VIROLOGÍA VETERINARIA

Transcripción

1 VIROLOGÍA VETERINARIA In: A Concise Review of Veterinary Virology, Carter G.R., Wise D.J. and Flores E.F. (Eds.). International Veterinary Information Service, Ithaca NY ( Last updated: 8-Feb-2005; A ES Prefacio G.R. Carter 1, D.J. Wise 2 and E. F. Flores 3 1 Virginia-Maryland Regional College of Veterinary Medicine, Virginia Tech, Blacksburg, Virginia, USA. 2 Department of Biology, Concord University, Athens, West Virginia, USA. 3 Department of Veterinary Preventive Medicine, Federal University of Santa Maria, Santa Maria, RS Brazil. Traducido por: I. Revah, International Veterinary Information Service, Ithaca NY, USA. (15-Mar-2005). El objetivo de este libro es el proporcionar un tratado general y conciso sobre virología para los estudiantes veterinarios y los veterinarios. Se ha puesto particular énfasis en las características que son relevantes cada día en la clínica del veterinario. Los asistentes y técnicos veterinarios también encontrarán el libro accesible y útil. El origen de este libro es la sección de virología preparada por A. Wayne Roberts, en la quinta edición del libro "Essentials of Veterinary Microbiology". Este libro fue escogido por ser conciso y por hacer énfasis en la virología clínica. En este nuevo libro se mantiene lo conciso y el énfasis práctico, sin embargo, las enfermedades virales son presentadas por familias virales en vez de hacerlo por "huésped/sistema". Este enfoque taxonómico tiene la ventaja de incluir juntas a aquellas enfermedades que tienen un número de características básicas y patogénicas similares. Un ejemplo es la semejanza de las enfermedades causadas por algunos parvovirus. La parte introductoria del libro presenta todo el conocimiento significativo clásico, así como el más reciente, sobre la virología básica, incluyendo la taxonomía y las técnicas biológicas moleculares más recientes. El uso de estas últimas se destaca particularmente en la sección de patogenia bajo diagnóstico de laboratorio. Se ha intentado incluir información epidemiológica, clínica y patológica suficiente, más no excesiva, para proporcionar un recuento integral e interesante de enfermedades importantes. Para evitar el posible tedio de la recitación de hechos necesarios, además de ejercicios de laboratorio, los instructores pueden incluir casos clínicos para estudio e informes reales sobre los brotes de enfermedades virales.

2 En el interés de mantener la brevedad hemos omitido todas las referencias. La disponibilidad de innumerables referencias en el Internet hace la inclusión de referencias en libros de esta clase innecesaria. Estamos muy agradecidos con A. Wayne Roberts, de la Universidad de Georgia, que generosamente nos permitió usar libremente su material de la 5ta edición del libro Essentials of Veterinary Microbiology. Esto nos facilitó mucho la preparación de este volumen. G.R. Carter D.J. Wise E. Furtado Flores Características generales, estructura y taxonomía viral D.J. Wise 1, G.R. Carter 2 and E. F. Flores 3 1 Department of Biology, Concord University, Athens, West Virginia, USA. 2 Virginia- Maryland Regional College of Veterinary Medicine, Virginia Tech, Blacksburg, Virginia, USA. 3 Department of Veterinary Preventive Medicine, Federal University of Santa Maria, Santa Maria, RS Brazil. Traducido por: A. T. Pérez Méndez, Biotecnología Veterinaria de Puebla, S.A de C.V., Tehuacán, Puebla, Mexico. (15-Mar-2005). Indice Generalidades Estructura viral Taxonomía viral Glosario Generalidades Los virus son mucho más pequeños que las células procariontes o eucariontes En general, a diferencia de las células, los virus tienen una estructura simple y estática No tienen un sistema metabólico propio. Dependen de la maquinaria de la célula hospedera para su replicación (parásitos intracelulares estrictos) Tienen genomas de ADN o ARN, pero carecen de ribosomas y otros factores necesarios para la traducción de proteínas. Así pues, dependen de la célula hospedera para la producción de proteínas virales. Sus genomas codifican información mínima para asegurar lo siguiente: 1) replicación del genoma y empaquetamiento; 2) producción de proteínas virales; y 3) subvertir funciones celulares para permitir la producción de viriones. Algunos virus (bacteriófagos) infectan células procariontes, mientras que otros infectan células eucariontes.

3 Algunos virus destruyen las células, produciendo enfermedad; otros persisten en estado latente o persistente en la célula infectada; y otros pueden causar transformación maligna de las células a las que infecta. Estructura viral Los virus se componen, al menos, de un genoma de ácido nucleico ADN o ARN y una cubierta de proteínas. Muchos virus tienen además una membrana externa llamada envoltura. La cubierta proteica o cápside de un virión (virus completamente ensamblado o partícula viral) está compuesta de múltiples copias de uno o más tipos de proteínas. Estas proteínas se ensamblan, formando unidades estructurales llamadas capsómeros. Al ácido nucleico más la cubierta o cápside de una partícula viral es frecuentemente llamada nucleocápside Los virus más simples son aquellos que carecen de envoltura y tienen ADN o ARN de cadena sencilla (Fig. 1.1). Los virus envueltos contienen una membrana externa que rodea a la nucleocápside (Fig.1.2). La envoltura viral se deriva de membranas de la célula hospedera (nuclear, de aparato de Golgi, de retículo endoplásmico o membrana plasmática). Tal como estas membranas, la envoltura viral se compone de una bicapa lipídica con proteínas insertadas en ella, proteínas que son codificadas por el virus. Algunos virus, como los bacteriófagos, tienen colas proteicas complejas que se requieren para el anclaje y/o la penetración del ADN viral en la célula hospedera susceptible. Figura 1-1. Virión no envuelto con cápside icosahédrica. El ácido nucleico está en el interior de la cápside. Ilustración cortesía de A. Wayne Roberts. Para ver oprima la figura Figura 1-2. Virión envuelto con cápside helicoidal. El ácido nucleico se localiza en el interior del virión como indica la línea punteada en forma de espiral. Las líneas en la superficie exterior de la envoltura representan espículas glicoprotéicas. Ilustración cortesía de A. Wayne Roberts. Para ver oprima la figura

