UNIVERSIDAD AUSTRAL DE CHILE FACULTAD DE CIENCIAS AGRARIAS

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1 UNIVERSIDAD AUSTRAL DE CHILE FACULTAD DE CIENCIAS AGRARIAS DETERMINACIÓN DE LA PRESENCIA DE UN FACTOR INDUCTOR DE OVULACIÓN EN EL PLASMA SEMINAL DE CONEJO TESIS DE MAGÍSTER MARIA ALEXANDRA NIÑO QUINTERO VALDIVIA CHILE 2010

2 DETERMINACIÓN DE LA PRESENCIA DE UN FACTOR INDUCTOR DE OVULACIÓN EN EL PLASMA SEMINAL DE CONEJO Tesis presentada a la Facultad de Ciencias Agrarias de la Universidad Austral de Chile en cumplimiento parcial de los requisitos para optar al grado de Magíster en Ciencias Mención Producción Animal Por MARÍA ALEXANDRA NIÑO QUINTERO VALDIVIA CHILE 2010

3 Universidad Austral de Chile Facultad de Ciencias Agrarias INFORME DE APROBACIÓN DE TESIS DE MAGÍSTER La Comisión Evaluadora de Tesis comunica al Director de la Escuela de graduados de la Facultad de Ciencias Agrarias que la Tesis de Magíster presentada por la candidata MARIA ALEXANDRA NIÑO QUINTERO Ha sido aprobada en el examen de defensa de Tesis rendido el día 2 de diciembre del 2010 como requisito para optar el grado de Magíster en Ciencias Mención Producción Animal y, para que así conste para todos los efectos firman: Profesor Patrocinante Marcelo Ratto F. M.V.; M.Sc.; PhD. Comisión Evaluadora Claudia Letelier V. M.V.; M.Sc.; Endocrinol. Dr.V.. Ximena Valderrama L. Ing. Agr., M.Sc.;PhD.

4 DECLARACIÓN Yo, María Alexandra Niño Quintero, declaro que soy la autora del presente trabajo, que lo he realizado en su integridad y no lo he publicado para obtener otros Grados o Títulos

5 INDICE DE CONTENIDOS Capítulo Página RESUMEN 1 ABSTRACT 2 1 INTRODUCCIÓN GENERAL 3 2 REVISION DE LITERATURA MECANISMO DE OVULACIÓN EN LAS ESPECIES 8 MAMÍFERAS Ovulación espontánea en Ovuladores reflejos Mecanismo de ovulación en Ovuladores inducidos Ovulación en camélidos Sudamericanos Ovulación en conejas FACTOR INDUCTOR DE OVULACIÓN (FIO) 16 3 DETERMINACIÓN DE LA PRESENCIA DE UN FACTOR 19 INDUCTOR DE OVULACIÓN EN EL PLASMA SEMINAL DE CONEJO ABSTRACT 20 RESUMEN INTRODUCCIÓN MATERIALES Y MÉTODOS Experimento Experimento Experimento Análisis estadísticos RESULTADOS Experimento Experimento 2 37

6 3.3.3 Experimento DISCUSIÓN CONCLUSIONES REFERENCIAS 51 4 DISCUSIÓN GENERAL 58 5 CONCLUSIONES GENERALES 62 6 REFERENCIAS GENERALES 64 ANEXOS 70

7 INDICE DE TABLAS Tabla 3.1 Efecto de la administración Intramuscular de Plasma seminal de Llama (PSLL), Plasma seminal de conejo (PSC) y fosfato buffer salino (PBS) sobre la ovulación y formación del Cuerpo lúteo (CL) en llamas. (experimento 1) 3.2 Efecto de la administración Intramuscular de Plasma seminal de Llama (PSLL), Plasma seminal de conejo (PSC) y fosfato buffer salino (PBS) sobre la ovulación y el desarrollo luteal (CL) en llamas. (experimento 1) 3.3 Efecto de la administración intramuscular de Plasma seminal de llama (PSLL), plasma seminal de conejo (PSC), GnRH (acetato de Gonadorelina) y fosfato buffer salino (PBS) sobre la ovulación y desarrollo folicular en conejas (experimento 2). Página

8 ÍNDICE DE FIGURAS Figura 3.1 Concentración de LH en plasma (promedio ± EE) en hembras llama después del tratamiento intramuscular de Plasma seminal de conejo (PSC), plasma seminal de llama (PSLL) y fosfato buffer salino (PBS) (experimento 1) 3.2 Diámetro del Cuerpo luteo en hembras llama tratadas intramuscular con plasma seminal de llama (PSLL) y plasma seminal de conejo (PSC). (experimento 1) 3.3 Concentración de progesterona en plasma (promedio ± EE) de llamas hembras después de la administración intramuscular con plasma seminal de llama (PSLL), plasma seminal de conejo (PSC) y fosfato buffer salino (PBS). (experimento 1) 3.4 Efecto de la administración intramuscular de Plasma seminal de llama (PSLL), plasma seminal de conejo (PSC), GnRH (acetato Gonadorelina) y fosfato buffer salino (PBS) sobre la formación de folículos hemorrágicos en conejas (experimento 2). 3.5 Efecto de la administración intramuscular de Plasma seminal de llama (PSLL), plasma seminal de conejo (PSC), GnRH (acetato de Gonadorelina) y fosfato buffer salino (PBS) sobre la formación de folículos antrales y hemorrágicos en conejas (experimento 2). 3.6 Ovarios de conejas inyectadas con 0.5 (A) 0 1 ml (B) de plasma seminal de llama, 0.5 (C) o 1ml (D) de plasma seminal de conejo, 25μg de GnRH (E, F) o 0.5 ml de PBS (G, H) (experimento 2). 3.7 Ovarios de conejas inyectadas con 0.5 ml (A) de plasma seminal de llama, 1 ml (B) de plasma seminal de conejo, 25μg de GnRH (C) o 0.5 ml de PBS (D). (experimento 2). Página

9 3.8 Columna de cerámica hidroxiapatita y electroforesis en gel de plasma seminal de llama (PSLL). A) Fracciones eludidas del PSLL utilizando la columna de HA. B) Gel de poliacrilamida (SDS-PAGE 14%) correspondientes al plasma seminal y sus fracciones eludidas por la columna: MM: Marcador Molecular, PSLL: plasma seminal sin separar, A: Fracción A, B: Fracción B y C: Fracción C. (experimento 3). 3.9 Columna de cerámica hidroxiapatita y electroforesis en gel de plasma seminal de conejo (PSC). A) Fracciones eludidas del PSC utilizando la columna de HA. B) Gel de poliacrilamida (SDS- PAGE 14%) correspondientes al plasma seminal y sus fracciones eludidas por la columna: MM: Marcador Molecular, PSC: plasma seminal sin separar, A: Fracción A, B: Fracción B y C: Fracción C. (experimento 3) Columna de filtración en gel y electroforesis en gel de plasma seminal de llama (PSLL) A) Fracciones eludidas del PSLL de la columna de filtración en Gel utilizando FPLC. B) Gel de poliacrilamida (SDS-PAGE 14%) correspondientes al plasma seminal y sus fracciones eludidas por la columna: MM: Marcador Molecular, PSLL: plasma seminal sin separar, B: Fracción B Proveniente de la columna de HA: Fracciones B1 y B2 de fracción B, resultantes de FPLC. (experimento 3) Columna de filtración en gel y electroforesis en gel de plasma seminal de conejo (PSC) A) Fracciones eludidas del PSC de la columna de filtración en Gel utilizando FPLC. B) Gel de poliacrilamida (SDS-PAGE 14%) correspondientes al plasma seminal y sus fracciones eludidas por la columna: MM: Marcador Molecular, PSC: plasma seminal sin separar, C: Fracción C

10 obtenida de columna de HA: Fracciones C1, C2, C3 y C4 de la Fracción C, resultantes de FPLC (experimento 3) Western Blots de geles 14% SDS-PAGE. (A) Línea 1: Inmunoreacción en Plasma seminal de Llama sin separar. Línea 2: inmunoreacción en fracción B Línea 3: Inmunoreacción en fracción C. (B) Línea 1: Inmunoreacción en Plasma seminal de Conejo. Línea 2: Inmunoreaccion en fracción C PSC (experimento 3) Western Blots control para unión inespecífica de anticuerpo secundario en muestra de plasma seminal de conejo (PSC) y sus fracciones. MM: Marcador Molecular, PSC: plasma seminal sin separar, A: Fracción A, B: Fracción B y C: Fracción C

11 ÍNDICE DE ANEXOS Anexo 1 Mediciones de hormona luteinizante (LH) de llamas tratadas con plasma seminal de llama, plasma seminal de conejo y fosfato buffer salino 2 Mediciones de progesterona (P 4 ) de llamas tratadas con plasma seminal de llama, plasma seminal de conejo y fosfato buffer salino 3 Mediciones del tamaño del cuerpo luteo (CL) de llamas tratadas con plasma seminal de llama y plasma seminal de conejo Página

12 LISTA DE ABREVIACIONES CL EE FIO GnRH hcg LH MM NC PBS PSC PSLL Cuerpo Luteo Error estándar Factor Inductor de ovulación Hormona Liberadora de Gonadotrofinas Gonadotrofina corionica humana Hormona luteinizante Marcador Molecular Nitrocelulosa Fosfato Buffer Salino Plasma seminal de conejo Plasma seminal de llama

