Aplicaciones de la Biotecnología Vegetal

Transcripción

1 Aplicaciones de la Biotecnología Vegetal

2 Qué es la Biotecnología? La Biotecnología es toda aplicación tecnológica que utilice sistemas biológicos u organismos vivos o sus derivados para la creación o modificación de productos o procesos para usos específicos.

3 Biotecnología Vegetal Conjunto de técnicas de cualquier tipo, empleadas sobre vegetales como organismos enteros o sobre alguna de sus partes (tallos, hojas, orgánulos etc.)

4 Virología Fisiología Vegetal Biología Molecular Biotecnología Vegetal Botánica Bioquímica Agricultura Biología Celular

5 Historia de la Biotecnología Vegetal Biotecnología tradicional Descubrimiento de la agricultura ( ac) Fabricación de cerveza de los sumerios (6000 ac) Elaboración del vino en Mesopotamia ( ac) Producción del pan en Egipto ( ac)

6 Biotecnología Clásica (siglo XIX) La finalidad principal es la mejora de distintas plantas para obtener variedades con las características seleccionadas. Introducción consciente de la diversidad genética en las poblaciones cruzando progenitores con características notables. Es óptima para el manejo de características que depende de la interacción de muchos genes.

7 Biotecnología moderna (a partir 1970). Se apoya en la puesta en práctica de la ingeniería genética, consiste en introducir información genética nueva en un organismo para dotarlo de capacidades que antes no poseía.

8 Ventajas y desventajas de la Biotecnología 1) Ventajas : Rendimiento superior. Reducción de pesticidas. Aumento de resistencia frente a patógenos y deficiencias nutricionales.

9 2) Desventajas Riesgos para el medio ambiente - Polinización cruzada. - Cultivos modificados con genes que producen toxinas insecticidas (B. anthracis). - Perdida de biodiversidad. - Mayor inestabilidad frente a variables ambientales. Riesgos para la salud: - Transferir toxinas o compuestos alergénicos de unas especies a otras. - Problemas éticos.

10 Plantas transgénicas Organismos en los que se han introducido genes que proceden de otras especies o en los que se ha modificado la expresión de sus propios genes, incorporándosele o no DNA de otras especies.

11 Propagación clonal rápida El callo y el cultivo de células individuales Producción plantas transgénicas Protoplastos vegetales Haploides

12 Propagación clonal rápida Cultivo in vitro de un meristemo o yema apical aislado de un vástago. A veces se utilizan para obtener plantas sanas libres de patógenos a partir de plantas madre cuya sanidad se desconoce.

13 Propagación clonal rápida Cultivo in vitro de un meristemo o yema apical aislado de un vástago. Por qué no existe virus en el meristemo?: 1) - Transporte del virus. Sistema Vascular de la planta. Vasos no llegan al meristemo, no podría alcanzarlo. Velocidad del virus inferior al meristemo. 2) - Inhibición por alta tasa metabólica. Elevada concentración de reguladores.

14 Callo: El callo y cultivos de células individuales Tejido desorganizado formado por una masa de células tumorales debido a que éstas crecen de manera descontrolada. La mayoría de estas células están en estado diferenciado salvo algunas que revierten al estado indiferenciado.

15 El callo y cultivos de células individuales Consiste en regenerar plantas a partir de células desorganizadas y diferenciadas pero siempre que estas reviertan al estado de meristimoide y/o embrioide.

16 Aplicaciones del callo y cultivos de células individuales (Ejem. Fitopatología): Estudiar los efectos que presentan ciertas sustancias secretadas por patógenos. Estudiar el comportamiento del patógeno (parásitos obligados). Estudiar barreras estructurales y sustancias bioquimicas que producen las células y tejidos de las variedades vegetales resistentes. Probar in vitro sustancias químicas.

17 Protoplastos vegetales Protoplasto: es una célula vegetal que ha perdido su pared celular para lo cual se usan métodos mecánicos o enzimáticos. Los virus se introducen en las plantas mediante el empleo de protoplastos utilizando: - Fusógeno. - Liposomas.

18 Protoplastos vegetales Una vez introducido el virus con la variable de estudio, los protoplastos se introducen en medios nutritivos con: - Toxina. - Patógenos. A continuación se observa la resistencia de cada protoplasto.