4 Genoma viral El genoma viral está compuesto por ADN o ARN. Un virus no contienen ADN y ARN simultáneamente. El ADN puede ser de una sola cadena (ss por sus siglas en inglés) (parvovirus y circovirus), de doble cadena (ds por sus siglas en inglés) (polyomavirus, adenovirus, herpesvirus), o parcialmente de doble cadena (hepadnavirus). El genoma de ADN puede tener sus extremos covalentemente ligados el uno al otro (circular = polyomavirus, circovirus) o no estar unido por sus extremos (lineal = adenovirus, herpesvirus, parvovirus). El genoma de los virus de viruela (poxvirus) es ssadn cuyos extremos están covalentemente unidos uno al otro. Todos los genomas virales de ARN son lineales. La mayoría de estos son cadena sencilla y unos pocos son de cadena doble (reovirus, bornavirus). La mayoría de los virus de ARN tienes sus genomas en una sola pieza (monopartita) mientras que otros lo tienen dividido en 10 segmentos (reovirus), 7 u 8 segmentos (ortomyxovirus), tres segmentos (bunyavirus) y dos segmentos (arenavirus). En cuanto a ssarns, hay dos posibilidades importantes de secuencia: Si el ssarn funciona como mensajero para la traducción de proteínas (tiene la misma orientación que el marn), se le llama sentido positivo. En contraste, si el ARN viral es antisense (o complementario) a ese marn - y entonces no puede ser traducido directamente - se dice que es sentido negativo. En algunos virus (Arenavirus y Bunyavirus) se transcriben porciones del genoma de ARN, generando ARNs mensajeros que son entonces traducidos. La copia de estos marns (complementaria, supuestamente ARNs sentido negativo) puede ser también traducida. Este arreglo es único entre los virus, y se dice que es ambos sentidos (ambisense). Los genes contenidos dentro del genoma pueden codificar desde unos pocos productos génicos diferentes (Polyomavirus, 6-7 genes, 5000 nucleótidos de longitud) hasta más de productos génicos diferentes (Herpesviridae, 60 a 120 genes, 120, ,000 pares de bases de nucleótidos de longitud). En general, los genomas de los virus ARN son más pequeños, con un tamaño máximo de 30,000 nucleótidos como se ve en los Coronavirus. Una hipótesis para esto es que las polimerasas ARN virales tienden a cometer más errores que las polimerasas ADN. Así, la fidelidad de la replicación puede limitar el tamaño. En contraste, los genomas de virus de ADN pueden alcanzar un tamaño de hasta 300,000 nucleótidos, como se ve en algunas especies de Herpesvirus. La cápside La función de la cápside es proteger el genoma viral durante su transferencia de célula a célula. La cápside puede estar hecha de múltiples copias de una sola proteína o de una asociación de varias proteínas diferentes. Las cápsides hechas de múltiples copias de una sola proteína representan un buen ejemplo de economía, ya que un solo gene puede codificar los productos necesarios para cubrir con la cápside el genoma completo. La cápside de un virus puede tener diferentes formas geométricas que son características de varias familias virales. Estas incluyen:

5 o icosaédrico desnudo (picornavirus, polyomavirus); o envuelto (herpesvirus). Esta figura geométrica tiene varias caras triangulares y esquinas (ver Fig. 1.1); el número de caras y esquinas puede variar de acuerdo al número y tipo de asociación entre las proteínas estructurales (unidades). o estructura helicoidal, desnudo (virus del mosaico del tabaco) o envuelto (virus de la rabia), (ver Fig. 1.1 y Fig. 1.2). o complejos, que tienen una mezcla de arreglos (por ejemplo, bacteriófagos, virus de viruela). Los virus varían en tamaño, desde los circovirus con nm de diámetro, hasta los virus de viruela o poxvirus que alcanzan los 300 nm. Estos virus tienen forma de ladrillo u ovoide y son suficientemente grandes como para ser vistos con microscopio óptico, no como los otros virus para cuya visualización es necesario el uso de microscopio electrónico. Se han utilizado varias técnicas para la visualización de los virus. La cristalografía de rayos X es un medio para determinar su estructura física, así como las dimensiones de las proteínas individuales y componentes virales. La información obtenida por esta técnica se usa luego para "construir" (un modelo) de la estructura total de la partícula viral. La microscopía electrónica se usa para generar información en torno a la forma general de los virus, y se usa también con fines diagnósticos a través de la detección de partículas virales en especimenes o muestras clínicas. En el capítulo 2 se describen con detalle los métodos para la visualización de viriones. Cinco formas estructurales básicas De acuerdo a su morfología básica, y tal como se mencionó anteriormente, hay cinco estructuras virales básicas diferentes. Estas formas, con ejemplos, se enlistan a continuación: icosaédrico desnudo - adenovirus y picornavirus. helicoidal desnudo - virus del mosaico del tabaco; no se conocen virus de humanos o de animales que tengan esta estructura. icosaédrico envuelto - togavirus y flavivirus. helicoidal envuelto - rhabdovirus y paramyxovirus. complejos - bacteriófagos y virus de viruela. Envolturas virales La envoltura viral, característica de algunas familias virales, se deriva de membranas de la célula hospedera por protrusión de yemas, lo cual ocurre durante la liberación de viriones de la célula (infectada). Esta membrana es frecuentemente una porción de la membrana plasmática, sin embargo puede ser parte del aparato de Golgi, del retículo endoplásmico o de la membrana nuclear, dependiendo del tipo de virus y del compartimiento celular donde la replicación se lleva a cabo. Independientemente de su origen, la membrana se compone de una bicapa lipídica - de origen celular - con proteínas asociadas. Estas proteínas asociadas con la bicapa lipídica son principalmente de origen viral (codificadas por el virus) y son en su mayoría glicoproteínas. El número de proteínas virales en la envoltura puede variar desde una hasta más de diez, dependiendo del virus. Las glicoproteínas de la envoltura viral llevan a cabo varias funciones, incluyendo el anclaje inicial del virión a la célula blanco, penetración, fusión

