 Y RAFAEL M. JIMÉNEZ DÍAZ 1,3 1 Instituto de Agricultura Sostenible, CSIC, Apartado 4084, Córdoba, España. 2 CIFA Alameda del Obispo, IFAPA, Apartado 3092, Córdoba, España. 3 Escuela Técnica Superior de Ingenieros Agrónomos y de Montes, Universidad de Córdoba, Apartado 3048, 14080, Córdoba, España FORO DEL OLIVAR Y EL MEDIO AMBIENTE RESUMEN La expansión de la Verticilosis del olivo (VO) en nuevas plantaciones y diferentes zonas olivareras en Andalucía, y la dificultad en el control de la misma, obligan a desarrollar nuevas medidas de lucha que en el contexto de una estrategia de manejo integrado auspicien mejores expectativas para el control de las enfermedad. Nuestro grupo de trabajo ha estudiado el efecto de la aplicación de aislados de Pseudomonas fluorescens y P. putida obtenidos de raíces de olivo de producción viverista para fomentar la protección del plantón contra la enfermedad durante la fase de propagación. Algunas cepas de Pseudomonas mostraron actividad antagonista frente los patotipos defoliante (D) y no-defoliante (ND) de Verticillium dahliae in vitro, y de control biológico de la VO inducida por el patotipo D en bioensayos utilizando plantones de Picual de vivero en condiciones óptimas para el desarrollo de la enfermedad. Sin embargo, ambas capacidades no estuvieron necesariamente correlacionadas. Por otra parte, se ha estudiado el efecto de la aplicación combinada de dos de los aislados de Pseudomonas fluorescens (PICF4 y PICF7) más eficaces en el control de la VO, a plantones de 1 a 2 años de edad de los cvs. Cornicabra, Empeltre, Frantoio, Hojiblanca, Lechín, Manzanilla, y Picual. El tratamiento con los aislados de Pseudomonas identificados podría contribuir a mejorar la protección de los plantones de olivo contra la Verticilosis, tanto durante la producción de ellos en vivero como en la etapa juvenil del cultivo, durante la cual es más susceptible a la enfermedad. INTRODUCCIÓN La Verticilosis (VO), causada por Verticillium dahliae Kleb., es una de las enfermedades más amenazadoras del olivo en los países cultivadores de la Cuenca Mediterránea (Jiménez-Díaz y col., 1998). En España, y de forma especial en Andalucía, la expansión creciente de la VO particularmente en olivares jóvenes está generando justificada inquietud en el sector olivarero. Dicha extensión de la enfermedad puede ser debida, entre otros factores, al establecimiento de nuevas plantaciones en suelos infestados por el patógeno y/o al uso de material de plantación infectado por aquél (Thanassoulopoulos, 1993). Los aislados de V. dahliae que infectan olivo pueden ser diferenciados por la virulencia de sus ataques y ser clasificados en los patotipos defoliante [D], altamente virulento, y no defoliante [ND], de virulencia moderada, según puedan o no originar la caída generalizada de las hojas verdes de ramos infectados, respectivamente. Las infecciones más amenazadoras para el establecimiento de nuevas plantaciones de olivo son las originadas por el patotipo D, que pueden resultar letales para la planta. Por el contrario, los olivos infectados por el patotipo ND pueden superar la enfermedad y con el tiempo recuperarse de los síntomas desarrollados inicialmente en la planta (Jiménez-Díaz y col., 1998; Rodríguez-Jurado, 1993). En general, las Verticilosis son enfermedades de difícil control, a lo cual contribuyen factores tales como la capacidad del patógeno de supervivir prolongadamente en el suelo, la amplia gama de plantas susceptibles a la infección por éste, y la ineficacia de los tratamientos químicos hasta ahora explorados para combatir al hongo durante su fase parasítica en el xilema (Tjamos y Jiménez-Díaz, 1998). Como sucede con otras Verticilosis de plantas leñosas, el control eficiente de la VO requiere la aplicación de una estrategia de manejo integrado de la enfermedad (Tjamos, 1993). Desde la perspectiva moderna de una agricultura sostenible, una de las medidas de control de utilidad para el establecimiento de dicha estrategia es el uso de antagonistas microbianos con potencial como 1