13 RESUMEN Las llamas y los conejos son especies consideras como Ovuladores inducidos, necesitan del estimulo neuroendocrino, proveniente de la monta para desencadenar ovulación. Por lo cual, el presente estudio tuvo como objetivos: determinar el efecto de plasma seminal de conejo sobre la ovulación de llamas y conejas (Experimento 1, Experimento 2) y determinar si el Factor inductor de ovulación (FIO) de llama es una molécula conservada en otras especies de ovulación inducida como en el conejo (Experimento 3). En el experimento 1, llamas (n=5 por grupo) se les inyecto intramuscularmente: 2 ml de plasma seminal de llama (PSLL, control positivo), plasma seminal de conejo (PSC, grupo Tratamiento) y Fosfato Buffer Salino (PBS, Control negativo). Se detecto ovulación en 4/5, 5/5 y 0/5 de las llamas pertenecientes a los grupos PSLL, PSC y PBS, respectivamente (P < 0.001). Los tratamientos de PSLL y PSC fueron seguidos de un aumento significativo en la concentración de LH en plasma sanguíneo (P < 0.01) a la hora y media, el máximo diámetro del cuerpo luteo (CL) alcanzo en promedio 12.8 ± 0.37 al día 8 y no existió diferencias entre las hembras ovuladas de los grupos PSLL y PSC (P > 0.05). Las concentraciones plasmáticas de progesterona fueron proporcionales al desarrollo y crecimiento del CL. En le experimento 2, conejas (n=5-7 por grupo) fueron inyectadas intramuscularmente con: 1) 0,5; 1,0 y 2,0 ml de PSLL o PSC (grupo Tratamiento); 2) 25 g of GnRH (acetato de Gonadorelina, Pfizer, Control positivo) y 3) 0,5 ml de fosfato buffer salino (PBS, Control negativo). Ninguna de las conejas presento ovulación al examen por laparotomía exploratoria. En todas las conejas se presentaron folículos antrales y hemorrágicos, siendo mayor el desarrollo de folículos hemorrágicos (P = 0.08) en las hembras tratadas con 1ml de PSC en comparación a los otros grupos. Cortes histológicos de los ovarios confirma las estructuras halladas. En el experimento 3, se logro aislar el factor inductor de ovulación (FIO) del PSLL y PSC usando técnicas de elución por gravedad (columna de cerámica-hidroxiapatita) y filtración en gel (FPLC), y se determino que el FIO de llama es una molécula conservada en conejos mediante la técnica de western Blot 1

14 ABSTRACT The Llamas and rabbits are species considered as induced ovulators. They need a neuroendocrine stimulus from the mating in order to start the ovulation process. Therefore, the objectives of this research were: to determine the effect of the rabbit's seminal plasma on the ovulation of llamas and rabbits (Experiment 1 and, 2) and, to determine if the Llama ovulation-inducing factor (OIF) is a molecule preserved in other species of Induced Ovulation such the rabbits (experiment 3). Experiment 1, the llamas (n=5 per group) were intramuscularly injected; 2 ml of llama Seminal Plasma (positive control), rabbit Seminal Plasma (treatment group) and phosphate buffered saline (PBS; negative control). Ovulation was detected in 4/5, 5/5 and, 0/5 of the llamas, respectively (P < 0.001). The llama Seminal Plasma and rabbit Seminal Plasma Treatments were followed by a significant increase in the LH concentration in the Blood plasma (P < 0.01). One hour and a half after, the maximum diameter of the corpus luteum (CL) reached an average of at day 8 and, there were not any differences among the ovulated females from the groups (P > 0.05). The plasmatic concentrations of progesterone were proportional to the development and growth of the CL. In Experiment 2, female rabbits (n=5-7 per group) were intramuscularly injected with: 1) 0,5; 1,0 and, 2,0 ml of The llama Seminal Plasma or rabbit Seminal Plasma (Treatment Group); 2) 25 mg of GnRH (positive control) and, 3) 0,5 ml of Saline Buffer Phosphate (PBS, negative control). None of the female rabbits were ovulated when examined by exploratory laparotomy. All of the female rabbits displayed antral and hemorrhagic follicles. The development of hemorrhagic follicles was higher (P=0.08) in the females treated with 1ml of PSC in comparison with the other groups. Histological cuts of the ovaries confirmed the found structures. In Experiment 3, the ovulation-inducing factor (OIF) was isolated from the llama Seminal Plasma and rabbit Seminal Plasma by using techniques such, Gravity elution and Gel Filtration (FPLC) and, it was found that the Llama FIO is a molecule preserved in rabbits by the use of the Western Blot Technique. 2

15 CAPITULO 1 INTRODUCCIÓN GENERAL 3

16 La importancia de la fisiología reproductiva y el desarrollo de técnicas de reproducción asistida en los Camélidos Sudamericanos han cobrado relevancia a nivel internacional debido a las características productivas y biológicas que poseen estas especies. La mayoría de las investigaciones reproductivas en camélidos sudamericanos han sido dirigidas a dos especies domesticas, la llama (lama glama) y la alpaca (lama pacos). No obstante, los adelantos en reproducción no se han desarrollado con la misma magnitud tal como lo observado en otras especies domesticas de interés productivo (bovino-ovino). La mayoría de los estudios se han enfocado a la aplicación de técnicas de reproducción asistida tales como, inseminación artificial, sincronización de crecimiento folicular, superestimulación ovárica y fecundación in vitro, sin embargo, existen pocos estudios relacionados con el mecanismo de ovulación en estas especies. La fisiología reproductiva de las llamas y alpacas difiere de otros rumiantes domésticos y su comprensión es muy limitada hasta la fecha. Los camélidos sudamericanos son considerados ovuladores inducidos; es decir que la intromisión del pene del macho en el tracto reproductivo de la hembra (copula) es necesario para desencadenar la ovulación (England et al., 1969; Fernández-Baca et al., 1970). En un estudio diseñado para determinar los factores asociados con la ovulación en alpacas (Fernández-Baca et al., 1970), se comparo la tasa de ovulación entre hembras que (1) fueron montadas; (2) fueron montadas seguidas de una inseminación artificial; (3) tuvieron monta interrumpida; (4) tuvieron monta estéril (macho vasectomizado) seguidas con o sin inseminación artificial; (5) con una monta o múltiples montas no interrumpidas (machos entero); o (6) se les suministro hcg: de los resultados obtenidos del estudio se concluyo, que la monta con intromisión de pene es necesaria para inducir la ovulación independiente de si el macho es entero o vasectomizado y que la tasa de ovulación con el tratamiento de hcg puede ser incrementada. Un estudio posterior confirmó la hipótesis de ovulación inducida en llamas documentando que un incremento de la concentración sistémica de LH se presentaba a los 15 minutos posteriores a la monta natural en la hembra, sus picos se alcanzaban a las 2 horas y disminuía a niveles basales 7 horas después de la monta (Bravo et al., 1990). 4

17 Sin embargo, el dogma de ovulación refleja en estas especies, ha sido cuestionado en los últimos años. Estudios realizados en el laboratorio de reproducción animal de la Universidad Austral de Chile documentaron la presencia de un factor inductor de ovulación presente en el plasma seminal de llamas y alpacas. Se han inducido ovulaciones en llamas y alpacas luego de la aplicación intramuscular o la infusión intrauterina de plasma seminal de llama. Estas evidencias indican que el mecanismo de ovulación de estas especies no solamente opera de acuerdo a la estricta definición mencionada anteriormente sino que componentes químicos del eyaculado podrían también jugar un papel importante en el mecanismo de ovulación. Estudios previos realizados también en el laboratorio, indican que este factor podría secretarse en los eyaculados de especies de ovulación espontánea, puesto que se han observado ovulaciones en llamas tratadas con plasma seminal de bovino, equino y porcino. En otras especies clásicas de ovulación inducida, como el conejo, se desconoce la presencia de este factor, por lo tanto, es relevante comprobar si el FIO es una molécula conservada en conejos y si su mecanismo de acción es parecido al de las llamas. Para este estudio se trabajo con llamas, ya que esta especie ha sido un modelo biológico ideal para evaluar el FIO presente en otras especies de ovulación como se describió anteriormente y pertenece al grupo de Ovuladores reflejos. Por lo cual, el objetivo general de esta tesis fue el determinar la presencia de un factor inductor de ovulación en el conejo, especie también definida como ovulador reflejo y evaluar su efecto en el mecanismo de ovulación en llamas y conejas. Las hipótesis del presente estudio fueron: і) El plasma seminal de conejo presenta un factor inductor de ovulación (FIO) іі) El plasma seminal de llama y de conejo induce ovulación en conejas iii) El Factor inductor de ovulación (FIO) presente en el plasma seminal de llamas es una molécula conservada en el conejo 5

18 Los objetivos específicos de la presente investigación fueron: - Determinar si la administración intramuscular de plasma seminal de conejo induce ovulación utilizando como modelo biológico la llama. - Determinar si la administración intramuscular de plasma seminal de llama y conejo induce ovulación en la coneja - Comprobar la presencia del FIO en plasma seminal de conejo mediante la técnica de Western Blot. 6

19 CAPITULO 2 REVISIÓN DE LITERATURA 7

20 2.1 MECANISMO DE OVULACIÓN EN LAS ESPECIES MAMÍFERAS La ovulación es una etapa crítica en el proceso reproductivo de los mamíferos, tanto en los ovuladores "espontáneos", como en los ovuladores "inducidos". Los eventos que conducen a la ovulación y los intentos de manipular este proceso, han sido objeto de investigaciones, durante mucho tiempo. Las especies domesticas han sido clasificadas tradicionalmente de acuerdo a su mecanismo de ovulación, en animales de ovulación espontánea e inducida (refleja). Según Bakker et al. (2000), esta división entre especies está basada en el tipo de estimulo responsable para iniciar la liberación de Hormona Liberadora de Gonadotrofinas (GnRH) desde el hipotálamo medio basal. Esta, es producida por las neuronas hipotalámicas a partir de un precursor polipetídico por procesos enzimáticos y empaquetada en gránulos de almacenamiento que son transportados por los axones neurales a la eminencia media (Fink, 1988). Dichas neuronas migran hacia el hipotálamo con o como parte del nervio terminal a través de la lamina cribiforme (Prieto y Velazquez, 2002). En general existe escasa información sobre los circuitos neuronales que transmiten tanto las señales esteroidales como los estímulos sensoriales a las neuronas liberadoras de GnRH. Se ha demostrado que neurotransmisores y neuropéptidos afectan la secreción de GnRH y por consecuencia la secreción de LH en hembras mamíferas (McEwwen y Parsons, 1982) La hormona GnRH se libera al sistema portal Hipotálamo-Porta-Hipofisiario en forma de pulsos, los cuales pueden ser regulados por señales externas al hipotálamo, como los esteroides. La naturaleza pulsátil de la secreción de GnRH resulta en la liberación en fases de las gonadotropinas LH y FSH. La frecuencia y descarga del pulso de GnRH varia de aproximadamente 20 minutos hasta por encima de los 90 minutos dependiendo de la especie, genero y estado fisiológico (Spies et al., 1997). 8