6 y diseminación de una célula a otra, entre otros. El anclaje del virión a la superficie celular requiere que la envoltura esté intacta y las glicoproteínas tengan su conformación nativa. Los fármacos antivirales están dirigidos contra las proteínas de la envoltura y pueden disminuir la habilidad del virus para anclarse e iniciar la infección, disminuyendo así la infectividad. El proceso de protrusión de yemas, y la consecuente adquisición de la envoltura por los viriones recién formados, puede o puede no resultar en la muerte de la célula hospedera. Si son liberados muchos viriones simultáneamente, la integridad de la membrana celular puede estar suficientemente comprometida como para conducir a la muerte celular. De manera alternativa, la liberación de los viriones puede ser lenta, resultando en una excreción crónica e infecciones persistentes. De hecho, a diferencia de la liberación de virus no envueltos, que se lleva a cabo principalmente a través de la lisis y muerte celular; el egreso de virus envueltos frecuentemente es compatible con la supervivencia de la célula. Por tanto, el fenómeno de protrusión de yemas provee de un medio de liberación viral sin conducir a la muerte celular. Proteínas Virales Hay dos tipos básicos de proteínas codificadas por los virus: estructurales y no estructurales. Las proteínas estructurales son aquellas que son parte de la estructura física del virión (cápside, envoltura), mientras que las proteínas no estructurales se producen dentro de la célula infectada y juegan diferentes papeles en los pasos de replicación viral. El número de proteínas codificadas por los genomas virales varía enormemente, desde tan pocas como dos proteínas, hasta cientos de ellas. Típicamente las proteínas estructurales son aquellas que componen la cápside y que empaquetan el ácido nucleico del genoma viral. En algunos virus envueltos hay una capa proteica entre la cápside y la envoltura (el tegumento). Las proteínas que forman el tegumento también son proteínas estructurales. Las proteínas de la estructura externa de la cápside o envoltura son ligandos, que interactúan con receptores en la superficie de la célula blanco. Algunas de estas proteínas (glicoproteínas) se procesan en el lumen del retículo endoplásmico rugoso, donde se añaden oligosacáridos a la cadena polipeptídica. Estas proteínas son enviadas al aparato de Golgi, a las vesículas secretoras, y finalmente se fusionan con la membrana plasmática haciéndose presentes sobre la superficie de la célula infectada. Esto es especialmente importante para los virus envueltos. Las glicoproteínas de la envoltura juegan papeles en la mediación de la interacción entre los viriones y las células (anclaje, penetración, fusión, diseminación de una célula a otra) y son los blancos principales de los anticuerpos neutralizantes. Las proteínas no estructurales son principalmente, pero no exclusivamente, enzimas como aquellas asociadas con el proceso de transcripción del genoma, replicación y procesamiento de proteínas. Un ejemplo de proteínas no estructurales es la trancriptasa reversa de los retrovirus, que hace copias de ADN a partir de un molde de ARN. Este paso es una característica importante de los retrovirus cuyo ARN necesita ser convertido a ADN para ser incorporado al cromosoma del hospedero. Algunos virus codifican varias proteínas no estructurales que juegan diversos papeles accesorios en la regulación de la expresión genética celular y viral, regulación de diferentes pasos del ciclo viral, neutralización de la defensa del hospedero, transformación celular, etcétera. Otros componentes virales Lípidos

7 Los lípidos de los virus se derivan de las membranas celulares de la célula hospedera. Éstos son en su mayoría fosfolípidos (50-60%) y el resto es colesterol. Como consecuencia de que se derivan de la célula hospedera, su composición lipídica varía. La bicapa lipídica de la membrana de la célula hospedera que rodea al virión de los virus envueltos, también posee proteínas virales y glicoproteínas, como las espículas características de algunos virus envueltos. La composición lipídica global de los virus envueltos representa aproximadamente el 25-30% de su peso seco. El resto se divide entre la porción del ácido nucleico y la porción proteica. Carbohidratos Los carbohidratos virales están presentes típicamente como los residuos de oligosacáridos de las glicoproteínas, glicolípidos y mucopolisacáridos. La composición de los carbohidratos corresponde a aquella de la célula hospedera. Sin embargo las glicoproteínas frecuentemente tienen un enlace N- u O- glucosídico. Los carbohidratos virales se encuentran principalmente en la envoltura. Algunos de los virus más grandes y complejos contienen glicoproteínas internas o proteínas glicosiladas en la cápside. Taxonomía viral Los virus constituyen un grupo numeroso y heterogéneo. Se clasifican en categorías taxonómicas jerárquicas basadas en muchas características. La clasificación es dinámica ya que continuamente se van descubriendo nuevos virus y se acumula nueva información sobre virus ya conocidos. La clasificación y nomenclatura usadas en este libro estaba actualizada hasta el momento de ser escrito. Los cambios más recientes aparecen en informes del Comité Internacional de Taxonomía Viral (ICTV por sus siglas en inglés), séptima edición (Disponible en amazon.com). El esquema básico de clasificación jerárquica es: Orden - Familia - Subfamilia -Género - Especie - Cepa / Tipo. Ciertas características virales, referidas más adelante, definen cada una de estas categorías taxonómicas. Las Órdenes tienen el sufijo -virales, las familias tienen el sufijo -viridae, mientras que los géneros contienen el sufijo -virus. Una especie viral está constituida por un linaje replicante que ocupa un nicho ecológico, por ejemplo una enfermedad en particular. Los virus se clasifican en familias con base en muchas características. Una característica básica es el tipo de ácido nucleico (ADN o ARN) y la morfología, esto es, el tamaño y forma del virión así como la presencia o ausencia de una envoltura. También se usan el rango de hospederos y las propiedades inmunológicas del virus (serotipos). También se usan en la clasificación las propiedades físicas y fisicoquímicas como masa molecular, densidad de flotación, inactivación térmica, estabilidad al ph y sensibilidad a varios solventes. Algunos aspectos importantes de la taxonomía actual de los virus son si su material genético es ADNA o ARN, si es de cadena sencilla o doble, la organización de su genoma y la presencia de ciertos genes. Todo lo anterior se utiliza para ubicar a los virus en órdenes o familias particulares. Por ejemplo, el orden Mononegavirales está compuesto por aquellos virus que poseen genoma de cadena sencilla de ARN con orientación negativa. Finalmente, la clasificación se basa en las macromoléculas producidas (proteínas estructurales y enzimas), propiedades antigénicas y propiedades biológicas (por ejemplo, acumulación de viriones en las células, infectividad,