2 agentes de control biológico (ACBs) de la enfermedad. Hasta ahora, sólo un pequeño grupo de especies bacterianas y fúngicas han demostrado ser antagonistas efectivos de V. dahliae; y de ellas, sólo un reducido número ha mostrado capacidad de biocontrol eficiente de la enfermedad causada por este patógeno en diferentes huéspedes (Berg y col., 1994; Fravel y col., 1986), como consecuencia de diversos mecanismos de acción incluyendo la producción de sideróforos, enzimas líticas, antibióticos o micoparasitismo, entre otros. Sin embargo, en estrategias que persiguen el uso de microorganismos como agentes de biocontrol, no es raro constatar la ausencia de correlación entre el antagonismo in vitro del ACB sobre el patógeno y actividad de biocontrol in vivo (Fravel, 1988, Hall y col., 1986; Paulitz y col., 1992). Los estudios sobre el control biológico de enfermedades vasculares en plantas leñosas son escasos, y los resultados obtenidos en ellos fueron en muchos casos inconsistentes y mostraron eficacia limitada (Hall y col., 1986; Scheffer, 1983; Utkhedes, 1984). Según nuestro conocimiento, no se dispone de información concluyente sobre la aplicación efectiva de microorganismos antagonistas para el control eficiente de la Verticilosis en olivo. En los últimos años, nuestro grupo de investigación ha realizado estudios sobre el uso de bacterias colonizadoras naturales de la rizosfera o de tejidos de raíz de olivo, como potenciales ACBs para la protección contra la Verticilosis de plantones de olivo producidos en vivero con las garantías sanitarias exigidas por la legislación (Mercado-Blanco y col., 2004), y continúa explorando su aplicación a plantas jóvenes de diferentes cultivares. CARACTERIZACIÓN DE AISLADOS BACTERIANOS PROCEDENTES DE RAÍCES DE OLIVO: PRODUCCIÓN DE METABOLITOS, ANTAGONISMO IN VITRO Y COLONIZACIÓN Y PERSISTENCIA EN RAÍCES Las investigaciones se llevaron a cabo con aislados de Pseudomonas fluorescens (denominados PICF1, PICF3, PICF4, PICF6, PICF7 y PICF8) y de P. putida (denominados PICP2 y PICP5) que se obtuvieron de raíces de plantones de olivo Picual procedentes de un vivero comercial de la provincia de Córdoba (Mercado-Blanco y col., 2004). Para efectuar los aislamientos, las raíces se lavaron profusamente, se desinfestaron superficialmente con una solución de hipoclorito sódico y fueron maceradas en mortero estéril. Posteriormente, alícuotas del macerado se distribuyeron sobre medio KB (King y col., 1954) suplementado con los antibióticos ampicilina, cicloheximida y novobiocina. Los cultivos bacterianos se incubaron a 25 C durante 48 h y de ellos se seleccionaron colonias individuales bien desarrolladas, que se mantuvieron en cultivo puro y se conservaron a -70 C. Los aislados seleccionados mostraron un perfil de ADN amplificado característico y diferenciador cuando se sometieron a ensayos de BOX-PCR (Mercado-Blanco y col., 2004). Se efectuaron diferentes bioensayos para determinar si las bacterias aisladas tienen capacidad de producir ciertos metabolitos que han sido ampliamente estudiados respecto de la actividad de bacterias de inhibir el crecimiento de los patógenos in vitro o de supresión de enfermedades de distinta etiología. Así, se investigó la producción por los diferentes aislados bacterianos de ácido salicílico (SA) y del sideróforo pseudobactina, utilizando los sobrenadantes de cultivos estacionarios de aquéllos en medio succinato (SSM) según procedimientos previamente descritos (Leeman y col., 1996; Mercado-Blanco y col., 2001). La producción de sideróforos se determinó en el medio de detección universal CAS (Schwyn y Neilands, 1987), y la de cianuros mediante el kit comercial Aquaquant Cyanid Test (Merck). En relación con la producción de metabolitos, se efectuaron experimentos de antagonismo in vitro entre Pseudomonas spp. y V. dahliae en diferentes medios sólidos de cultivo microbiológico (i.e., PDA, KB, KB + Fe 3+ ). Sobre la superficie de cada medio se depositaron microgotas de suspensiones bacterianas de los aislados de estudio, y los cultivos se incubaron durante al menos 48 h a 28 C. Posteriormente, sobre los cultivos bacterianos se distribuyeron por separado suspensiones de conidias de los aislados V138I (D) y V4I (ND) de V. dahliae. Los cultivos duales así obtenidos se incubaron adicionalmente