19 Plantas Haploides Anteras Células Haploides Plantas haploides Dotación genética 1N Fácil aislamiento de genes menores que confieren resistencia

20 Aplicaciones de las plantas haploides en Fitopatología Inoculación del material con virus y otros patógenos y su posterior selección para obtener resistencia a las enfermedades. Diploidización o inoculación del tejido dihapolide seguida de una selección del material vegetal para obtener resistencia contra los patógenos. Inoculación y selección del tejido vegetal para obtener resistencia contra las enfermedades.

21 TÉCNICAS DE INGENIERÍA GENÉTICA QUE SON IMPORTANTES: 1. Biología Molecular Vegetal. 2. Biología Molecular de los Fitopatógenos. 3. Vectores que se utilizan para Clonación Genética en plantas.

22 1. Biología Molecular Vegetal

23 Células Vegetales Tienen tres genomas de DNA de doble banda separados pero intercalados: Genoma Nuclear: Está dividido en cromosomas y es el más grande. Típico de los organismos eucarióticos.

24 Genoma Mitocondrial: Células Vegetales Molécula de DNA circular pero que a veces es lineal. Puede consistir también en varias moléculas e incluso puede contener pequeñas moléculas de DNA parecidas a plásmidos. Los ribosomas presentan un tamaño intermedio.

25 Genoma de los Cloroplasto: Consta de una molécula de DNA circular. Su sistema genético es esencialmente de naturaleza procariótica. Los ribosomas son mas pequeños que los del genoma nuclear y del mismo tamaños que los de las bacterias.

26 Funciones Básicas del DNA de cada Genoma Se Replica: Produce copias exactas de ciertas partes de cada molécula de DNA o del todo el genoma. Las copias: Permanecen en la misma célula. Son distribuidas en cada una de las células hijas Es Transcrito en RNA: este puede ser: RNA ribosomal (RNAr). RNA de transferencia (RNAt). RNA mensajero (RNAm) Son los únicos que pueden traducirse a proteínas. Casi todos los RNAs son Procesados son modificados por la célula antes de que maduren.

27 Gen Definición Cada segmento de DNA que es transcrito en un RNA funcional. Cuando se expresa? Cuando se transcribe a RNAm. Proceso: RNAm Proteína Traduce Transloca Locus adecuado Realiza su función normal

28 Regulación de la expresión Por numerosos mecanismos de control: Otros genes reguladores. Regiones promotoras. Señales de iniciación y de terminación. Reguladores del crecimiento. Condiciones ambientales. Otros más

29 2. Biología molecular de los Fitopatógenos

30 Organismos Fitopatógenos: Eucariontes. Procariontes. Virus Interés en este estudio: Comenzó aproximadamente 10 años. Se debe: Los sistemas genéticos de algunos patógenos pueden utilizarse como vehículos de introducción de material genético extraño en el genoma de plantas Se pueden modificar genéticamente. Aumentó al observar que los sistemas genéticos de estos y de sus organismos antagonistas se podían modificar Se podían controlar biológicamente a los organismos patógenos.

31 Clonación Genética Qué es?: El aislamiento y multiplicación de un gen individual o de una secuencia de genes cuando se inserta en una bacteria o levadura, donde puede replicarse.

32 Clonación Genética Qué permite?: Obtener cantidades lo suficientemente grandes de un gen o su RNAm. Para estudiar la estructura del gen y las secuencias que regulan su expresión. Para resintetizar o modificar al gen. Para insertar al gen en otros organismo Producto codificado por el gen en estudio.

33 Clonación Genética Etapas del procedimiento: Clonación de DNA complementario a partir del RNAm. Genes de clonación obtenidos a partir del DNA del genoma. Expresión de los genes Clonados.

34 III. Expresión de los genes clonados La expresión de los genes de las plantas en los genomas bacterianos no es siempre posible. Pero al utilizar genes derivados del DNAc se han logrado clonar y expresar en bacterias: Genes del núcleo. Genes de los cloroplastos. Incluso genes de las mitocondrias. Actualmente se ha logrado: Transferir. Incorporar. Expresar Ciertos genes clonados de

35 3. Vectores que se utilizan para clonación genética en plantas

36 Vectores: Son aquellos organismos capaces de transferir material genético de un organismo a otro Donador Receptor - El material genético persiste. - Se expresa en la célula receptora. Los más utilizados: Plásmido de la bacteria fitopatógena Agrobacterium tumefaciens. El virus del mosaico de la coliflor.

37 Otros en estudio: Geminivirus Con DNA de una sola banda. Virus del mosaico del tabaco Con un RNA de una sola banda. Otros virus. Transposones.