8 hemoaglutinación). Las Familias virales se enlistan en la tabla de contenidos bajo varias categorías de sus ácidos nucleicos. Las familias se presentan en el libro usando el mismo orden en el que aparecen en esta lista. La Tabla 1.1 proporciona información básica acerca de cada una de las principales categorías taxonómicas virales. Tabla 1.1. Clasificación y algunas características básicas de virus de vertebrados. Virus de ADN de cadena sencilla Familia Simetría de la cápside y tamaño del virión (nm) Subfamilia Géneros Especies representativas Circoviridae Icosahédrica; Circovirus Virus de la enfermedad del pico y la pluma Gyrovirus Anemia infecciosa de los pollos Parvovirus Parvovirus canino y felino Erythrovirus Virus B19 Parvoviridae Icosahédrica; Dependovirus Virus 2 Adeno-asociado Parvovirinae Virus ADMVlike Virus de la enfermedad del visón de las Aleutianas Virus BPV-like Parvovirus bovino Familia Poxviridae Herpesviridae Simetría de la cápside y tamaño del virión (nm) Compleja; a Icosaédrica; Virus de ADN de cadena doble Subfamilia Cordopoxvirinae Alfaherpes-virinae Géneros Orthopoxvirus Parapoxvirus Avipoxvirus Capripoxvirus Leporipoxvirus Suipoxvirus Molluscipox-virus Yatapoxvirus Simplexvirus Varicellovirus Especies representativas Virus de la vacuna de la viruela Orf virus Virus de la viruela aviar Virus de la viruela de la oveja Virus del myxoma Virus de la viruela del cerdo Virus del molusco contagioso Virus tumoral del mono de Yaba Herpesvirus humano 1 Herpesvirus humano 3 Marek s disease-like Gallid herpesvirus 2

9 Familia Virus de ADN de cadena doble Simetría de la cápside y Especies Subfamilia Géneros tamaño del representativas virión (nm) viruses Infectious laryngotracheitis-like viruses Gallid herpesvirus 1 Herpesvirus Cytomegalovirus humano 5 Betaherpesvirinae Cytomegalovirus Muromegalovirus murino 1 Herpesvirus Roseolovirus humano 6 Lymphocryptovirus Virus Epstein-Barr Gammaherpesvirinae Rhadinovirus Herpesvirus ovino 2 Icosaédrica; 40- Polyomaviridae 45 Icosaédrica; 52- Papillomaviridae 55 Adenoviridae Asfarviridae Iridoviridae Icosaédrica; Compleja; Polyomavirus Virus SV 40 Papillomavirus Mastadenovirus Aviadenovirus Atadenovirus Siadenovirus Asfivirus Icosaédrica; Lymphocystisvirus Papilomavirus bovino 1 Adenovirus bovino Adenovirus aviar A Adenovirus ovino D Virus de la enteritis hemorrágica del pavo Virus de la fiebre africana de los cerdos Ranavirus Virus de las ranas 3 Virus de la enfermedad linfocistica 1 Virus de ADN y ARN con transcriptasa reversa Simetría de la cápside Familia y tamaño del virión Subfamilia Géneros Especies representativas (nm) Orthohepadnavirus Virus de la hepatitis B Hepadnaviridae Icosaédrica; Virus de la hepatitis B de Avihepadnavirus los patos Retroviridae Icosaédrica; Alpharetrovirus Virus de la leucosis aviar Betaretrovirus Virus del adenocarcinoma pulmonar ovino Gammaretrovirus Virus de la leucemia

10 Familia Virus de ADN y ARN con transcriptasa reversa Simetría de la cápside y tamaño del virión Subfamilia Géneros Especies representativas (nm) felina Deltaretrovirus Virus de la leucemia bovina Epsilonretrovirus Virus del sarcoma dérmico de Walley Lentivirus Virus de la inmunodeficiencia felina Spumavirus Virus espumoso de los bóvidos Virus de ARN de cadena doble Familia Simetría de la cápside y tamaño del virión (nm) Subfamilia Géneros Especies representativas Orthoreovirus Ortoreovirus de los mamíferos Virus de la (enfermedad de) Obivirus la lengua azul Reoviridae Icosaédrica; Rotavirus Rotavirus A Coltivirus Virus de la fiebre de garrapatas de Colorado Aquareovirus Aquareovirus A Birnaviridae Icosaédrica; Virus de la necrosis Aquabirnavirus pancreática infecciosa Virus de la infección de la Avibirnavirus bolsa de Fabricio Familia Paramyxoviridae Virus RNA de cadena sencilla, sentido negativo Simetría de la cápside y tamaño Subfamilia Géneros del virión (nm) Helicoidal; Respirovirus a ,000 Rubulavirus Paramyxovirinae Morbillivirus Pneumovirinae Henipavirus Avulavirus Pneumovirus Especies representativas Virus de la influenza bovina 3 Rubulavirus porcino; Virus de las paperas Virus del moquillo canino; virus del sarampión Virus Hendra Virus de la enfermedad de Newcastle Virus sincitial respiratorio bovina