durante 48 h a 24 C, y la actividad antagonista se determinó por la presencia de halos de inhibición del crecimiento fúngico alrededor de las colonias bacterianas. La capacidad de inhibir el crecimiento de V. dahliae en los ensayos de antagonismo in vitro varió dependiendo del aislado de Pseudomonas ensayado y del medio de cultivo utilizado. Así, los aislados de P. putida PICP2 y PICP5 inhibieron fuertemente el crecimiento de V. dahliae en PDA. Por el contrario, la inhibición inducida por los aislados de P. fluorescens fue variable, aunque siempre fue menor que la determinada por los aislados de P. putida. La actividad antagonista de los aislados bacterianos en PDA no fue influida por el patotipo de V. dahliae; siendo inhibido en igual extensión el crecimiento miceliar de los aislados V138I (D) y V4I (ND), independientemente del aislado bacteriano 2

3 ensayado. El mecanismo de inhibición del crecimiento fúngico detectado en este tipo de medio sugiere la acción de productos antibióticos. Por el contrario, los halos de inhibición que se observaron cuando se utilizó el medio KB sugieren que la actividad antagonista es mediada por la producción de compuestos de carácter sideróforo, ya que la naturaleza del medio empleado origina competencia por el ión Fe 3+. En efecto, la aparición de halos fluorescentes amarillo-verdoso alrededor de las colonias bacterianas fue indicativa de la producción de sideróforos tipo pseudobactina. La producción de otro tipo de siderofóros también se demostró mediante el uso del medio de detección universal de sideróforos CAS. Asimismo, no se produjeron halos de inhibición cuando el medio KB fue suplementado con Fe 3+, comprobándose con ello que en este caso el efecto antagonista era debido a competencia por dicho ión. La inhibición mediada por sideróforos fue mayor frente al aislado V138I comparada con la que produjo sobre el V4I. Por último, el SA, otro compuesto de carácter sideróforo, aunque débil, fue detectado en los sobrenadantes de cultivos de los aislados de P. fluorescens PICF3, PICF4 y PICF7. Finalmente, los ensayos in vitro revelaron que ciertos aislados (i.e., PICF1, PICF6, PICF8) producían una inhibición generalizada del crecimiento de las colonias fúngicas en medio KB adicionado de Fe 3+, que parece ser mediada por un compuesto volátil. Posteriormente, se determinó que dichos asilados son productores de HCN, y que genes homólogos a los genes hcnbc (que codifican para la HCN sintasa), están presentes en los genomas de dichos aislados, como revelaron los análisis de reacción en cadena de la polimerasa efectuados con iniciadores específicos (Mercado-Blanco y col., 2004; Ramette y col., 2003). A fin de investigar la colonización y persistencia de los aislados bacterianos en raíces de olivo, se procedió a la obtención de mutantes espontáneos de ellos resistentes a rifampicina (Rf). Para los experimentos de colonización se emplearon plantas de olivo Picual de 4 meses de edad proporcionados por Agromillora Catalana, SA. Los sistemas radicales limpios y desnudos de las plantas se sumergieron en suspensiones celulares de los aislados seleccionados. Posteriormente, las plantas se transplantaron a macetas que contenían suelo estéril (arena:limo, 2:1, v/v) y se mantuvieron en invernadero a 25 ± 10 C durante 3 meses. Transcurrido este tiempo, las raíces de las plantas se lavaron, secaron, desinfestaron superficialmente y maceraron, y del macerado se obtuvieron diluciones seriadas que se cultivaron en medio KB suplementado o no con Rf, durante 48 h a 25 C. El número de colonias desarrolladas sirvió para estimar las poblaciones de cada cepa bacteriana establecidas en las raíces. Los ensayos de colonización del sistema radical mostraron que todos los aislados bacterianos ensayados colonizan y persisten en raíces de olivo cv. Picual durante al menos 3 meses. Las poblaciones recuperadas de macerados de raíces difirieron según el aislado bacteriano, siendo menos abundantes las obtenidas para los aislados PICF7 y PICF8. No obstante, dichas poblaciones fueron al menos un orden de magnitud superior a las poblaciones de Pseudomonas nativas detectadas en raíces de plantas control