21 En especies de ovulación espontánea (e.g., hombre, ovejas, bovinos, caballos, cerdos), la ovulación es dependiente de esteroides, es decir, cuando la concentración sistémica de estradiol proveniente de un folículo preovulatorio alcanza un cierto umbral (Citado por Adams et al. 2005) se produce un sistema de retroalimentación hormonal positiva por la cual el estradiol induce la liberación masiva de GnRH desde el hipotálamo con subsiguiente pico preovulatorio de LH y ovulación. En cambio, en las especies de ovulación inducida, la ovulación no es dependiente de la concentración de estradiol, el coito o la intromisión del pene del macho en el tracto reproductivo de la hembra induce un estimulo neuronal provocando la oleada de GnRH, pico de LH y consiguiente ovulación (Backer et al., 2000). Aunque el desarrollo del folículo dominante produce un incremento en la concentración de estrógenos, en los ovuladores reflejos, este aumento no induce la secreción pulsátil de GnRH, por lo cual no existe la descarga preovulatoria de LH ni subsecuente ovulación (Spies et al., 1997). Sin embargo, se observan diferencias en relación al estimulo necesario para desencadenar la liberación de LH y la presentación de picos de LH entre especies reflejas. Por ejemplo, en llamas y alpacas, el pico de las concentraciones de LH en plasma ocurre a las dos horas posterior a la copula (Bravo et al., 1991), en comparación con el Koala (Phascolarctos cinereus), especie clasificada como ovulador inducido (Johnston et al., 2000, 2004) donde el pico de LH ocurre entre las horas post-coito. El hurón (Mustela putorius) difiere de los gatos en que una sola copula, con penetración, es suficiente para inducir 100% la ovulación, el efecto de una sola monta es suficiente para incrementar significativamente entre 5-9 veces la concentración sistémica de LH (Carroll et al. 1985). Sin embargo, los mismos autores mencionan que en gatos (Felis silvestris catus) la concentración sistémica de LH se incrementan entre veces en esta especie debido al efecto de múltiples copulas. En gatos la frecuencia de estimulación coital juega un papel importante en la ovulación, copulas múltiples aparentemente mejoran la liberación de LH por la pituitaria (Wildt et al 1980). 9

22 En el ratón de campo (Microtus agrestes) se registran incrementos de LH a los 5 minutos después de la monta, disminuyendo su concentración en suero en las dos horas siguientes (Charlton et al 1975). Igualmente Milligan (1975) reporta que el M. agrestes difiere de los típicos ovuladores inducidos en que, en algunas circunstancias, después de la ovulación el cuerpo luteo comienza a degenerarse a los dos día del estimulo de inducción. En el conejo, un corto cortejo y cubierta, que involucra la eyaculación, es suficiente para desencadenar la liberación de LH desde la hipófisis, aumentándose los niveles hormonales a nivel plasmático a los 3 minutos post monta (Jones et al., 1976). Otra especie en la cual se ha estudiado el efecto de la monta es el visón (Mustela vison), donde también se concluyo que una sola copula es suficiente para originar una descarga preovulatoria de LH (Enders, 1952). En el caso de las llamas y alpacas, se considera, que una sola monta que implique eyaculación puede desencadenar la ovulación, adicionalmente se ha demostrado que aumentos en el numero de copulas no incrementa la tasa de ovulación ni la amplitud del pico de LH (Fernadez-Baca, 1970; Bravo et al., 1992) Ovulación espontánea en Ovuladores reflejos El estimulo inicial para provocar el aumento de GnRH/LH es diferente entre Ovuladores reflejos (neural) y espontáneos (hormonal), aunque la presentación de ambas ovulaciones es común en especies mamíferas, un solo tipo de estimulo predomina usualmente. (Spies et al., 1997) Vaughan y Tibary (2006) definen la ovulación espontánea como una ruptura del folículo, liberación de un oocito y formación de un cuerpo lúteo normal (fase lútea normal) sin estimulación coital, sugieren que es rara en camélidos pero puede presentarse. Estudios 10

23 en alpacas (Bravo, 1989) reportan un 3.5% de ovulación espontánea del total de folículos 6mm observados con la técnica de laparoscopia. En las llamas, se reporta una tasa de ovulación que varía entre el 8% y 15%, con alta incidencia en llamas lactantes (Citado por Nagy et al., 2004), los autores sugieren que la ovulación espontánea puede ser una característica normal del periodo temprano del post-parto. En camellos dromedarios se detecto ovulación espontánea en hembras no lactantes (1.4%) y en hembras lactantes (41.7%) (Nagy et al., 2005). Probablemente los camélidos que presentan ovulación espontánea han sido expuestos a estímulos diferentes a la copula que inducen la ovulación. La monta hembra-hembra, estrés por manejo o la manipulación del tracto reproductivo pueden contribuir a ovulaciones independientes a la copula (Vaughan et al., 2006). En otras especies de ovulación inducida como los conejos, hurones y topillos se ha demostrado que no se inducen picos preovulatorios de LH producto del alza de estradiol proveniente del crecimiento del folículo dominante (Sawyer y Markee, 1959; Milligan, 1978; Milligan, 1980; Baum et al., 1990). Al igual que la administración exógena de estradiol con o sin progesterona no desencadena secreción de LH en conejos y hurones (Sawyer and Markee, 1959; Baum et al., 1990). Se considera que la clasificación de las especies según las características de ovulación, en espontáneos e inducidos, es una clasificación muy estricta (Conaway, 1971), pues especies de ovulación espontánea también pueden presentar ovulación inducida. Según Jochle (1975), algunos animales utilizan la ovulación refleja como mecanismo para asegurar la capacidad reproductiva en situaciones adversas (rata); aunque no estrictamente se trata de ovulación refleja, se ha descrito que en ciertas especies como bovino y cerdo, la monta natural acelera la ovulación de las hembras al compararlas con aquellas que reciben inseminación artificial. También se ha descrito un efecto macho en cabras y ovejas pero este estimulo está relacionado con la ciclicidad de las hembras más que a un cambio en los mecanismos de ovulación espontánea. En lo bovinos se ha observado que el desarrollo de la copula dentro de las primeras 6-8 horas del estro (Marion, 1950) o un adecuado estimulo 11

24 mecánico (Randel et al., 1973) produce un adelanto en la presentación de la descarga preovulatoria de LH y en la ovulación. La ocurrencia ocasional de ovulaciones inducidas en especies clasificadas como ovuladores espontáneos inspiro la hipótesis de que la ovulación inducida es una característica primitiva de la cual la ovulación espontanea evolucionó (Conaway, 1971; Zarrow y Clark, 1968). La amplia distribución del mecanismo de ovulaciones inducidas en los ordenes primitivos insectívora y rodentia apoya esta noción (Jöchle, 1975). Sin embargo, el hecho de que no se observe una predominancia de ovuladores inducidos en vertebrados no mamíferos como peces, anfibios, reptiles y aves ni en los mamíferos más primitivos como los monotremas y marsupiales pone en duda lo anteriormente planteado (Bakker y Baum, 2000) Mecanismo de ovulación en Ovuladores inducidos En hembras de ovulación inducida como los camélidos del Viejo (Camelus bactrianus, Bactrian camel) y Nuevo mundo (Lama glama, lama pacos, Vicugna vicugna, Lama guanicoe), los conejos, hurones y gatos, las señales nerviosas del estimulo de la copula desencadenan la secreción de GnRH desde el Hipotálamo, seguida por una liberación preovulatoria de LH desde la Pituitaria anterior. Similarmente a los Ovuladores espontáneos, una onda en la concentración de LH parece ser un requisito para la ovulación en ovuladores inducidos, pero este suceso es contingente sobre el estimulo copulatorio, por lo tanto, la ovulación no es un evento cíclico. (Adams et al., 2005). Diferentes estímulos (olfatorios, auditivos, oculares y táctiles) han sido asociados con la inducción de la ovulación en las hembras de ovulación refleja, siendo el estimulo físico de la intromisión del pene considerado como el estimulo principal en la inducción de la descarga preovulatoria de LH (Bakker y Baum 2000). 12

25 El mecanismo primario implicado en la liberación de GnRH entre Ovuladores inducidos involucra las neuronas noradrenergicas del mesencéfalo y el tronco cerebral en respuesta a las señales genito-somatosensoriales generadas por la intromisión del pene del macho durante la monta (Backer et al., 2000). Las vías neurales involucradas en la activación de las neuronas liberadoras de GnRH en ovuladores reflejos son poco comprendidas. Se ha demostrado que neurotransmisores y neuropéptidos afectan la secreción de GnRH y subsecuente liberación de LH en hembras mamíferas (McEwen and Parsons, 1982). Estudios comparativos realizados entre conejos y monos por Spies et al. (1997) plantearon, que aunque el coito y los estrógenos incrementan la norepinefrina junto con aumento en la secreción de GnRH, la respuesta al estimulo (copula) en el conejo solo toma segundos y en los primates demora horas. Esta diferencia en la velocidad de la respuesta puede ser atribuida a las diferentes vías requeridas para desencadenar la liberación de GnRH/LH en ovuladores espontáneos o inducidos. El coito induce una rápida acción neuroendocrina con señales que llegan al hipotálamo por varias vías aferentes minutos después de iniciada la monta. La penetración del pene en el cérvix, el contacto físico y la presencia de un factor inductor de ovulación presente en el plasma, inducen el aumento de LH en hembras (Fernandez-Baca et al. 1970; Chen et al. 1985; Bravo 1994; Adams y Ratto 2001; Tibary 2001). El rápido incremento de LH en plasma después de la monta en llamas (Bravo et al., 1990) se parece al observado en conejos después de una sola monta (Jones et al., 1976). Aparentemente el número de montas no incrementa la tasa de ovulación en alpacas ni la amplitud de la onda de LH en llamas y alpacas (Fernandez-Baca, 1970a; Bravo et al., 1992). Mientras que en otros ovuladores inducidos como el gato, múltiples montas incrementan tanto la amplitud de LH como la tasa de ovulación (Concannon et al., 1980). En llamas y alpacas (Bravo et al., 1991), el primer incremento significativo en las concentraciones de LH en el plasma ocurre minutos después de la iniciación de la 13