38 I. Plásmidos bacterianos como vectores Se utiliza Plásmido Ti de Agrobacterium tumefaciens. Cepas virulentas de A.tumefaciens Formación de tumores Infectan Induce AGALLAS DE LA CORONA

39 Si entra en contacto con una planta ya lesionada Planta lesionada Plásmido Ti se transfiere de la bacteria a la célula DNA T Región específica del plásmido Ti Se transfiere al núcleo de la célula vegetal. Se integra al genoma nuclear de la planta y se transcribe.

40 Contiene varios genes: Región del DNA T Gen para la opina sintetasa: Enzima que sintetiza las opinas. Sustancias que solo producen las células vegetales transformadas. Se utilizan como fuente de C y N solo por las bacterias que contienen: Plásmido Ti. Gen específico para el catabolismo de las opinas. Gen o genes que controlan la biosíntesis de citocininas: Su inactivación produce tumores en la raíces. Genes que controlan la biosíntesis de auxinas: su inactivación produce tumores en los vástagos. 25 pares de bases terminales: Se necesitan para que ocurra la transferencia del DNA T hacia el genoma de la planta.

41 Otros genes del plásmido Ti Van a influir a los que controlan: La transferencia conjugada del plásmido Ti. El catabolismo de las opinas. Las propiedades de incompatibilidad del plásmido hacia algunas cepas. El origen de la replicación del plásmido.

42 Problemas y Ventajas del plásmido Ti Problemas: Demasiado grandes. Difíciles de manipular desde el punto de vista genético. Las células infectadas se transforman en células tumorosas Es difícil regenerarlas como plantas completas Célula infectada Células Tumorosas Difícil regenerar

43 Ventajas: Ninguno de los genes incluidos dentro del DNA T son necesarios para que ocurran la transferencia e integración de ese DNA. El material genético de las células animales, bacterianas y vegetales no emparentadas que se insertan en el DNA T: Se transfieren al genoma nuclear de la planta. Los genes solo se expresan cuando la región promotora del gen de la opina sintetasa se incorpora al gen extraño Gen Quimérico. P P Opina Sintetasa Gen Extraño Gen Quimérico

44 Solución a los Problemas Problemas de transformación en células tumorales: Aislar la región oncogénica o inductora de tumores Son los genes que controlan la biosíntesis de las auxinas y citocininas del DNA T. Las células vegetales son transformadas con el nuevo material genético: Ya no son células tumorales. Se pueden regenerar en plantas transformadas íntegras. Las regiones del DNA T son ocupadas por genes quiméricos. DNA T Gen quimérico Kanamicina r

45 Problema del gran tamaño: a) Se utiliza un plásmido Ti no tumoroso: Se conservan las secuencias terminales del DNA T. Los genes entre las regiones terminales de DNA T se sustituyen por un pequeño plásmido de E.coli.. El DNA del gen extraño también se clona en otro plásmido pbr32 Región pbr32 Gen extraño Secuencias terminales del DNA T Gen extraño Plásmido Ti + Región pbr32 Recombinación en la región pbr32 + Región pbr32

46 a) Clonar regiones: DNA T Se van a clonar: Regiones terminales del DNA T (junto con los genes extraños que comprende) en un plásmido pequeño. Región de virulencia en otro plásmido similar. Por si solos ningún plásmido causa infección. Pero si: Virulencia Miniplásmido Ti es virulento DNA T y el gen o genes extraños que contienen Se integran a los cromosomas de la planta. Agrobacterium Cél. Vegetal

47 Conclusiones sobre el plásmido Ti El conocimiento sobre él: Conocimiento relacionado a la patología de este agente fitopatógeno. Capacidad para transferir selectivamente de un planta a otra los genes que confieran resistencia. Obstáculos a los que se enfrenta: Dónde se encuentra el gen de resistencia en el genoma de las células de las plantas resistentes? Cómo se expresa en las nuevas plantas?

48 II. Los virus fitopatógenos como vectores Son muy buenos en estudios en bacterias y animales, pero no en plantas. No es posible que sean vectores de incorporación como el plásmido Ti. Es probable que transfieran algún gen en una célula vegetal, donde este gen: Se replicará casi un millón de veces con el virus. Se propagaría sistemáticamente por toda la planta. Se piensa que los se utilicen serán seleccionados o tratados con técnicas de ingeniería genética: Podrán infectar a las células vegetales y autoduplicarse. Duplicar al gen o genes extraños que contienen. Sin causar síntomas y pérdidas en la producción de plantas.