11 Familia Rhabdoviridae Orthomyxoviridae Bunyaviridae Bornaviridae Virus RNA de cadena sencilla, sentido negativo Simetría de la Especies cápside y tamaño Subfamilia Géneros representativas del virión (nm) Metapneumovirus Pneumovirus aviar Vesiculovirus Virus de la estomatitis vesicular de Indiana Helicoidal; Lyssavirus Virus de la rabia a Ephemerovirus Helicoidal; hasta 2000 Helicoidal; Icosaédrica; Arenaviridae Helicoidal; Filoviridae Helicoidal; 80 a 1400 Novirhabdovirus Influenzavirus A Influenzavirus B Influenzavirus C Thogotovirus Isavirus Orthobunyavirus Hantavirus Nairovirus Phlebovirus Bornavirus Arenavirus Deltavirus Virus de la fiebre efímera bovina Virus de la hematopoyesis necrótica infecciosa Virus de la influenza tipo A Virus de la influenza tipo B Virus de la influenza tipo C Virus Thogoto Virus de la anemia infecciosa del salmón Virus de Akabane Virus Hantaan Virus de la enfermedad de las ovejas de Nairobi Virus de la fiebre del valle de Rift Virus de la enfermedad de Borna Virus de la coriomeningitis linfocítica Virus de la hepatitis humana D Marburg-like Virus de Marburg viruses Ebola-like viruses Virus del Ébola Virus RNA de cadena sencilla, sentido positivo Familia Simetría de la cápside y Subfamilia tamaño del virión (nm) Géneros Especies representativas Picornaviridae Icosaédrica; Enterovirus Virus de la polio Rhinovirus Rinovirus humano A

12 Virus RNA de cadena sencilla, sentido positivo Familia Simetría de la cápside y Subfamilia tamaño del virión (nm) Géneros Especies representativas Cardiovirus Virus de la encefalomiocarditis Aphthovirus Virus de la fiebre aftosa Hepatovirus Virus de la hepatitis A Parechovirus Parechovirus humano Erbovirus Virus de la rinitis equina B Kobuvirus Virus Aichi Teschovirus Teschovirus porcino Lagovirus Virus de la enfermedad hemorrágica de los conejos Calciviridae Icosaédrica; Norovirus Virus Norwalk Sapovirus Calicivirus porcino Vesivirus Virus del exantema vesicular porcino Astroviridae Icosaédrica; Mamastrovirus Astrovirus humano Avastrovirus Astrovirus del pavo Virus de la bronquitis Coronavirus Coronaviridae Helicoidal; infecciosa Torovirus Torovirus equino Arteriviridae Icosaédrica; Arterivirus Virus de la arteritis equina Togaviridae Icosaédrica; 70 Alphavirus Virus Sindibis Rubivirus Virus de la rubeola Flavivirus Virus de la fiebre amarilla Flaviviridae Icosaédrica; Pestivirus Virus de la diarrea viral bovina 1 Hepacivirus Virus de la hepatitis C Nodaviridae Icosaédrica; Virus nervioso de la necrosis Betanodavirus del gato rayado Partículas atípicas asociadas con infecciones Virus defectuosos Los virus defectuosos son aquellos cuyo genoma carece de un gen o genes específicos, debido a mutación o deleción. Como resultado de lo anterior, los virus defectuosos no son capaces de llevar a cabo un ciclo de vida productivo en las células. Sin embargo, si la célula infectada con el virus defectuoso está co-infectada con un "virus ayudante" el producto del gen que carece el virus defectuoso es complementado por el virus ayudante, y el virus defectuoso puede replicarse. Es interesante que, para algunos virus, durante la infección se produce una mayor cantidad de viriones defectuosos que de viriones infecciosos (tanto como 100:1). La producción de partículas defectuosas es característica de algunas especies virales y se cree que modera la severidad de la

13 infección/enfermedad in vivo. Los virusoides, que son ejemplo de virus defectuosos, se discutirán más adelante en esta sección. Pseudoviriones Los pseudoviriones pueden ser producidos durante la replicación viral cuando el genoma del hospedero se fragmenta. Como resultado de este proceso algunos fragmentos del ADN del hospedero se incorporan en la cápside en lugar del ADN viral. Entonces, los pseudoviriones poseen la cápside viral a la cual los anticuerpos pueden unirse y facilitar el anclaje y penetración en la célula hospedera, pero no pueden replicarse una vez que logran el acceso a la célula, debido a que no tienen ninguno de los genes virales esenciales para el proceso de replicación. Priones Aunque no son virales, los priones son partículas proteicas infecciosas asociadas con encefalopatías espongiformes transmisibles (TSE por sus siglas en inglés) de humanos y de animales. TSE incluye la enfermedad de Creutzfeldt-Jacob en humanos, "scrapie" en ovejas y encefalopatía espongiforme bovina. Priones y TSEs en animales se discuten detalladamente en el capítulo 29. En el análisis a la necropsia, el cerebro presenta grandes vacuolas en las regiones de la corteza y del cerebelo, por lo que la enfermedad causada por priones se llaman "encefalopatías espongiformes". Una examinación más detallada del tejido cerebral revela la acumulación de fibrillas y placas amiloideas asociadas con proteínas de priones. Estas enfermedades se caracterizan por la pérdida del control motor, demencia, parálisis, desgaste y eventualmente la muerte. Los detalles de la patogenia son en su mayoría desconocidos. Viroides Los viroides son ácidos nucleicos de bajo peso molecular, desnudos, extremadamente resistentes al calor, a la radiación ultravioleta y la radiación ionizante. Estas partículas se componen exclusivamente de una pieza de ARN circular de cadena sencilla, con algunas regiones de cadena doble. Los viroides causan en su mayoría enfermedades de plantas, como la enfermedad del tubérculo ahusado de la papa. Virusoides Los virusoides (también llamados ARN satélites) son similares a los viroides en el sentido de que son ácidos nucleicos desnudos, de bajo peso molecular, extremadamente resistentes al calor y a las radiaciones ultravioletas y ionizantes. Sin embargo, dependen de un virus ayudante para la replicación. Los virusoides se replican en el citoplasma de la célula a través de una polimerasa ARN dependiente de ARN. Nueva familia viral - Mimiviridae Mimiviridae es una familia viral que contiene un miembro, Mimivirus. El nombre de Mimivirus se deriva de "microbio imitador". Fue descubierto en 1992 dentro de un protozoario y, a la fecha, es el virus conocido de mayor tamaño, alrededor de 400 nm de diámetro. La cápside es de forma icosahédrica, el virión carece de envoltura y su