que no fueron tratadas con las bacterias de ensayo (Mercado-Blanco y col., 2004). En experimentos más recientes, estamos estudiando si el método de introducción de aislados bacterianos en el sistema (i.e., riego reiterado del substrato con suspensiones bacterianas, o inoculación de las raíces por inmersión en éstas) determina el establecimiento de una población estable del potencial ACB en la raíz de plantones olivo. Estos experimentos se efectúan con cócteles bacterianos de los aislados PICF4 y PICF7, considerados de los más eficientes en la supresión de la VO (ver más adelante) (Tejedor González y col., 2004). En este sentido, es de destacar que la inmersión de los sistemas radicales limpios y desnudos en suspensiones de 10 9 ufc/ml de una mezcla de los dos aislados bacterianos es más eficiente que el riego repetido de las plantas con las bacterias (hasta 6 aplicaciones de 200ml por maceta de 5x10 8 ufc/ml de cada aislado durante 12 semanas). Por otra parte los resultados demuestran el desplazamiento de la población nativa de Pseudomonas sp. (al menos en raíces de Picual de 1 año de edad) por la población de PICF4 + PICF7 introducida, que pudo ser discriminada de la anterior mediante el uso de marcadores de resistencia a antibióticos y selección en medio KB suplementado con aquéllos (tetraciclina para PICF7 y rifampicina para PICF4). Este tipo de experimentos, que se lleva a cabo en plantas Picual y de otros cultivares como Cornicabra, Hojiblanca, Lechín, y Manzanilla, pretende evaluar la capacidad de persistencia de las poblaciones bacterianas introducidas y la posible influencia del genotipo de la planta en la colonización y supervivencia de aquéllas. 3

4 SUPRESIÓN DE LA VERTICILOSIS EN PLANTAS DE OLIVO MEDIADA POR PSEUDOMONAS SPP. La capacidad de biocontrol de la VO por los aislados bacterianos seleccionados se determinó mediante bioensayos con plantones Picual autoenraizados (4 meses de edad) o micropropagados (3 meses de edad) proporcionadas por Agromillora Catalana SA (Barcelona) y Cotevisa (Valencia), respectivamente. Los bioensayos se efectuaron en condiciones controladas de cámara de cultivo y en condiciones de ambiente semicontrolado de invernadero, que en todos los casos pretendían asegurar el desarrollo efectivo de la enfermedad. Las plantas se trataron con los diferentes aislados bacterianos mediante inmersión de los sistemas radicales desnudos y limpios en suspensiones de los mismos. Posteriormente, las plantas tratadas se trasplantaron a suelo que había sido infestado con una suspensión de conidias del aislado V138I (D) de V. dahliae, y las plantas se incubaron en las condiciones antes indicadas. El desarrollo de enfermedad se evaluó a intervalos semanales por la incidencia y severidad de síntomas en una escala (0-4), de acuerdo con el porcentaje de hojas y brotes afectados, siendo 0= ausencia de síntomas, 1= 1-33% de parte aérea afectada, 2= 34-66%, 3= %, y 4= planta muerta. Los datos sobre severidad de síntomas sirvieron para calcular un índice de intensidad de enfermedad (IIE), el período de incubación, el IIE final, y el área estandarizada de la curva de progreso del IIE en el tiempo. Los resultados de los bioensayos in planta mostraron que los diferentes aislados estudiados suprimen el desarrollo de la enfermedad en los dos tipos de plantones utilizados en grado variable, resultando los aislados de P. fluorescens las más eficientes, en general, en el control de la VO. Así, por ejemplo, en condiciones experimentales de invernadero y con plantas de 4 meses de edad propagadas mediante estaquillado semileñoso, el aislado PICF7 redujo el IIE final un 96%, y la incidencia final de enfermedad en un 73%, con respecto a las plantas control no bacterizadas (Mercado-Blanco y col., 2004). En condiciones ambientales reguladas en cámaras de cultivo se obtuvieron resultados similares a los anteriores, con reducciones significativas del IIE final y del área estandarizada de la curva de progreso del IIE en el tiempo en las plantas tratadas con el aislado PICF7, y de todas las variables de enfermedad en las tratadas con PICF4 respecto a sus controles no bacterizados. Además, al final de estos