26 monta, los picos máximos se alcanzan a las dos horas y declina a niveles basales a las 7 horas después de la monta. Se observo un incremento similar en camellos y dromedarios minutos después de la monta, al igual que en conejos y gatos Ovulación en camélidos Sudamericanos La llamas como ovuladores inducidos, requieren de la copula para desencadenar el aumento de la LH responsable de la ovulación. En la ausencia de un estimulo ovulatorio, la dinámica folicular es llevada a cabo en ondas sucesivas de crecimiento, maduración y regresión folicular (Miragaya et al., 2006). La monta en presencia de un folículo maduro o en crecimiento 6mm diámetro conlleva a la liberación de suficiente cantidad de LH para que ocurra la ovulación en llamas y alpacas. La respuesta de LH a la copula es dependiente del tamaño del folículo tanto en llamas como en alpacas (Bravo et al., 1991), ya que se postula que folículos con diámetro < 5mm posiblemente liberan menor cantidad de estrógenos y por ende menor cantidad de LH que los folículos de mayor tamaño en fase de crecimiento, fase estática o en regresión (Gigli et al., 2006). Aba y Forsberg (1995), sin embargo, no observan ninguna correlación entre el estradiol en plasma (5-41 pmol/l) y la cantidad de LH liberada después de la estimulación de GnRH, en alpacas y llamas. El estradiol en ovuladores inducidos fue reportado por actuar en la hembra induciendo las características de comportamiento de receptividad sexual (Baum and Schretlen, 1978). Aunque el incremento de estradiol ha sido correlacionado positivamente al incremento del tamaño de folículo dominante en llamas, alpacas este incremento fisiológico no induce la ovulación en estas especies (Bravo et al., 1990, Chaves et al., 2002). En guanacos (Riveros et al., 2010) y vicuñas (Miragaya et al., 2004) también se reporta la correlación positiva entre diámetro folicular y producción de estradiol. El intervalo entre monta y ovulación es aproximadamente de 30 horas (rango horas) tanto en alpaca como llama (Tibary y Memon, 1999). Adams et al. (1990) 14

27 encontró que el intervalo entre monta y ovulación en llamas fue muy consistente: 26/27 (96%) ocurrió al segundo día después de la monta y 1/27 al tercer día, en comparación a lo encontrado por Bourke et al. (1992) donde las llamas se les detecto ovulación a las 28 horas post-tratamiento con GnRH. En estudios hechos por San Martin et al. (1968) en alpacas se detecto ovulación temprana a las 26 horas después de la monta y a las 24 horas después del tratamiento con hcg, sin embargo el método de detección, la necropsia, excluyo el intervalo medio y distribución de ovulaciones. En otros estudios hechos en alpacas (Sumar et al., 1993) usando al técnica de laparoscopia cada 12 horas, se mostro que el intervalo entre la monta y la ovulación fue de 30 a 72 horas en 50% (38/76) y aproximadamente 30 horas en 24% (18/76) de las hembras. Basado en ultrasonografias diarias de los ovarios en llamas (Adams et al., 1989, 1990) las ovulaciones fueron detectadas 2.1 ± 0.1 día después de la copula. De 3 a 5 días posteriores a la monta, se desarrolla un CL en el ovario sitio de ovulación, paralelamente se incrementan los niveles de progesterona en plasma entre el 4 y 6 día después de la monta con ovulación. El tamaño máximo reportado del CL está entre 10 a 15mm en alpaca y llamas respectivamente entre los 7 9 días después de la monta. Niveles circulantes de progesterona de más de 2ng/ml (6.4 nmol/l) son considerados un indicativo de la presencia de un CL maduro y funcional (Vaughan et al., 2004). Se observa una disminución de progesterona en plasma 1 a 3 días antes de la disminución morfológica del diámetro del CL: La visualización del CL por ultrasonografía transrectal es relativamente fácil después del 3-4 días de la ovulación. La duración promedio de vida del CL es de 8 a 9 días Ovulación en conejas La ovulación en conejas es normalmente inducida por el coito y ocurre en hembras sexualmente maduras de 10 a 12 horas posteriores a la monta o inyección de LH o GnRH; la monta o las gonadotrofinas exógenas estimulan la biosíntesis de esteroides por los 15

28 folículos ováricos (Bjersing y Cajander, 1974). El aumento inicial de la secreción de esteroides es seguido por una disminución en la producción de hormonas al nivel mas bajo justo antes de la ovulación (Wu, et al. 1977), este periodo de producción reducida de hormonas ha sido atribuido a una resistencia del folículo a más estimulación gonadotofica. En el estro las conejas muestran regulares pulsos de baja amplitud de GnRH, LH y E 2, después del coito, a los minutos, se observa un incremento en la liberación de GnRH de 40 veces desde el hipotálamo mediobasal (Spies, et al. 1997), los niveles de LH también se incrementan. La LH incrementa el flujo sanguíneo al ovario y estimula la esteroidogenesis por el folículo de graff. Dahm-Kähler et al. (2006), logran captar la secuencia de cambios estructurales durante la ovulación en conejas, usando una técnica de microscopia in vivo. Sin embargo, existen muchas variaciones entre las especies de ovulación inducida en las características de comportamiento de monta, existen reportes donde ocurre ovulación espontánea en conejas no montadas y también se ha reportado ovulación en hembras que han sido montadas por hembras dominantes, las cuales realizaron movimientos de copula y emitieron el sonido característico del macho después de la monta (Staples, 1967). 2.2 FACTOR INDUCTOR DE OVULACIÓN (FIO) Investigaciones recientes han desafiado el clásico dogma de ovulación refleja en alpacas y llamas debido a que una molécula/s presentes en el plasma seminal podría ser responsable de iniciar la cascada de ovulación en estas especies (Adams et al., 2005). La existencia de esta sustancia fue inicialmente reportada por investigadores chinos, quienes concluyeron que algún factor presente en el semen de los camellos Bactrianos era responsable de iniciar la ovulación, debido a que la administración intravaginal de semen o plasma seminal indujo ovulación en 41/47 (87%) de las hembras inseminadas (Chen et al, 16

29 1985), mientras que Xu et al, 1985, reporto que 7/7 (100%) hembras que se les deposito semen en la vagina ovularon. En estudios adicionales Pan et al. (2001) y Li et al. (2004) logran aislar y purificar las fracciones activas del FIO del plasma seminal de Camellos Bactrianos, documentan que este factor inductor de ovulación podría tratarse de un agregado de proteínas y que tendría una masa molecular que fluctúa entre los 19 a 50 kda. Al mismo tiempo se sugiere que el FIO presente en el plasma seminal de alpaca tiene una actividad como la del GnRH pero no es GnRH (Paolicchi et al., 1999). Según la secuencia parcial de aminoácidos amino Terminal, el FIO es diferente de la hormona luteinizante (LH), Gonadotropina coriónica humana (hcg), Gonadotrofina sérica de yegua preñada (PMSG) y Prostaglandina F2ά (PG F2ά) (Pan et al. 2001). La existencia de un FIO en el plasma seminal de llamas y alpacas ha sido documentada recientemente, un descubrimiento que cambio el concepto de que la estimulación física es responsable de provocar la ovulación en estas especies (Adams et al., 2005). Adicionalmente, nuevas evidencias (Ratto et al., 2006; Orleigh et al., 2008) documentan que este factor no solamente está presente en el plasma seminal de llamas y alpacas sino que podría ser una molécula conservada en especies de ovulación espontánea como el bovino, equino y porcino. Johnston et al. (2004) y O Leary et al. (2006) realizaron experimentos con Koalas y cerdos respectivamente, con el objetivo de determinar si la exposición a plasma seminal puede alterar la función ovárica, aportando resultados positivos y concluyentes de que en estas especies también existe un factor o factores que inciden en el mecanismo de ovulación. Estudios más reciente hechos por Ratto et al., (2010) concluyeron que el FIO de plasma seminal de llama es una proteína molecular con una masa molecular aproximadamente 30kDa, que es un componente bioactivo resistente a la digestión enzimática con proteinasa K y en incubación a 38ºC por 12 horas o a 65ºC por una hora y 17

30 que solo la digestión enzimática con pronasa E altera la actividad del factor inductor de ovulación. Aunque se tiene información inequívoca de la existencia de este factor inductor en el plasma seminal de llamas y alpacas, no se han realizado estudios en otras especies de ovulación inducida tal como el caso del conejo, conducentes a determinar no solo su presencia sino que también su relación con el mecanismo de ovulación en esta especie 18