14 genoma es de ADN circular de cadena doble (dsadn), de 1.2 Mb de longitud y con 1,260 genes. La secuencia del genoma de Mimivirus fue publicada en el año Glosario Bacteriófago: Un virus que infecta células procariontes y tiene muchos de los atributos de los virus de plantas y animales. Requiere una bacteria viva para llevar a cabo su ciclo reproductivo. Protrusión de yemas: A través de este proceso los virus envueltos adquieren su envoltura. Es precedido por la inserción de glicoproteínas virus-específicas en la membrana celular del hospedero. Este proceso ocurre más frecuentemente en la membrana plasmática y confiere infectividad. Mucopolisacárido: Una clase de polisacárido (glucoaminoglicanos) como heparina, ácido hialurónico y sulfato de condroitina, que absorben agua para formar un material espeso mucoide, gelatinoso. Oligosacárido: Una azúcar que contiene un número pequeño y conocido de unidades de monosacáridos. Derechos Reservados. Este documento está disponible en Documento No. A ES Cultivo y caracterización de virus D.J. Wise 1 and G.R. Carter 2 1 Department of Biology, Concord University, Athens, West Virginia, USA. 2 Virginia- Maryland Regional College of Veterinary Medicine, Virginia Tech, Blacksburg, Virginia, USA. Traducido por: A. T. Pérez Méndez, Biotecnología Veterinaria de Puebla, S.A de C.V., Tehuacán, Puebla, Mexico. (21-Apr-2005). Indice Métodos de propagación viral Concentración y purificación de virus Infectividad y almacenamiento Visualización de virus Cuantificación directa de virus Cuantificación indirecta de virus Métodos misceláneos usados para caracterización Glosario Se han desarrollado métodos para el almacenamiento, visualización, cuantificación (directa e indirecta) y propagación de virus. También hay métodos para el diagnóstico

15 de laboratorio de enfermedades virales, muchos de los cuales son métodos serológicos, basados en la detección de la respuesta del hospedero a la infección. Estos métodos diagnósticos serán discutidos en el capítulo 7. A lo largo del tiempo, fue posible observar que el contagio de ciertas enfermedades era capaz de pasar a través de filtros que las bacterias no podían pasar. Los filtrados obtenidos no eran capaces de crecer en medios de cultivos para bacterias, y eventualmente se demostró experimentalmente que eran infectivos y que contenían virus. A excepción de los virus de viruela, los virus no pueden ser observados con microscopio óptico. Eventualmente los virus fueron observados con microscopio electrónico. Algunos de los métodos importantes usados en los estudios básicos de virus se describen a continuación. Tal como se mencionó en el capítulo anterior, los virus animales presentan una considerable diversidad en sus características físicas. La característica que más refleja las propiedades del virión es la presencia o ausencia de la envoltura viral. Como se señala en la tabla 2.1, los virus no envueltos son, en general, sensibles a la radiación ultravioleta, relativamente termoestables y susceptibles al daño por los cristales de hielo. Debido principalmente a la presencia de la envoltura de membrana, los virus envueltos se inactivan con solventes lipídicos (como cloroformo y éter) y detergentes (como el desoxicolato), son sensibles a la radiación gama y ultravioleta, relativamente termolábiles y el daño que les produce la formación de cristales de hielo es más extenso que el que se produce en los virus no envueltos o desnudos. Tabla 2.1. Principales propiedades fisicoquímicas y biológicas de viriones envueltos y desnudos Características Virus desnudos Virus envueltos Radiación ultravioleta Sensible Sensible Radiación gama Sensible Sensible Termoestabilidad Termoestable Termolábil Susceptibilidad a daño por cristales de hielo Si Extenso Inactivación por solventes lipídicos y detergentes No Si Métodos de propagación viral Para aislar, caracterizar e identificar virus, así como para producir vacunas virales, se necesita una cantidad considerable de partículas virales. Esto se logra a través de diferentes métodos de propagación, los cuales se enlistan a continuación: Hospederos animales En el pasado, la propagación de virus en organismos hospederos susceptibles no infectados era la única manera de obtener grandes cantidades de virus. Actualmente el uso de animales experimentales como hospederos para propagación viral está limitado por razones éticas. La propagación viral en animales es más útil para aquellos virus que