experimentos las plantas de olivo que habían sido tratadas con el aislado PICF7 mostraron mayores valores de parámetros de crecimiento (diámetro, peso y longitud de los tallos) comparados con los de plantas controles no tratadas con la bacteria. No obstante, este efecto sobre el crecimiento debe atribuirse a la capacidad supresora de la enfermedad más que a una estimulación del crecimiento de la planta, ya que no se observó promoción del mismo en plantas que crecieron en suelos no infestados con V. dahliae. Por el momento, quedan por ser investigados los mecanismos que puedan estar implicados en la supresión de la VO por estas bacterias. No obstante, es interesante destacar que aislados bacterianos como PICP2 o PICP5, que inhibieron fuertemente el crecimiento de aislados D y ND de V. dahliae in vitro, no resultaron los más efectivos en el control de la enfermedad. Este hecho coincide con lo referido en la literatura científica (Fravel, 1988; Paulitz y col., 1992), que resalta que el antagonismo in vitro y la capacidad como agente de biocontrol in vivo no han de estar necesariamente correlacionados. Por último, es de interés indicar que el aislado PICF7, una de los más efectivos en el control de enfermedad, fue de los menos eficientes en la colonización, posiblemente endofítica, de raíces de olivo. Un paso posterior en nuestros estudios está siendo la evaluación del tratamiento conjunto de las plantas con determinadas combinaciones de aislados bacterianos ( cócteles ), que se habían caracterizado previamente como más eficientes en el control de la VO (PICF4 y PICF7), cuando se utilizan en combinación y sobre diferentes genotipos de olivo (i.e., Cornicabra, Empeltre, Frantoio, Hojiblanca, Lechín, Manzanilla y Picual) de mayor edad (1-2 años) que en estudios anteriores. En estos experimentos estamos explorando si la aplicación de los aislados bacterianos sobre la planta previa a la inoculación con el patotipo D del patógeno (i.e., 2-3 semanas antes del transplante de la planta a suelo infestado con el patógeno) puede determinar la inducción de mecanismos defensivos en la planta. Los resultados obtenidos indican que la capacidad supresora de estas combinaciones bacterianas no puede ser evaluada adecuadamente cuando se aplican a genotipos de olivo tolerantes o resistentes a la VO. Así, los bioensayos efectuados corroboraron la tolerancia de los cvs. Empeltre y Frantoio al patotipo D de V. dahliae, que no manifestaron desarrollo de síntomas de la enfermedad en las condiciones experimentales empleadas. Respecto a los cultivares considerados como susceptibles a la Verticilosis, la introducción de los aislados bacterianos mediante inmersión del sistema radical desnudo en una suspensión de células de ellos no determinó un nivel significativo de supresión de la VO (Tabla 1). En dicha tabla se resumen los resultados de tres experimentos. Dos de éstos se llevaron a cabo simultáneamente pero en dos ambientes diferentes durante los primeros 4

5 54 días de experimento, en condiciones de ambiente semicontrolado (CS) en invernadero (Exp 1) y en ambiente regulable (condiciones controladas, CC) en cámara de cultivo (Exp 2). Debido a altas temperaturas que tuvieron lugar en invernadero, no óptimas para el desarrollo de la enfermedad, las plantas en el ambiente CS se trasladaron a una cámara de cultivo en condiciones reguladas (25ºC, 60 % de HR y fotoperíodo de 14h/día de luz blanca fluorescente de 360 µe.m -2.s -1 ). Las plantas se inocularon con el patotipo D de V. dahliae por inmersión del sistema radical desnudo en una suspensión bacteriana 15 días antes de ser transplantadas a suelo infestado con 2x10 6 conidias/g de suelo del hongo. Las plantas que sirvieron como control se trataron como las inoculadas salvo que las raíces se sumergieron en agua estéril. Los bioensayos se llevaron a cabo según un diseño de bloques completos al azar con 4 bloques y 3 repeticiones (plantas) por bloque y tratamiento. Un tercer bioensayo (Exp 3) se efectuó tal y como se ha descrito para el Experimento 2, salvo que no se incluyeron los cvs. Frantoio y Empeltre (ambos tolerantes a la Verticilosis causada por D V. dahliae y en los que no se