31 CAPITULO 3 DETERMINACIÓN DE LA PRESENCIA DE UN FACTOR INDUCTOR DE OVULACIÓN EN EL PLASMA SEMINAL DE CONEJO 19

32 DETERMINACIÓN DE LA PRESENCIA DE UN FACTOR INDUCTOR DE OVULACIÓN EN EL PLASMA SEMINAL DE CONEJO DETERMINATION OF THE PRESENCE OF AN OVULATION-INDUCING FACTOR IN THE SEMINAL PLASMA OF RABBIT ABSTRACT The Llamas and rabbits are species considered as induced ovulators. They need a neuroendocrine stimulus from the mating in order to start the ovulation process. Therefore, the objectives of this research were: to determine the effect of the rabbit's seminal plasma on the ovulation of llamas and rabbits (Experiment 1 and, 2) and, to determine if the Llama ovulation-inducing factor (OIF) is a molecule preserved in other species of Induced Ovulation such the rabbits (experiment 3). Experiment 1, the llamas (n=5 per group) were intramuscularly injected; 2 ml of llama Seminal Plasma (positive control), rabbit Seminal Plasma (treatment group) and phosphate buffered saline (PBS; negative control). Ovulation was detected in 4/5, 5/5 and, 0/5 of the llamas, respectively (P < 0.001). The llama Seminal Plasma and rabbit Seminal Plasma Treatments were followed by a significant increase in the LH concentration in the Blood plasma (P < 0.01). One hour and a half after, the maximum diameter of the corpus luteum (CL) reached an average of at day 8 and, there were not any differences among the ovulated females from the groups (P > 0.05). The plasmatic concentrations of progesterone were proportional to the development and growth of the CL. In Experiment 2, female rabbits (n=5-7 per group) were intramuscularly injected with: 1) 0,5; 1,0 and, 2,0 ml of The llama Seminal Plasma or rabbit Seminal Plasma (Treatment Group); 2) 25 mg of GnRH (positive control) and, 3) 0,5 ml of Saline Buffer Phosphate (PBS, negative control). None of the female rabbits were ovulated when examined by exploratory laparotomy. All of the female rabbits displayed antral and hemorrhagic follicles. The development of hemorrhagic follicles was higher (P=0.08) in the females treated with 1ml of PSC in comparison with the other 20

33 groups. Histological cuts of the ovaries confirmed the found structures. In Experiment 3, the ovulation-inducing factor (OIF) was isolated from the llama Seminal Plasma and rabbit Seminal Plasma by using techniques such, Gravity elution and Gel Filtration (FPLC) and, it was found that the Llama FIO is a molecule preserved in rabbits by the use of the Western Blot Technique. RESUMEN Las llamas y los conejos son especies consideras como Ovuladores inducidos, necesitan del estimulo neuroendocrino, proveniente de la monta para desencadenar ovulación. Por lo cual, el presente estudio tuvo como objetivos: determinar el efecto de plasma seminal de conejo sobre la ovulación de llamas (Experimento 1); determinar el efecto de plasma seminal de llama sobre la ovulación de conejos (Experimento 2) y determinar si el Factor inductor de ovulación (FIO) de llama es una molécula conservada en otras especies de ovulación inducida como en el conejo (Experimento 3). En el experimento 1, llamas (n=5 por grupo) se les inyecto intramuscularmente: 2 ml de plasma seminal de llama (PSLL, control positivo), plasma seminal de conejo (PSC, grupo Tratamiento) y Fosfato Buffer Salino (PBS, Control negativo). Se detecto ovulación en 4/5, 5/5 y 0/5 de las llamas pertenecientes a los grupos PSLL, PSC y PBS, respectivamente (P < 0.001). Los tratamientos de PSLL y PSC fueron seguidos de un aumento significativo en la concentración de LH en plasma sanguíneo (P < 0.01) a la hora y media, el máximo diámetro del cuerpo luteo (CL) alcanzo en promedio 12.8 ± 0.37 al día 8 y no existio diferencias entre las hembras ovuladas de los grupos PSLL y PSC (P > 0.05). Las concentraciones plasmáticas de progesterona fueron proporcionales al desarrollo y crecimiento del CL. En le experimento 2, conejas (n=5-7 por grupo) fueron inyectadas intramuscularmente con: 1) 0,5; 1,0 y 2,0 ml de PSLL o PSC (grupo Tratamiento); 2) 25 g of GnRH (acetato de Gonadorelina, Pfizer, Control positivo) y 3) 0,5 ml de fosfato buffer salino (PBS, Control negativo). Ninguna de las conejas presento ovulación al 21

34 examen por laparotomía exploratoria. En todas las conejas se presentaron folículos antrales y hemorrágicos, siendo mayor el desarrollo de folículos hemorrágicos (P = 0.08) en las hembras tratadas con 1ml de PSC en comparación a los otros grupos. Cortes histológicos de los ovarios confirma las estructuras halladas. En el experimento 3, se logro aislar el factor inductor de ovulación (FIO) del PSLL y PSC usando técnicas de elución por gravedad (columna de ceramica-hidroxiapatita) y filtración en gel (FPLC), y se determino que el FIO de llama es una molécula conservada en conejos mediante la técnica de western Blot 3.1 INTRODUCCIÓN Los Camélidos Sudamericanos domésticos llama (lama glama) y alpaca (lama pacos), han sido clasificados como hembras de ovulación inducida, es decir necesitan el estimulo coital o copula para desencadenar el proceso ovulatorio, la monta desencadena la secreción de GnRH desde el hipotálamo seguida por una descarga preovualtoria de LH y consecuente ovulación (Ovuladores reflejos), a diferencia de especies de ovulación espontánea (bovino-ovino), donde la ovulación es dependiente de la concentración de esteroides sexuales (estrógenos) aportada por el folículo preovulatorio. Sin embargo, estudios realizados por Adams et al. (2001; 2005) con plasma seminal de llama y alpaca reportaron la presencia de un factor inductor de ovulación (FIO), descubrimiento que sirvió de base para cuestionar el concepto de que la estimulación física durante la copula es el desencadenante primario para iniciar la ovulación en estas especies. Estas evidencias indican que el mecanismo de ovulación de llamas y alpacas no solamente opera de acuerdo a la estricta definición mencionada anteriormente, sino que componentes químicos del eyaculado podrían también jugar un importante papel en el mecanismo de ovulación. La existencia de esta sustancia fue inicialmente reportada por investigadores chinos, quienes concluyeron que algún factor presente en el semen de los camellos Bactrianos fue responsable de iniciar la ovulación después de la estimulación 22

35 mecánica de la copula (Chen et al., 1985), siendo esto corroborado posteriormente por Li et al. (2002) quien determino que la inyección de plasma seminal, coito o inseminación artificial causan la ovulación de folículos maduros en camellos bactrianos. Zhao et al. (2001) al igual que Li et al. (2004), documentaron la purificación de fracciones con actividad ovárica del plasma seminal de camello bactriano mediante la técnica de cromatografía liquida, estas fracciones bioactivas indujeron la secreción de LH pero no de FSH en cultivos in vitro de glándula pituitaria de rata. Adicionalmente, Paolicchi et al. (1999) trabajo con plasma seminal de alpaca y demostró que este induce la liberación de LH desde cultivos in vitro de células hipofisiarias de rata y que el efecto se mantiene incluso al adicionar al medio anticuerpos anti GnRH, sugiriéndose por ende, que este factor inductor de ovulación (FIO) tiene una actividad igual a la GnRH, siendo moléculas diferentes. Así mismo, nuevas evidencias (Ratto et al., 2006; Orleigh et al., 2008) documentan que este factor no solamente está presente en el plasma seminal de llamas y alpacas sino que podría ser una molécula conservada en especies de ovulación espontánea como el bovino, equino y porcino, puesto que se han observado ovulaciones en llamas tratadas con plasma seminal de estos animales. Igualmente Johnston et al. (2004), plantea que el semen de koala contiene un factor o factores que promueven inducción de la fase luteal pareciéndose superficialmente al mecanismo de ovulación de los camellos bactrianos. O Leary et al. (2006), documento que factores en el plasma seminal de verracos introducido en el útero de cerdas previo a la ovulación puede influenciar la función ovárica mejorando la respuesta celular folicular, lo que conducen a una mayor producción de progesterona y por ende cambios que facilitan el inicio de la preñez. La separación y caracterización de los diferentes componentes del plasma seminal en camélidos y bovinos ha sido el objetivo de diversas investigaciones (Lavon 1972; Banerjee et al., 1971; Pan et al., 2001; Zhao et al., 2001; Li et al., 2004; Vásquez et al., 2008) pero 23

36 son pocos los relacionados a la identificación y separación del FIO. Zhao et al. (2001) lograron aislar una fracción responsable de este factor en el semen de camello bactriano mediante el uso de cromatografía DEAE (dietilamino-etilcelulosa), demostrando que una fracción a la que denominaron L 3 logro incrementar la secreción de LH de a miu/ml en cultivos de pituitaria de rata. Así mismo, los mismos autores documentan un incremento en la concentración sistémica de LH (6.43 a ng/ml) en camellos bactrianos 6 horas posterior a la administración intramuscular de plasma seminal. En estudios adicionales, Tanco (2008) aíslo el factor de plasma seminal de llama usando dos columnas cromatograficas de separación de proteínas (Hidroxiapatita y filtración en gel). Mientras que Pan et al. (2001) y Li et al. (2004) logran aislar y purificar las fracciones activas del FIO del plasma seminal de Camellos Bactrianos mediante técnicas de cromatografía de intercambio iónico sobre DAEA, y cromatografía de fase reversa utilizando cromatografía liquida de alta presión (HPLC). Pan et al. (2001), hizo énfasis en la determinación de su estructura y composición química, peso molecular (13.1 KDa) y aminoácidos (74 péptidos residuales). Los mismos autores sugieren que aunque este FIO tiene una actividad de GnRH debido a su efecto sobre la secreción de LH en gonadotropos cultivados in vitro, no es GnRH porque su actividad biológica sobre células de la pituitaria de rata no fue suprimida cuando se adiciono anticuerpos anti GnRH al cultivo celular. De acuerdo al análisis de los componentes de aminoácidos y secuencia parcial de aminoácidos de amino Terminal el FIO es diferente de la hormona luteinizante (LH), Gonadotropina coriónica humana (hcg), Gonadotrofina sérica de yegua preñada (PMSG) y Prostaglandina F2ά (PG F2ά) (Pan et al., 2001) Ratto et al., (2010) lograron la separación del plasma seminal de llama en cuatro fracciones según su masa molecular, ( 30kDa, 30-10kDa, 5-10kDay 5kDa) y observaron que todos los animales (n=9) tratados con la fracción 30 kda ovularon, por 24