16 no crecen fácilmente en cultivos celulares. Por ejemplo: cepas vacunales del virus de la enteritis hemorrágica de pavo pueden ser propagadas tanto en aves vivas como en cultivos celulares. Sin embargo los productos propagados en bazo (de aves vivas) parecen ser más usados que los propagados en cultivo. Para fines diagnósticos la inoculación de animales es un medio para detectar virus en muestras clínicas, como el virus de la rabia en ratones lactantes. Huevos embrionados Antes del desarrollo de las técnicas de cultivo de células y de tejidos, el uso de huevo embrionado para propagación viral fue una de las primeras alternativas al uso de organismos animales hospederos. El huevo embrionado es aún el método preferido para la propagación de virus de influenza tipo A y para muchos otros virus aviares. El huevo embrionado también es útil en la diferenciación de algunos virus que producen lesiones similares, como los virus de la viruela de la vaca y los virus de la pseudo viruela de la vaca. Aunque el virus de la enfermedad de la lengua azul (BTV) es un virus de mamíferos, se replica bien en huevo embrionado, por lo que este sistema se usa para propagación viral con fines diagnósticos y de investigación. Cuando se usa huevo embrionado, uno debe considerar la posible presencia de anticuerpos maternos (IgY) en el saco vitelino del huevo. Por lo tanto, frecuentemente es preferible obtener huevo embrionado de parvadas libres de patógenos específicos (SPF). El dar pases en embrión de pollos es útil en la atenuación de ciertos virus para vacunas de virus vivo modificado. Cultivo de células/tejidos El cultivo de tejidos se refiere al crecimiento y mantenimiento de células de tejidos vivos in vitro. Hay básicamente dos tipos: cultivo de explantes y cultivo de células. Los explantes son pequeños fragmentos de tejidos del hospedero que se mantienen en cultivo, mientras que el cultivo de células se obtiene mediante de la disgregación de diferentes tejidos del hospedero en células individuales. La mayoría de los sistemas usados en virología son en realidad cultivos celulares y no cultivos de tejidos, aunque ambos términos se usan de manera indistinta. Los cultivos celulares se subdividen a su vez en cultivos primarios, cultivos semi-continuos y cultivos continuos. Figura 2-1. Cultivo celular normal. Cortesía de A. Wayne Roberts. Para ver oprima la figura Cultivo de explantes Estos son cultivos de pequeños fragmentos de tejidos específicos, tomados directamente del hospedero animal. Los cultivos de explantes son útiles para el aislamiento viral y se requieren para el aislamiento de algunos coronavirus. La demostración de latencia de

17 algunos alfa herpesvirus humanos y animales puede requerir explantes de ganglio nervioso sensitivo (por ejemplo, trigémino). Cultivos celulares primarios Estos se derivan de tejidos frescos que han sido digeridos enzimáticamente con tripsina u otras proteasas, para liberar células individuales. Como resultado, con frecuencia los cultivos primarios están compuestos de muchos tipos celulares diferentes. En condiciones in vitro las células de los cultivos primarios raramente pueden dividirse, o se dividen a una velocidad muy baja. Es por esto que tienen un tiempo de vida limitado, conocido como límite de Hayflick. A pesar del tiempo de vida limitado de los cultivos primarios, son ideales para el aislamiento de algunos virus. Los cultivos primarios raramente sobreviven más allá del vigésimo pase in vitro. Cultivos semi-continuos Son también conocidos como líneas celulares diploides, debido a que contienen el cromosoma diploide normal característico de la especie de la que ellos se derivan. Los cultivos semi-continuos son cultivos primarios que tienen algunas células que pueden ser cuidadas para sobrevivir más allá del límite de Hayflick. Los cultivos semicontinuos tienden a morir entre el 30 y el 50 pase in vitro. A pesar de esta limitante, los cultivos semi-continuos son útiles en la propagación de una gran variedad de virus. Los cultivos semi-continuos son por lo general de fibroblastos. Cultivos celulares continuos Se les conoce también como líneas celulares heterodiploides, debido a que poseen un número anormal de cromosomas. Estos cultivos se derivan de tejidos normales o neoplásicos y se caracterizan por su habilidad para ser propagados in vitro indefinidamente. De manera general, las líneas celulares continuas no son tan sensibles como las otras para propagación viral. Sin embargo, facilitan la propagación a gran escala de algunos virus para vacunas e investigación. Muchas líneas continuas están disponibles de proveedores como la Colección Americana de Cultivos Tipo (ATCC por sus siglas en inglés). La mayoría de los laboratorios de virología almacenan en congelación alícuotas iniciales de sus cultivos continuos, debido a que las líneas celulares que están continuamente en cultivo pueden sufrir cambios en sus características celulares. Las causas de estos cambios pueden ser infección por Micoplasma spp., o virus contaminantes (por ejemplo, circovirus porcino y virus de la diarrea viral bovina). Concentración y purificación de virus Una vez que un virus ha sido propagado adecuadamente, necesita ser recuperado de las células hospederas y los restos de éstas, y luego ser purificado. Esto se logra por varios procesos que involucran centrifugación diferencial (a diferentes velocidades), diálisis, precipitación, cromatografía y gradientes de densidad. El paso inicial de este proceso es la centrifugación diferencial; se usa una velocidad baja (~2,000 x g) para quitar restos celulares y a para concentrar se usa a continuación, en el caso de volúmenes pequeños, una velocidad alta de centrifugación (40K a 80K x g) y en el caso de volúmenes mayores, se usa diálisis y precipitación o precipitación con metanol frío (-70 C) o con

18 polietilenglicol. La purificación se lleva a cabo mediante cromatografía o centrifugación usando gradientes de densidad. Los virus envueltos pueden ser purificados aprovechando su velocidad de sedimentación en gradientes de sacarosa. Los virus desnudos pueden ser purificados por centrifugación a través de gradientes de cloruro de cesio. Infectividad y almacenamiento Infectividad La infectividad es la habilidad de la partícula viral para infectar una célula hospedera. La temperatura en el exterior de la célula hospedera afecta fácilmente la capacidad del virus para conservar su infectividad, particularmente en el caso de los virus envueltos. Debido a que los virus no tienen actividad metabólica propia, la infectividad es el mejor medio para evaluar la integridad de la partícula viral después de que se ha expuesto a cierta temperatura. Las siguientes son consideraciones importantes al respecto: A 60 C, la infectividad del virus disminuirá rápidamente, en segundos. A 37 C, la infectividad disminuirá dramáticamente, en minutos. A 20 C, la infectividad disminuirá, en cuestión de horas. La infectividad en las temperaturas antes mencionadas influyen en la transmisión del virus por contacto directo (a 37 C) y por fomites (a 20 C). A 4 C, la infectividad en tejidos se pierde en cuestión de días. Los clínicos deben tener esto en cuenta al considerar los especímenes clínicos. Con frecuencia se usan temperaturas abajo del punto de congelación para almacenamientos por periodos largos. Lo importante a considerar es mantener al mínimo la formación de cristales de hielo. Debe mantenerse en mente el hecho de que los virus presentan gran diversidad en su resistencia y labilidad Algunos son capaces de sobrevivir por horas, días, o incluso meses bajo condiciones ambientales, mientras que otros se inactivan en pocos minutos bajo las mismas condiciones. Los tres métodos principales para almacenar virus son: Congelación a -70 C, con o sin criopreservante. Para almacenamiento por largos periodos: congelamiento en nitrógeno líquido (- 196 C). Liofilización con almacenamiento en congelación o a temperatura ambiente. Visualización de los virus Los dos métodos principales usados para visualizar la estructura / morfología de los virus son: la microscopía electrónica y la microscopía de fuerza atómica. Otros tipos de microscopía se usan para observar cambios inducidos por la replicación viral en las células infectadas. Sin un medio para visualizar los virus es difícil obtener información acerca de la estructura o las interacciones célula-virus. Más aún, el visualizar las partículas virales le permite a uno estimar directamente el número de partículas (virales) presentes en una suspensión. Hay otros métodos que le permiten a uno estimar el número de virus indirectamente. En cualquier caso, la cuantificación directa o indirecta

