UNIVERSIDAD PEDAGOGICA Y TECNOLOGICA DE COLOMBIA FITOPATOLOGIA GENERAL GUIA PARA LA OBSERVACION MICROSCOPICA DE HONGOS FITOPATÓGENOS

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1 UNIVERSIDAD PEDAGOGICA Y TECNOLOGICA DE COLOMBIA FITOPATOLOGIA GENERAL GUIA PARA LA OBSERVACION MICROSCOPICA DE HONGOS FITOPATÓGENOS INTRODUCCIÓN. Para el diagnóstico y estudio de enfermedades, en la mayoría de los casos es necesario aislar y/o cultivar el patógeno a fin de identificarlo o conocer parte de sus estructuras. Una práctica muy útil es la observación del agente causal en preparaciones microscópicas tomadas directamente del material enfermo o del aislamiento del patógeno. El procedimiento que a continuación se describe fue tomado y adaptado de la Guía práctica para la identificación de algunas enfermedades de trigo y cebada, elaborada en México para 2005, por Gilchrist y colaboradores en el Centro Internacional de Mejoramiento de Maíz y Trigo (CIMMYT ) ( Montaje de preparaciones. Coloque la muestra del patógeno o estructuras del mismo en estudio en un portaobjetos limpio, sobre una gota de solución de montaje que debe ser, de preferencia, agua destilada estéril o un colorante para la tinción de las estructuras fungosas que se desean observar con mayor contraste. Entre los colorantes más comunes se encuentran el lactofenol y la safranina, entre otros. La obtención de una preparación puede realizarse de diferentes formas dependiendo del material de que se trate y del patógeno en estudio: Si el material vegetal presenta un aspecto algodonoso o indicios de estructuras del patógeno (signos) visibles a simple vista, se debe tomar la muestra con una aguja de disección o con la punta de una navaja o cuchilla de bisturí, raspando ligeramente el tejido enfermo. Luego colocar cuidadosamente este raspado sobre el portaobjetos dentro de la gota de agua o colorante según sea el caso. Cubrir suavemente con un cubreobjetos con la ayuda de una aguja procurando que no queden burbujas de aire. Para lograr este objetivo, ponga la aguja debajo del cubreobjetos y retírela suavemente de tal forma que se eliminen las burbujas de aire durante el proceso. Tomado de: Gilchrist et al, (2005)

2 a) Tomar la muestra con una aguja de disección o con la punta de una navaja o cuchilla de bisturí, raspando ligeramente el tejido enfermo, tomándolo tanto del cultivo o de la parte afectada de la planta donde este se manifiesta. Tomado de: Gilchrist et al, (2005) b) Colocar cuidadosamente este raspado sobre el portaobjetos dentro de la gota de agua o colorante. c) Cubrir suavemente con un cubreobjetos con la ayuda de una aguja procurando que no queden burbujas de aire. Se utiliza cinta transparente para hacer preparaciones rápidas no permanentes a partir de crecimientos en medio de cultivo o en estructuras de las plantas (frutos, hojas, tallos). Este método se recomienda para observar las estructuras en su estado y posición normales (cadenas de esporas o conidios pegados al conidióforo), lo cual generalmente es muy difícil de lograr con las preparaciones antes descritas, ya que las estructuras se separan al ser tomadas con la aguja. Se debe tomar un pedazo de cinta transparente y, con el lado que tiene el pegamento, tocar ligeramente la muestra o el cultivo de la caja Petri o del tejido enfermo, enseguida colocarlo sobre una gota de agua estéril en un portaobjetos.

3 d) Tomar un pedazo de cinta transparente y, con el lado que tiene el pegamento, tocar ligeramente la muestra. e) Coloque la cinta con la muestra o estructuras sobre una gota de agua estéril en un portaobjetos. f) Fije la cinta al portaobjetos y retire el exceso de agua o colorante. Cuando se desea hacer observaciones más detalladas (por ejemplo, de estructuras dentro del tejido enfermo), tomar la muestra y hacer cortes finos con la ayuda de una cuchilla de afeitar o un bisturí. En el caso de hojas, tallos, tubérculos, raíces, entre otros, la estructura puede ser colocada entre los dedos con la punta sobresaliendo un poco.

4 Los cortes obtenidos de esta forma son tanto o más finos que los efectuados con un micrótomo, instrumento diseñado para este propósito pero que, generalmente no está disponible. Paso a seguir colocar los cortes obtenidos en la gota de la solución de montaje. Cuando se trata de tejido más suave y flexible, se puede utilizar como sostén un trozo de madera o una zanahoria partida longitudinalmente y de igual forma con la punta de la muestra saliendo hacia arriba (permite sostener el material de estudio) se realizan los cortes lo más fino posible. Con esta técnica se pueden obtener cortes de estructuras fungosas (picnidios, peritecios, entre otros) claras y completas, así como también una imagen más clara en tejidos obscuros por naturaleza. g) Para realizar cortes de tejido más suave y flexible, se puede utilizar como sostén un trozo de madera y generando presión se ejecuta el corte con la mayor precisión posible. h) Cuando se trata de tejido más suave y flexible, se puede utilizar como sostén un trozo de zanahoria partida longitudinalmente y de igual forma con la punta de la muestra saliendo hacia arriba (permite sostener el material de estudio) se realizan los cortes lo más fino posible.

5 Una vez colocada la muestra en la gota de la solución de montaje, utilizar una aguja de disección para acomodar el patógeno o estructura como se desee. Enseguida se coloca el cubreobjetos con la ayuda de la aguja, comenzando por un extremo, dejándolo caer cuidadosamente y asegurándose que el corte esté completamente cubierto y que no queden burbujas de aire ya que distorsionan la imagen. Es común que las personas de poca experiencia confundan las burbujas con estructuras morfológicas del patógeno. Si fuera necesario, presionar suavemente para eliminar el exceso de solución y luego absorberlo con papel filtro o papel secante. Manteniendo siempre tanto el cubre objetos como el portaobjetos limpios. Para realizar preparaciones semipermanentes, se fija la muestra pasando el portaobjetos por encima de una flama por algunos segundos, hasta ver hervir la gota de agua o de colorante (para eliminar las burbujas de aire); con papel filtro, eliminar el exceso fuera del área del cubreobjetos. Para sellar la muestra, se pone esmalte de uñas transparente en las cuatro orillas del cubreobjetos y se deja secar, esto solo garantiza la visibilidad de la o las estructuras de manera transitoria o semipermanente es decir por poco tiempo ya que el patógeno no cuenta con un medio de alimentación para su sobrevivencia (Gilchrist, et al. 2005).

6 REFERENCIAS Agrios G. N Fitopatología. Segunda edición, quinta reimpresión. Ed. Limusa Grupo. Noriega Editores. México. 838 p. Agrios, G.N, 2005, fitopatología, 2da edición. México, Limusa, 952 p. Arauz. C. L, F Fitopatología, un enfoque agroecológico. Universidad de Costa Rica. 467 p. Gilchrist. S, L., G; Fuentes. D, C; Martínez, C, R. M; López, A, E; Duveiller, R. P; Singh, M. Henry e I. García A Guía práctica para la identificación de algunas enfermedades de trigo y cebada. Segunda edición. México, D.F.: CIMMYT. Duran. Q. J. A Enfermedades y otros problemas de las plantas, reconocimiento de campo. 1. Ed. San José de Costa Rica. Editorial de la Universidad de Costa Rica. 256 p. Urbina. C. M Enfermedades causadas por hongos, fitopatología general, Universidad agropecuaria del trópico seco, Estelli, 2 p.