37 ende concluyeron, que el FIO es una proteína con una masa molecular promedio de ( 30kDa) Nuestro laboratorio ha desarrollado una técnica combinada de cromatografía la cual permite obtener el factor inductor de ovulación de llamas con un alto grado de pureza. La fracción proteica aislada por esta técnica revelo la presencia de una intensa banda proteica con una masa molecular de 14 kda cuando es corrida en condiciones desnaturalizantes en geles de Poliacrilamida al 12% SDS-PAGE (Ratto: Comunicación personal). Esta molécula proteica purificada ha sido probada en ensayos de ovulación utilizando como modelos biológicos, llamas y alpacas, resultando tener un potente ovulatorio efecto cuando es administrado por vía intramuscular (Tanco 2008). Aunque se tiene información inequívoca en relación a la existencia de este factor inductor en el plasma seminal de llamas y alpacas, se desconoce la presencia de este factor en otras especies de ovulación inducida como en el conejo. Por lo tanto, los objetivos de este estudio fueron: -Determinar el efecto de plasma seminal de conejo sobre la ovulación utilizando como bioensayos el modelo animal llama y conejo (Experimento 1; Experimento 2) - Determinar si el FIO de llama es una molécula conservada en otras especies de ovulación inducida como en el conejo (Experimento 3) 3.2 MATERIALES Y MÉTODOS Para el experimento 1 se trabajo con llamas pertenecientes al Instituto de Ciencia Animal de la Universidad Austral de Chile, las cuales son alimentadas con pasturas naturales y suplementadas con heno y concentrado, con consumo de agua ad-libitum. El experimento 2 se trabajo con conejas pertenecientes al mismo instituto que permanecían en 25

38 jaulas individuales y alimentadas con concentrado y agua ad-libitum. Todos los ensayos de laboratorio (experimento 3) fueron realizados en el laboratorio de reproducción animal de la misma universidad Experimento 1 Colección de semen y preparación de plasma seminal en llamos y conejos Se colecto semen de 4 conejos machos adultos de la raza Neozelandés con una frecuencia de 2 veces por semana, durante los meses de junio, julio y agosto (24 eyaculados por animal), usando la técnica de vagina artificial. La cantidad de semen recolectado vario entre macho obteniéndose un promedio de 0.75 ml por monta. El eyaculado de conejo se centrifugo a 1800 rpm durante 15 minutos a temperatura ambiente. Se recolecto semen de 2 machos llama adultos usando vagina artificial mediante el proceso descrito por Bravo et al. (1997), durante un periodo de dos meses previos al experimento (8 eyaculados por animal), en la estación de invierno. Los eyaculados de macho llama fueron diluidos 1:1 (v/v) con fosfato buffer salino (PBS, Gibco, Grand Island, N.Y., USA) y centrifugados a 1500 x g durante 30 minutos. Después de la centrifugación del semen de ambas especies, el sobrenadante fue removido y se evaluó una gota por microscopio para confirmar la ausencia de células. Si se detectaban espermatozoides, las muestras se volvían a centrifugar para remover los restos de espermatozoides. El plasma seminal libre de células fue reunido por especies y almacenado a -70ºC hasta su uso. Animales y tratamientos Llamas adultas (n = 20) entre 4-6 años de edad y con un peso promedio de 120±10 Kg. fueron examinadas en forma diaria mediante ultrasonografía utilizando un transductor 26

39 lineal de 7.5mHz acoplado a una consola Aloka SSD 500 para determinar crecimiento folicular. Un total de 15 llamas con presencia de un folículo de 7 mm de diámetro y el cual había crecido por tres días consecutivos, fueron asignadas aleatoriamente a recibir en forma intramuscular, un volumen de 1 ml de: 1) Plasma seminal de llama, (n = 5, Control Positivo); 2) Plasma Seminal de Conejo (n = 5, grupo tratamiento) y 3) Solución de Fosfato Buffer Salino (PBS, n = 5, Control Negativo), Las inyecciones se aplicaron en el músculo semimembranoso utilizando una aguja 21Gx1½. Los ovarios fueron examinados post-tratamientos por ultrasonografía diariamente desde el día de tratamiento (día = 0) hasta el día 15 para detectar ovulación, formación del Cuerpo Lúteo (CL) y dinámica luteal. (Adams, et al., 2005). La dosis de 1 ml de plasma seminal de llama y conejo se baso en el cantidad promedio de eyaculado de un macho llama en el momento de la monta natural. Para la medición de LH plasmática, todas las hembras se cateterizaron mediante la fijación de un catéter (1,5mm OD x 1,0mm ID) en la vena yugular un día previo al inicio de los tratamientos. Se colectaron muestras de sangren en tubos heparinizados cada 15 minutos comenzando 1 hora y 30 minutos antes de iniciado el tratamiento y finalizando a las 8 horas posteriores del mismo. Las muestras fueron centrifugadas a 1800 rpm por 15 minutos y el plasma sanguíneo almacenado a -20ºC. Las concentraciones de LH en plasma se analizaron con radioinmunoanálisis de anticuerpo- doble (Rawlings et al., 1984). Las concentraciones de LH se expresaron en términos de NIAMDD-oLH-24. El límite mínimo detectable del ensayo fue ng. El rango de la curva estándar fue de ng (80% ligand labeled LH) a 0.19 ng (20% ligand labeled LH). El coeficiente de variación dentro y entre ensayos fue de 6.3% y 6.0% respectivamente, para la referencia más alta de concentración de LH en plasma (0.79 ng/ml). El coeficiente de variación dentro y entre ensayos fue de 5.6% y 7.6% respectivamente, para la referencia más baja de concentración de LH en plasma (0.17ng/ml). 27

40 Se colectaron muestras de sangre por punción de la vena yugular en tubos heparinizados los días 0, 2, 4, 6, 8, 10, 12 y 14 (día 0 = día de tratamiento con plasma seminal) las muestras fueron centrifugadas a 1800 rpm por 15 minutos y el plasma sanguíneo almacenado a -20ºC. Las concentraciones de progesterona fueron determinadas usando un kit comercial de radioinmunoanálisis de anticuerpo-doble (Coat-a-Count total progesterone, DPC, Diagnostic Products Corporation, Los Angeles, CA, USA). Todas las muestras se analizaron en un solo ensayo. El coeficiente de variación dentro del ensayo fue de 1.8%, 4.9% y 1.8% respectivamente, para la referencia de concentración de progesterona en plasma de 1.8, 2.9 y 14.6 ng/ml Experimento 2 45 conejas entre 2 y 3 años de edad, con un peso promedio de 3,4 a 5 Kg fueron mantenidas en jaulas individuales, alimentadas con concentrado comercial y agua adlibitum. Las hembras fueron sometidas a un régimen de luz de 16 horas día y 8 horas noche desde 2 semanas previas a iniciar los tratamientos Para la realización de los tratamientos se utilizaron conejas receptivas no lactantes (n=5-7 por grupo). La receptividad de las hembras fue determinada de acuerdo a la coloración de la mucosa vulvar, siendo las coloraciones rojas o rojizo-púrpuras indicadoras de receptividad y las rosada o blanquecinas indicadoras de no receptividad. Las conejas se agruparon aleatoriamente para recibir en forma intramuscular un volumen de: 1) 0,5; 1,0 y 2,0 ml de plasma seminal de llama o conejo; 2) 25 g of GnRH (acetato de Gonadorelina, Pfizer, Control positivo) y 3) 0,5 ml de fosfato buffer salino (PBS, Control negativo). Las conejas fueron sometidas a una laparotomía exploratoria horas posterior a los tratamientos, para lo cual fueron anestesiadas utilizando una combinación de ketamina y xilacina (35-50 mg/kg Ketamina (Ketamil) y 5-10 mg/kg Xylacina 2%). Las laparotomías 28

41 fueron practicadas en el flanco derecho de las hembras y a través de esta incisión se evaluó por observación directa y registro fotográfico ambos ovarios. Los Parámetros evaluados fueron: respuesta ovulatoria determinada por los números de puntos de ovulación, número de folículos antrales y número de folículos hemorrágicos. Las hembras fueron ovariectomizadas después de la laparotomía y los ovarios fueron fijados por inmersión en Bouin (Baker, 1977), se deshidrataron en concentraciones crecientes de etanol y se incluyeron en paraplast. Se obtuvieron cortes de 4 m de grosor que fueron montados en portaobjetos gelatinizados, para posteriormente ser teñidos con hematoxilina-eosina según los procedimientos estándar Experimento 3 - Separación cromatográfca del PSLL y PSC utilizando una columna de Cerámica- Hidroxiapatita y elución por gravedad. Se descongelo plasma seminal de llama y de conejo a temperatura ambiente y se centrifugo a 3000 rpm durante 30 minutos. Los PSC y PSLL se cargaron en una columna [Econo-Column 1.5 (ID) x 30 cm] de Cerámica Hidroxiapatita (Macro-Prep Type II, 40 µm BIO-RAD laboratories) equilibrada inicialmente con 150ml de buffer fosfato de sodio (Na 2 HPO 4 ) 200mM, seguido de 150 ml de fosfato de sodio (Na 2 HPO 4 ) 10 mm. Antes de iniciar las corridas se midió el ph de la columna el cual estaba entre Aproximadamente 5 ml de PSLL con un contenido de 34 mg de proteína total fue corrido en la columna en 6 replicas (Total de proteína 204 mg). Mientras que 2.5 ml de PSC con un contenido promedio de 65.7 mg de proteína total fue corrido en la columna en 3 replicas (Total de proteína mg). 29