habían producido síntomas en el Experimento 2), pero se incorporó el cv. Picual. En este caso el bioensayo se llevó a cabo según un diseño de bloques completos al azar con 4 bloques y 4 repeticiones(plantas) por bloque y tratamiento. Los valores de severidad por planta sirvieron para calcular un Índice de Intensidad de Enfermedad (IIE), el Índice de Intensidad de Enfermedad Final (IIEF), el Área Bajo la Curva Progreso de Enfermedad (ABCPE) y el Área Bajo la Curva de Progreso de Enfermedad Estandarizada por el período de duración del experimento. El Período de Incubación (PI) se calculó como el tiempo medio transcurrido desde el comienzo del experimento hasta el inicio de los síntomas (Tejedor Gonzáles y col., 2004). CONCLUSIONES Los trabajos efectuados por nuestro grupo utilizando determinados aislados de P. fluorescens y P. putida obtenidos de raíces de plantas de olivo Picual demuestran el potencial que tienen dichas bacterias para su uso en programas de control biológico de la VO. Los aislados bacterianos estudiados han mostrado capacidad antagonista frente a V. dahliae in vitro, que es mediada por mecanismos de diferente naturaleza. Asimismo, se ha constatado la capacidad de aislados de P. fluorescens de colonizar y persistir en tejidos radicales de olivo; y que el establecimiento y mantenimiento de poblaciones de ellas en las raíces de olivo depende del método de aplicación que se utilice. En este sentido, el tratamiento del sistema radical del plantón por inmersión en suspensiones de células bacterianas resultó más efectivo que la aplicación de las bacterias mediante riego del suelo donde este crecía. Aunque no disponemos de pruebas definitivas, el más que probable carácter endofítico de las bacterias en estudio les confiere la ventaja adicional de su mejor adaptación al nicho de aplicación y la posibilidad, aún por elucidar, de inducir mecanismos de defensa contra la enfermedad en la planta. Los resultados de bioensayos en condiciones controladas y semicontroladas indican el potencial de de determinados aislados de Pseudomonas fluorescentes para el control eficiente de la VO en plantones de vivero micropropagados o autoenraizados, con un nivel de eficacia que varió según el aislado y las condiciones de ensayo. Sin embargo, queda todavía por demostrar convincentemente que dicho control puede ser alcanzado en las condiciones experimentales ensayadas utilizando plantones de olivo de mayor edad y diferente genotipo, si bien los resultados de algunos de los tratamientos indica una tendencia de actividad supresora de la enfermedad. En general, el desarrollo de Verticilosis difirió según el genotipo del olivo utilizado y las condiciones ambientales del experimento. Estas circunstancias deben hacer reflexionar sobre el delicado equilibrio existente entre planta, patógeno, ACB y condiciones ambientales, y que el adecuado conocimiento de todos los factores (biológicos y no biológicos) implicados en el proceso de enfermedad y de biocontrol es fundamental para el desarrollo de una estrategia de biocontrol consistente y eficaz en diferentes circunstancias. Aunque el mecanismo o mecanismos implicados en la supresión de la VO, no se ha determinado aún, nuestras investigaciones tratan de determinar si la falta de eficacia observada en ocasiones puede ser debida a la ausencia de inducción de mecanismos defensivos en olivo mediada por los ACB aplicados. AGRADECIMIENTOS Subvencionado por el proyecto CAO del Programa de Mejora de la Calidad del Aceite de Oliva, Junta de Andalucía. Manifestamos nuestro agradecimiento a Agromillora Catalana, S.A. (Barcelona) y Cotevisa (Valencia), Antonio García Berenguer y Carmen del Río por el suministro de plantones de olivo. BIBLIOGRAFÍA Berg G., Knaape C., Ballin G, y Seidel D Biological control of Verticillium dahliae Kleb. by natural occurring rhizosphere bacteria. Arch. Phytopath. Pflanz. 29:

6 Fravel D.R Role of antibiosis in the biocontrol of plant diseases. Ann. Rev. Phytopathol. 26: Fravel D.R., Davis J.R., y Sorensen L.H Effect of Talaromyces flavus and methan on Verticillium wilt incidence and potato yield En: J.R. Hartman (ed.), Biological and Cultural Tests for Control of Plant Diseases. Vol. 1 (p 17) APS Press, St Paul, MN, 84pp Hall H.T.J., Schreiber L.R., y Leben C Effects of xylem-colonizing Bacillus spp. on Verticillium wilt in maples. Plant Dis. 70: Jiménez-Díaz R.M., Tjamos E.C., y Cirulli M Verticillium wilt of major tree hosts: Olive. En: J.A. Hiemstra y D.C. Harris (eds.), A Compendium of Verticillium Wilt in Tree Species (pp ), Pousen and Looijen, Wageningen, The Netherlands King E.O., Ward M.K., y Raney D.E Two simple media for the demonstration of pyocyanin and fluorescein. J. Lab. Clin. Med. 44: Leeman M., den Ouden F.M., van Pelt J.A., Dirkx F.P.M., Steijl H., Bakker P.A.H.M., y Schippers B Iron availability affects induction of systemic resistance to Fusarium wilt of radish by Pseudomonas fluorescens. Phytopathology 86: Mercado-Blanco, J., Rodríguez-Jurado, D., Hervás, A., y Jiménez-Díaz, R.M Suppression of Verticillium wilt in olive planting stocks by root-associated fluorescent Pseudomonas spp. Biological Control 30: Mercado-Blanco, J., van der Drift, K.M.G.M., Olsson, P.E., Thomas-Oates, J.E., van Loon, L.C., y Bakker, P.A.H.M Analysis of the pmsceab gene cluster involved in the biosynthesis of salicylic acid and the siderophore pseudomonine in the biocontrol strain Pseudomonas fluorescens WCS374. J. Bacteriol. 183: Paulitz T.C., Zhou T., Y Rankin L Selection of rhizosphere bacteria for biological control of Pythium aphanidermatum on hydroponically grown cucumber. Biological Control 2: Ramette, A., Frapolli, M., Défago, G., y Moënne-Loccoz, Y., Phylogeny of HCN synthase-encoding hcnbc genes in biocontrol fluorescent pseudomonads and its relationship with host plant species and HCN synthesis ability. Mol. Plant-Microbe Interact. 16: Rodríguez-Jurado D Interacciones huésped parásito en la verticilosis del olivo (Olea europea L.) inducida por Verticillium dahliae Kleb. Tesis doctoral, Universidad de Córdoba Rodríguez-Jurado D., Blanco-López M.A., Rapoport H.F., y Jiménez-díaz R.M Present status of Verticillium wilt of olive in Andalucía (southern Spain). Bulletin OEPP/EPPO Bulletin 23: Scheffer R.J Biological control of Dutch elm disease by Pseudomonas species. Ann. Appl. Biol. 103: Schwyn B., Y Neilands J.B Universal chemical assay for the detection and determination of siderophores. Anal. Biochem. 160: Tejedor González, E., Mercado Blanco, J., y Jiménez Díaz, R.M Evaluación de la capacidad supresora de la Verticilosis del olivo de antagonistas microbianos y compuestos de origen biológico. XII Congreso de la Sociedad Española de Fitopatología, Lloret de Mar, Gerona, (libro de resúmenes). Thanassoulopoulos C.C Spread of Verticillium wilt by nursery plants in olives growers in the Chalkidiki area (Creece) Bulletin OEPP/EPPO Bulletin 23: Tjamos E.C Prospects and strategies in controlling Verticillium wilt of olive. Bulletin OEPP/EPPO Bulletin 23: Tjamos E.C. Y Jiménez-Díaz R.M Technical aspects: Management of the disease. En: J.A. Hiemstra y D.C. Harris (eds.), A Compendium of Verticillium Wilt in Tree Species (pp ), Pousen and Looijen, Wageningen, The Netherlands Utkhedes R.S Effect of bacterial antagonists on Phytophthora cactorum and apple crown rot. Phytopathol Z. 109: IIE Final (0-1) ABCPEE PI (días) Cultivar Tratamiento Exp1. (CS) Exp 2. Exp 3. Exp1. (CS) Exp 2. Exp 3. Exp1. (CS) Exp 2. Exp 3. Cornicabra Control 0,93 0, ,36 62, Plantas tratadas 0,69 0, ,75 55, Lechín Control 0,34 0, (2) 93,67 69,33 - Plantas tratadas 0,45 0, ,17 52,83 - Hojiblanca Control 0,63 0, ,33 68, Plantas tratadas 0,47 0, ,00 61, Manzanilla Control 0,71 0, ,92 63, Plantas tratadas 0,78 0, ,82 63, Picual Control NI(1) NI 0.37 NI NI 0.13 NI NI Plantas tratadas NI NI 0.66 NI NI 0.23 NI NI Tabla 1. Efecto de la aplicación combinada de Pseudomonas fluorescens PICF 4 y PICF 7 sobre el desarrollo de la VO en diferentes cultivares de olivo. (1) NI= no incluido (2) En el cultivar Lechín no se desarrolló suficiente cantidad de enfermedad. En negrita y cursiva se indican valores que muestran tendencia de supresión de la enfermedad cuando se comparan los resultados en plantas controles (no bacterizadas) con plantas bacterizadas, si bien estas diferencias no fueron significativas. 6