49 Cuáles se va a utilizar? Caulimovirus Geminivirus Virus RNA Viroides

50 Caulimovirus Son virus isométricos. Tienen un DNA circular de doble banda. Virus del mosaico de la coliflor (VMCa): Se transmite: Inoculación mecánica de las hojas. Por áfidos en plantas de la familia de las crucíferas. El virus y su DNA aislado son infecciosos: Causan infecciones sistémicas en los hospedantes. Producen casi medio millón de partículas virales por célula. Aún no se ha podido utilizar como vector genético.

51 Geminivirus Son virus isométricos que están en pareja. Varios tienen un genoma dividido: Son un par de moléculas de DNA de igual tamaño pero que codifican para diferentes funciones. Geminivirus Proteínas de la cápside idénticas DNAs con diferente secuencia de nucleótidos Partículas en pares Cél. Vegetal Se replican en su núcleo

52 En la naturaleza se transmiten: Por medio de chicharritas o mosquitas blancas en forma persistente. Por vía mecánica Con dificultad. Infectan: A planta monocotiledóneas y dicotiledóneas. Problemas: Pequeño tamaño de su genoma. Dificultad de transmitirse a través de la savia. Se están realizando esfuerzos para utilizarse en el futuro.

53 Virus del RNA Es posible que el futuro adquieran importancia. Virus multiparticulados: Ese RNA puede sustituirse por completo con material genético extraño No afecta a la capacidad del virus para producir infección. RNAs y Virus satélite: Se sustituyen total o parcialmente por material genético extraño Sería introducido en la planta al ser infectada por el virus. No se han logrado la síntesis y su uso como vectores.

54 Viroides Son pequeñas moléculas de RNA. Desnudo. Circular. De una sola banda. Se transmiten por vía mecánica. Se replican en el núcleo de las células hospedantes. Infectan sistémicamente a las plantas. Se les considera posibles vectores pero actualmente no se aplican.

55 III. Componentes genómicos de las plantas como vectores Elementos transponibles o transferibles. Elementos extracromosómicos. Elementos cromosómicos.

56 Elementos transponibles o transferibles Son segmentos de DNA que existen en el genoma de todo tipo de organismos. Pueden transferirse al genoma de las células e integrarse en diferentes sitios Incluso cuando pasan la mayor parte del tiempo incorporados en ese genoma. Se piensa que: Gen extraño Elemento transponible aislado 1. Se aísla el elemento transponible 2. El elemento extraño de alguna planta se inserta en él. 3. El elemento híbrido puede introducirse en células o protoplastos vegetales. 4. Puede incorporarse al genoma celular. Elemento híbrido

57 Elementos extracromosómicos Son segmentos de DNA lineales o circulares. Se replican de manera independiente. Se localizan en el citoplasma. Estas propiedades: Permiten considerarlos como posibles medios de estudio y utilización como vectores genéticos. Pero se desconoce su potencial como vector.

58 Elementos cromosómicos Permiten incorporar algún otro material genético distinto al genoma del hospedante Con o sin remplazo de sus genes homólogos. Se ha logrado realizar en levaduras No en plantas.

59 IV. Sistemas de transferencia química y mecánica del DNA dentro de las células 1. Incorporación: De DNA en fragmentos cromosómicos o plásmidos. De cromosomas completos en protoplastos vegetales. Cómo se hace?: Mezclar Ác. nucleico + Protoplastos. En presencia de cationes Polietilenglicol. Medio con cationes Polietilenglicol Ác. nucleico Protoplasto

60 1. Electroporación o electrotransformación: Tratamiento de un mezcla de protoplastos vegetales y de DNA extraño Con breves pulsos eléctricos: Rompe temporalmente la membrana celular Permite que el DNA extraño penetre en la célula. El DNA extraño puede expresarse después y los protoplastos convertirse en plantas. Para plantas monocotiledóneas y dicotiledóneas. Mezcla Pulso eléctrico Expresión del DNA

61 1. Microinyección directa del ácido nucleico en células vegetales: Es una tecnología que permite la introducción mecánica de soluciones en el interior de la célula mediante una micropipeta. Es una técnica muy sensible.

62 Inclusión del DNA o RNA en liposomas y fusión de estos con los protoplastos. Fusión directa de protoplastos vegetales con: Bacterias transformadas. Conclusión de bacterias que tienen plásmidos formados por el DNA extraño.