42 La elución fue llevada a cabo utilizando un gradiente lineal de 400Mm Na 2 HPO 4, ph 6.8. La elución fue colectada en fracciones de 2 ml a una velocidad de flujo de 0.4 ml / min. Las fracciones colectadas se analizaron para determinar la concentración proteica en un detector UV pharma Spec 1700 (UV- Visible Spectrophotometer - SHIMADZU) a una absorbencia de 280 nm. Esta absorbancia fue graficada en Excel para determinar el patrón y numero de fracciones obtenidas posterior a la elución. Una vez identificadas las fracciones, estas fueron concentradas en tubos vivaspin de 20 ml con una membrana cut off de 5 kda (Vivaspin, Sartorius stedim biotech) y centrifugadas a 2500 x g (RCF) durante 60 minutos a una temperatura de 10 ºC (Thermo Scientific Heraeus megafuge IIR Centrifuge), durante este centrifugado, se utilizo PBS a un ph de 7.4 para ir retirando el exceso del buffer de elución (400mM Na 2 HPO 4 ). (Tanco, 2008) - Ulterior purificación de fracciones de PSLL y PSC mediante una columna de filtración en gel utilizando un equipo de FPLC Aquellas fracciones obtenidas con la columna de hidroxiapatita del plasma seminal de llama y conejo, las cuales expresaron una banda proteica intensa de aproximadamente 14 kda fueron cargadas en una columna cromatográfica de filtración en gel (SEC, Hi Prep 26/60 Sepahacryl S-100, Amersham Laboratories, Piscataway, NJ, USA). El proceso de purificación fue llevado a cabo a temperatura ambiente y un promedio de flujo de 0.5 ml por minuto usando un equipo de FPLC. La elución fue realizada en forma isocrática utilizando PBS a ph 7.4, y la absorbancia de fracciones de 4 ml fueron medidas a 280nm y concentradas en forma similar a lo descrito para la columna de HA. - Cuantificación proteica y corrida electroforética de proteínas La cuantificación de proteínas se llevo a cabo mediante la técnica de Bradford (Quick Start TM Bradford protein assay BIO-RAD). 30

43 Para determinar el perfil de bandas proteicas de las fracciones obtenidas por ambas columnas cromatograficas, una muestra de cada fracción eludida fue reducida, desnaturalizada y separada mediante electroforesis sobre un gel de Poliacrilamida al 14% (SDS-PAGE) basado en el protocolo Laemmli (1970). Los geles fueron teñidos con Coomassie Blue R-250 (Sigma-Aldrich, St Louis, Missouri, USA). - Determinación de la presencia y conservación de FIO mediante la técnica de Western- Blots Las muestras utilizadas para la elaboración de esta técnica fueron las fracciones obtenidas de la columna de HA resultantes de las corridas del plasma seminal de llama y conejo. Para el SDS-PAGE y subsiguiente Western Blot se trabajo con un equipo Mini-Protean Tetra cell (BIO-RAD) de acuerdo al protocolo del fabricante. Una muestra de cada fracción fue mezclada con un volumen de buffer muestra 6X y desnaturaliza por calor durante 5 minutos. Posteriormente las muestras fueron corridas y separadas mediante electroforesis denaturante en gel de Poliacrilamida al 14 % (SDS- PAGE), durante 1 hora, a una constante de 150V, utilizando un buffer de corrida 1X (25mM Tris, 250mM glicina, 0.1% SDS a ph 8.3). A continuación, el gel se dejo reposar durante 10 minutos en buffer de transferencia para posteriormente ser transferido a una membrana de nitrocelulosa (NC) por electroforesis durante 1 hora y 30 minutos, usando buffer de transferencia (25mM Tris, 192mM glicina, 20% metanol a ph 8.3) a 400 mam. La membrana NC bloqueada (TBS- Tween 20 a ph 7.5 más 1% de BSA) se incubo 12 horas a temperatura ambiente con un anticuerpo primario (OIF Rabbit polyclonal IgG ) a una dilución 1:500 (solución de dilución para los anticuerpos: TBS Tween 20 más 1% de BSA), seguida de una segunda incubación con un anticuerpo secundario acoplado a peroxidasa (Goat anti Rabbit IgG-HRP) a una dilución 1:2000 por 1 hora. Previa y posterior incubación la membrana fue lavada 3 veces durante 10 minutos con TBS- Tween 31

44 20. La detección de la señal se realizó utilizando Pierce ECL Western Blotting Substrate (Thermo Scientific) Análisis estadísticos Datos seriados (Dinámica luteal, análisis de la concentración de LH y progesterona) fueron analizados mediante análisis de varianza de una vía para muestras repetidas (Experimento 1). Tamaño folicular, Máximo diámetro de folículos al momento del tratamiento y máximo diámetro y regresión de CL posterior al tratamientos fue comparado entre los grupos mediante análisis de varianza de una vía (Experimento 1). Número total de folículos antrales, hemorrágicos y CL fueron comparados entre los grupos mediante análisis de varianza de una vía (Experimento 2). Tasa de ovulación fue comparada entre los grupos mediante chi-cuadrado (Experimento 1 y 2). 3.3 RESULTADOS Experimento 1 Animales y tratamientos El diámetro folicular al momento del tratamiento no difirió significativamente entre los grupos (P > 0.05) y se observo ovulación en todas las hembras tratadas con plasma seminal de conejo, solo 4/5 animales tratados con plasma seminal de llama ovularon, mientras que ninguna ovulación fue observada en el grupo tratado con PBS (Tabla 3.1). 32

45 Tabla 3.1. Efecto de la administración Intramuscular de Plasma seminal de Llama (PSLL), Plasma seminal de conejo (PSC) y fosfato buffer salino (PBS) sobre la ovulación y formación del Cuerpo lúteo (CL) en llamas (promedio ± EE; Experimento 1). Tratamiento Variables PSLL ( n = 5) PSC ( n = 5) PBS ( n = 5) Valor P Diámetro Folicular al momento del tratamiento (mm) 10.2 ± ± ± Tasa de Ovulación 4/5 a (80%) 5/5 a (100%) 0/5 b (0%) Diámetro del CL al día 8 (mm) 12 ± ± a,b Letras diferentes indican diferencias significativas dentro de la misma fila (P < 0.001). Durante las 8 horas de muestreo posterior al tratamiento con plasma seminal, se observo que la concentración plasmática de LH tuvo un alza seguida por una caída (P < 0.01) en todas las hembras que habían recibido plasma seminal de llama o de conejo, sin embargo, esta fluctuación no fue visualizada en el grupo de animales tratados con PBS (control negativo) donde la concentración plasmática de LH se mantuvo a niveles basales durante todo el periodo de muestreo (Figura 3.1). Los resultados demuestran que el plasma seminal de conejo y el plasma seminal de llama tienen el potencial para estimular la liberación de LH plasmática de ng/ml ± ng/ml hasta 5.342ng/ml ± 1.242ng/ml y de 0.499ng/ml ± 0.035ng/ml a ng/ml ± 1.365ng/ml, respectivamente. El primer incremento significativo (P< 0.01) de LH se presento a las 1,5 horas post tratamiento en ambos grupos de llamas (PSLL, PSC), mientras que el grupo control negativo se mantuvo a niveles basales. La máxima concentración de LH no difirió (P>0.05) entre los grupos PSLL y PSC, ocurriendo esta a las 2,5 horas en el grupo PSLL y a las 3,5 horas en el grupo PSC, con valores de 5.09 ± 0.7 y 5.34 ± 0.5 respectivamente. Las concentraciones 33

46 plasmáticas de LH fueron sostenidas en ambos grupos (PSLL y PSC) durante un periodo de horas y no alcanzaron a retornar a sus niveles basales al finalizar el periodo de muestreo (8 horas). La concentración plasmática de LH comenzó a disminuir significativamente a las 4 y 4.5 horas post-tratamiento en los grupos PSLL y PSC respectivamente (Figura 3.1). El desarrollo, evolución y regresión del CL no presento diferencias significativas entre los animales tratados con PSLL y los tratados con PSC (Figura 3.2). Así mismo, el máximo diámetro del CL no difirió entre los grupos PSLL y PSC (Tabla 3.2). Concentración de LH en plasma (ng/ml) PSLL PSC PBS -1 T1 0 P < Efecto de tratamiento P < Efecto de tiempo P < Interacción P < * * Tiempo (horas) Figura 3.1. Concentración de LH en plasma (promedio ± EE) en hembras llama después del tratamiento intramuscular de Plasma seminal de conejo (PSC), plasma seminal de llama (PSLL) y fosfato buffer salino (PBS) (experimento 1). T1: tiempo de tratamiento. * Intervalo durante el cual los niveles de LH de los grupos PSLL y PSC fueron mas altos (P<0.01) que el grupo control. 34

47 Tabla 3.2. Efecto de la administración Intramuscular de Plasma seminal de Llama (PSLL), Plasma seminal de conejo (PSC) y fosfato buffer salino (PBS) sobre la ovulación y el desarrollo luteal (CL) en llamas (promedio ± EE; Experimento 1). Plasma seminal Intramuscular Variables PSLL ( n = 5) PSC ( n = 5) Valor P 1 día de CL detectado 2.5 ± ± Máximo diámetro CL (mm) 12 ± ± Día del máximo diámetro CL 8.5 ± ± Inicio regresión CL (días) 11.5 ± ± PSLL PSC Diámetro CL (mm) Efecto de tratamiento P = Efecto de día P < 0.01 Interacción P = Día después del tratamiento Figura 3.2. Diámetro del Cuerpo luteo en hembras llama tratadas intramuscular con plasma seminal de llama (PSLL) y plasma seminal de conejo (PSC) (promedio ± EE; experimento 1). 35

48 La concentración de progesterona fue proporcional al desarrollo y crecimiento del cuerpo luteo. Las concentraciones plasmáticas de progesterona no difirieron significativamente entre los grupos ovulados (P > 0.05) presentando una concentración máxima de 5.8 ± 0.87 y 6.3 ± 1.59 ng/ml para los grupos PSLL y PSC respectivamente al Día 8 post-tratamiento. El grupo control negativo mantuvo la concentración plasmática de progesterona a nivel basal durante todo el periodo de muestreo. Los niveles de progesterona plasmática descendieron bruscamente por los días 10 y 12 en los grupos PSLL y PSC, respectivamente. (Figura 3.3). Para el ultimo día de muestreo (día 16) el grupo PSC había logrado los niveles basales de progesterona en comparación al grupo de PSLL (P < 0.05). Progesterona en plasma (ng/ml) PSLL Efecto de tratamiento P = Efecto de día P < 0.01 PSC Interacción P = PBS * * P < Día después del tratamiento Figura 3.3. Concentración de progesterona en plasma de llamas hembras después de la administración intramuscular con plasma seminal de llama (PSLL), plasma seminal de conejo (PSC) y fosfato buffer salino (PBS) (promedio ± EE experimento 1). * Intervalo durante el cual los niveles de Progesterona de los grupos PSLL y PSC fueron mas altos (P<0.01) que el grupo control. 36