19 es siempre un estimado. Este estimado numérico es importante al preparar vacunas, al determinar el número mínimo de viriones necesarios para producir una enfermedad y en procedimientos virales de investigación. Microscopía óptica Si bien la microscopía óptica no es útil para la examinación directa de los virus (con excepción de los virus de la viruela), es útil para observar los efectos de la infección viral en la célula hospedera. El daño celular o la destrucción causada por el virus es conocida como efecto citopático (CPE por sus siglas en inglés). Los efectos citopáticos que pueden observarse incluyen: 1. Células redondeadas y agregados en forma de racimo de uvas, como se observa con adenovirus; 2. Células redondeadas, encogidas, lisadas, dejando gran cantidad de restos celulares, como se observa con los enterovirus; 3. Células agrandadas y redondeadas en áreas focales, como con herpesvirus; y 4. Fusión de células que se convierten en células multinucleadas (sinsicios) como en el caso de paramyxovirus. Además es posible observar cuerpos de inclusión, característicos de algunos virus. Figura 2-2. Efecto citopático del herpes virus "lento" equino. Cortesía de A. Wayne Roberts. Para ver oprima la figura Microscopía de fluorescencia La microscopía de fluorescencia puede ser usada para visualizar células o tejidos infectados por virus, usando anticuerpos antígeno-específicos marcados con fluorocromos. El anticuerpo se une específicamente a los antígenos virales presentes dentro de las células o tejidos y los marca con la molécula fluorescente (generalmente fluoresceína). La marca fluorescente se observa posteriormente con un microscopio de luz ultravioleta que excita a la molécula del fluorocromo, lo que uno observa como una zona coloreada sobre un fondo relativamente oscuro. De manera alternativa, la visualización puede llevarse a cabo de forma indirecta usando anticuerpos sin marca (como los de sueros convalecientes) seguidos de la aplicación de anticuerpos marcados con fluoresceína que se unen al primer anticuerpo. Los ensayos basados en el uso de anticuerpos fluorescentes son usados comúnmente en el diagnóstico viral y la investigación. Microscopía electrónica La microscopía electrónica involucra la aceleración de electrones a un estado de alta energía y el enfoque magnético de los mismos hacia la muestra. Los electrones de alta

20 energía tienen longitudes de onda muy cortas, proporcionando así una mejor resolución de estructuras muy pequeñas. La microscopía electrónica tiene suficiente poder de resolución para observar polímeros grandes como ADN y ARN, así como proteínas grandes. Para facilitar la visualización, las muestras pueden ser cubiertas con metales pesados como osmio, antes de la examinación con el microscopio electrónico. Los electrones impactan el metal pesado y posteriormente son visualizados en una pantalla fluorescente. La microscopía electrónica proporciona imágenes tridimensionales de viriones y de su localización (nuclear o citoplasmática) dentro de la célula hospedera en un momento dado durante la infección. La observación de viriones en células vivas no es posible, debido a que las muestras tienen que ser tratadas con metales pesados. Microscopía de fuerza atómica La microscopía de fuerza atómica trabaja a través de la medición de una propiedad local (tal como altura, absorción óptica, magnetismo, etc.) de una sonda puesta muy cerca de la muestra. Esto hace posible tomar mediciones en un área muy pequeña de la muestra. Los electrones son capaces de "atravesar por túnel" entre los átomos, provocando una fuerza pequeña pero cuantificable. El resultado de estas mediciones es un mapa detallado del contorno o la superficie de la estructura. La ventaja de la microscopía de fuerza atómica es que la preparación de la muestra es mínima y pueden usarse especímenes vivos. Este método ha sido útil para obtener imágenes detalladas de estructuras de cápsides y de interacciones virus-célula. Microscopía inmunoelectrónica Esta técnica permite la visualización de complejos antígeno / anticuerpo que son específicos para un virus en particular. En este método se obtienen cortes ultra finos (de la muestra) y se incuban con un anticuerpo específico para el virus. Después de un paso de lavado, el corte se incuba con Proteína A conjugada con partículas de oro (de un rango de 5 a 20 nm). Este conjugado se une a la porción Fc del anticuerpo y se detecta por microscopía electrónica. Enumeración directa de virus Estimar el número de virus tiene una cantidad importante de usos, incluyendo producción de vacunas e investigación. La microscopía electrónica se usa para cuantificar las partículas virales en una solución libre de células. Se examina un volumen conocido de la muestra y se cuenta el número de viriones. Este número se usa para calcular el número de virus. Una limitante es que las cápsides vacías, es decir, partículas no infectantes, también son contadas. En investigación, se compara el número de partículas infectantes y el número total, y se establece una relación de partículas totales / partículas infecciosas para un virus dado. Enumeración indirecta de virus Los métodos indirectos de cuantificación viral son aquellos que usan factores asociados con la infectividad (actividad biológica). Los tres métodos principales usados para determinar indirectamente concentraciones virales son: ensayos de hemoaglutinación, ensayos de formación de placas y el método de la dilución limitante.