49 3.3.2 Experimento 2 Animales y tratamientos Se observó puntos de ovulación en el grupo de hembras tratadas con GnRH, mientras que ninguna ovulación fue observada en los grupos tratados con plasma seminal de conejo, de llama y PBS (P < 0.01). El numero de folículos antrales fue menor en las hembras pertenecientes al Grupo Control positivo en relación con el resto de los grupos (P = 0.02). Se observo una tendencia (P = 0.08) por un mayor desarrollo de folículos hemorrágicos en aquellas hembras tratadas con 1ml de PSC (Figura 3.4, Tabla 3.3). Se observo también un incremento (P < 0.01), en el número total de folículos (folículos antrales mas hemorrágicos) en el grupo tratado con 1ml de PSC en comparación con el resto de los grupos (Figura 3.5) 15 Foliculos hemoragicos Control Neg Control Positivo PSC 0.5ml PSC 1.0 ml PSC 2.0 ml Tratamiento PSL 0.5 ml PSL 1.0 ml PSL 2.0 Figura 3.4. Efecto de la administración intramuscular de Plasma seminal de llama (PSLL), plasma seminal de conejo (PSC), GnRH (acetato de Gonadorelina) y fosfato buffer salino (PBS) sobre la formación de folículos hemorrágicos (P = 0.08) en conejas (experimento 2). 37

50 Tabla 3.3. Efecto de la administración intramuscular de Plasma seminal de llama (PSLL), plasma seminal de conejo (PSC), GnRH (acetato de Gonadorelina) y fosfato buffer salino (PBS) sobre la ovulación y desarrollo folicular en conejas (experimento 2). Plasma Seminal PBS 0.5 ml (n = 5) GnRH 25 mg (n = 6) 0,5 ml 1,0 ml 2,0 ml Conejo Llama Conejo Llama Conejo (n = 5) (n = 5) (n = 7) (n = 7) (n = 5) Llama (n = 5) Puntos de Ovulación 0 ± 0 a 7,0 ± 0,6 b 0 ± 0 a 0 ± 0 a 0 ± 0 a 0 ± 0 a 0 ± 0 a 0 ± 0 a Folículos Antrales 11 ± 1,1 4 ± 0,9 11,2 ± 1 9,4 ± 0,7 11,1 ± 1,7 9,1 ± 1,8 7,6 ± 1,6 9,6 ± 2,0 Folículos Hemorrágicos 0,2 ± 0,2 3,3 ± 1,1 0,6 ± 0,6 0,8 ± 0,5 9,3 ± 3,3 3,4 ± 2,0 3,0 ± 2,8 3,2 ± 2,7 Folículos Totales 11,2 ± 1,1 7,3 ± 1,6 11,8 ± 1,1 10,2 ± 1 20,4 ± 2,3 12,6 ± 1,2 10,6 ± 3,3 12,8 ± 1,5 a,b letras diferentes indican diferencias significativas dentro de la misma fila (P<0.01). 38

51 Folículos antrales y hemorrágicos a b b b b b b b Control Neg Control Positivo PSC 0.5ml PSC 1.0 ml PSC 2.0 ml PSL 0.5 ml Tratamiento PSL 1.0 ml PSL 2.0 Figura 3.5. Efecto de la administración intramuscular de Plasma seminal de llama (PSLL), plasma seminal de conejo (PSC), GnRH (acetato de Gonadorelina) y fosfato buffer salino (PBS) sobre la formación de folículos antrales y hemorrágicos en conejas a,b (experimento 2). letras diferentes indican diferencias significativas entre los tratamientos (P<0.05). La anatomía macroscópica y cortes histológicos confirman que los tratamientos con plasma seminal específicamente de conejo alteran la estructura ovárica originando la formación de folículos hemorrágicos al compararlos con las estructuras presentes en los controles negativos (PBS) o positivos (GnRH). (Figuras 3.6, 3.7). 39

52 A B C D C FOLÍCULO ANTRAL FOLÍCULOS HEMORRÁGICOS E F G H PUNTOS DE OVULACIÓN FOLÍCULO ANTRAL Figura 3.6. Ovarios de conejas inyectadas con 0.5 (A) 0 1 ml (B) de plasma seminal de llama, 0.5 (C) o 1ml (D) de plasma seminal de conejo, 25μg de GnRH (E, F) o 0.5 ml de PBS (G, H). A B PUNTOS DE OVULACIÓN FOLÍCULO ANTRAL FOLÍCULO ANTRAL FOLÍCULOS HEMORRÁGICOS C D Figura 3.7. Ovarios de conejas inyectadas con 0.5 ml (A) de plasma seminal de llama, 1 ml (B) de plasma seminal de conejo, 25μg de GnRH (C) o 0.5 ml de PBS (D) Experimento 3 - Aislación y purificación de proteinas presentes en el plasma seminal de Llama y conejo mediante el uso de una combinación de Columna cromatografica Cerámicas Hidroxiapatia y filtración en gel. Tanto del PS de llama como de conejo se eluieron tres fracciones proteicas (Figura 3.8A y 3.9A). Estos patrones de elución fueron similares en 6 replicas para el PSLL y 3 replicas para el PSC. Por cada replica se cargo la columna con un total de mg de proteína proveniente de plasma seminal de cada una de las especies. Para el caso de PSLL, se recupero y 5 mg de proteína total para las Fracciones A, B y C lo que representa 40

53 el 25.5 %, 34% y 20% respectivamente. Para el caso de PSC, se recuperaron 7,5 8,0 y 4,6 mg de proteína total para las Fracciones A, B y C lo que representa el 28.8 %, 30.8% y 17.5% respectivamente CURVA DE ABSORBANCIA PLASMA SEMINAL DE LLAMA B A Masa Molecular 195kDa 41kDa B MM PSL A B C ABSORBANCIA A C 20kDa kDa FRACCION 6kDa FIO Figura 3.8. Columna de cerámica hidroxiapatita y electroforesis en gel de plasma seminal de llama (PSLL). A) Fracciones eluidas de PSLL en columna de HA. B) Gel de poliacrilamida (SDS-PAGE 14%) correspondientes al plasma seminal y sus fracciones eludidas por la columna: MM: Marcador Molecular, PSLL: plasma seminal sin separar, A: Fracción A, B: Fracción B y C: Fracción C. A CURVA DE ABSORBANCIA PLASMA SEMINAL DE CONEJO 195kDa B MM PSC A B C A C 41kDa ABSORBANCIA B 20kDa 15kDa 6kDa FRACCION FIO Figura 3.9. Columna de cerámica hidroxiapatita y electroforesis en gel de plasma seminal de conejo (PSC) A) Fracciones eluidas del PSC en columna de HA. B) Gel de poliacrilamida (SDS-PAGE 14%) correspondientes al plasma seminal y sus fracciones eludidas por la columna: MM: Marcador Molecular, PSC: plasma seminal sin separar, A: Fracción A, B: Fracción B y C: Fracción C. 41

54 Las bandas proteicas observadas en los geles de poliacrilamida (Figura 3.8B y 3.9B) mostraron un patrón diferente entre las especies. Sin embargo algo en común en ellos son las bandas proteicas intensamente marcadas entre los 14 y 15 kda. Las Fracciones B y C (Figuras 3.8A y 3.9A) del plasma seminal de Llama y conejo respectivamente fueron cargadas en una columna de filtración en gel usando un equipo automático de FPLC. Dos fracciones proteicas fueron eludidas del PSLL las cuales fueron denominadas B1 y B2 (Figura 3.10A) mientras que 4 fracciones proteicas fueron eludidas del PSC denominadas C1, C2, C3 y C4 utilizando la misma columna y condiciones de elución (Figura 3.11A). A B2 195kDa B Masa Molecular MM PSLL B1 B B2 41kDa B1 15kDa 6kDa FIO Figura Columna de filtración en gel y electroforesis en gel de plasma seminal de llama (PSLL) A) Fracciones eluidas del PSLL de la columna de filtración en Gel utilizando FPLC. B) Gel de poliacrilamida (SDS-PAGE 14%) correspondientes al plasma seminal y sus fracciones eludidas por la columna: MM: Marcador Molecular, PSLL: plasma seminal sin separar, B: Fracción B Proveniente de la columna de HA: Fracciones B1 y B2 de fracción B, resultantes de FPLC. Al observan los perfiles de bandas proteicas de ambas especies se pudo observar la expresión de una banda consistente en la fracción B2 del PSLL (Figura 3.10B) y una banda similar y bien marcada en la fracción C3 del PCS (Figura 3.11B). 42

55 C1 A C3 Masa Molecular 195kDa B MM PSC C C1 C2 C3 C4 C2 C4 41kDa 20kDa 15kDa 6kDa FIO Figura Columna de filtración en gel y electroforesis en gel de plasma seminal de conejo (PSC) A) Fracciones eluidas del PSC de la columna de filtración en Gel utilizando FPLC. B) Gel de poliacrilamida (SDS-PAGE 14%) correspondientes al plasma seminal y sus fracciones eludidas por la columna: MM: Marcador Molecular, PSC: plasma seminal sin separar, C: Fracción C obtenida de columna de HA: Fracciones C1, C2, C3 y C4 de la Fracción C, resultantes de FPLC. - Determinación de la presencia y conservación de FIO mediante la técnica de Western- Blots Las membranas de nitrocelulosa retuvieron la mayoría de proteínas transferidas al gel, esto se comprobó mediante la tinción del gel con azul Coomassie. La identificación del FIO se realizo con técnica de Blot posterior a la transferencia de las proteínas a la membrana de nitrocelulosa. En la incubación de la membrana tanto por el anticuerpo primario como el secundario se utilizo albumina y no leche descremada. Para la detección de la señal proteica, la concentración de los anticuerpos fue buena lográndose un buen agregado y señal, ya que se considera que los sistemas también dependen de la concentración y tipo de antígeno y anticuerpo para dar un agregado físicamente inmóvil. 43