XV CONGRESO DE INGENIERIA SANITARIA Y AMBIENTAL AIDIS CHILE Concepción, Octubre de 2003

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1 XV CONGRESO DE INGENIERIA SANITARIA Y AMBIENTAL AIDIS CHILE Concepción, Octubre de 2003 IMPORTANCIA DEL RECUENTO Y DETERMINACIÓN DE VIABILIDAD DE HUEVOS DE HELMINTOS EN LODOS Olea Morales Alejandra Pinto Fajardo Edith Pizarro Guzmán Jacqueline Av. Camilo Henríquez N 540 Puente Alto Santiago Chile anam@anam.cl Fono : (56 2) Fax: (56 2) Resumen La gran cantidad de Lodos generados en Plantas de Tratamiento de Agua residuales, pueden ser reutilizados en mejoramiento de suelos y como fertilizante de tierras cultivables. Aunque aun no existe una Norma oficial, se habla de cumplir con parámetros microbiológicos entre los que se menciona a Helmintos en valor de <1 huevo viable / 4 gramos de materia seca, Lodos Clase A. Los Helmintos Parásitos son considerados patógenos. El hombre y animales infectados pueden eliminar huevos de manera asintomática o con la enfermedad en curso, y de esta manera llegar al sistema de tratamiento de aguas residuales y concentrarse en los Lodos. Existen diversas técnicas para extraer huevos de las muestras y cuantificarlos. Sin embargo, la problemática real es poder determinar su condición de viabilidad (huevos vivos o muertos). Al respecto, nuestra experiencia en el Laboratorio de Microbiología de Análisis Ambientales (ANAM), está basada en un método EPA modificado (Gaspard et Schwartzbrod, 1993), que ha

2 sido utilizado y presentado como proyecto de Norma Francia, Con la implementación de esta metodología hemos podido realizar recuento y determinación de viabilidad de huevos de Helmintos en Lodos estableciendo los géneros de mayor frecuencia y la relación % de humedad / cantidad de huevos detectados.

3 Introducción Los helmintos son animales invertebrados de vida libre o parasitaria conocidos como gusanos. Los helmintos parásitos son considerados patógenos. Si se tienen presente los factores que constituyen un riesgo real de infección: _ alta persistencia del patógeno en el ambiente, prolongado periodo de latencia o etapa de desarrollo, _ baja dosis infectante y _ escasa inmunidad del huésped. Dado lo anterior, podemos darnos cuenta que los helmintos constituyen un alto riesgo para la salud, al cumplir con todas las características mencionadas. En efecto pueden infectar al hombre por ciclos directos o indirectos causando diversas enfermedades como por ejemplo: Desnutrición Obstrucción intestinal por Ascaris Intensa infección por Trichuris; Parásitos sobre el recto prolapsado El hombre y los animales infectados pueden eliminar los huevos de manera asintomática o con la enfermedad ya en curso y de esta manera llegan a los sistemas de tratamiento de aguas residuales y se concentran en los Lodos. Si se quieren reutilizar estos últimos se hace imprescindible realizar la detección de los huevos de helmintos. En la actualidad, la extracción y posterior cuantificación de huevos presentes en las muestras, no constituye un gran problema. Sin embargo, y como ha sido mencionado, el real desafío es poder establecer su estado de viabilidad, es decir, si los huevos están vivos o no. Al respecto nuestra experiencia, está basada en un método EPA modificado (Gaspard et Schwartzbrod, 1993) que ha sido utilizado en Francia y presentado en el año 2002 como proyecto de Norma en ese país. Con esta técnica hemos podido analizar muestras de lodo,

4 realizando la cuantificación y determinación de viabilidad de huevos de helmintos, estableciendo como viables aquellos nematodos que presentan su estructura interna sin daños, con algún estado de desarrollo o bien con una larva móvil ya formada. En el caso de los Cestodos, éstos son sometidos a una tinción (con azul de Trypan), donde los huevos que conservan su color original se consideran viables y los que se tiñen del color azul-violeta se consideran no viables. De la experiencia que se tiene hasta ahora se ha podido sacar algunas conclusiones, tales como cuáles son los géneros de helmintos predominantes y en qué lodos se encuentran la mayor cantidad de ellos. Estos puntos se desarrollan más detalladamente en el capítulo de Resultados y Conclusiones del presente trabajo.

5 Objetivos _ Dar a conocer la experiencia obtenida en el Laboratorio de Microbiología de Análisis Ambientales (ANAM), con la aplicación del Método EPA modificado (Gaspard et Schwartzbrod, 1993) para la realización del recuento y determinación de la viabilidad de los huevos de helmintos. _ Correlacionar datos de %humedad de lodos versus cantidad de huevos de helmintos y ocurrencia de los géneros. Materiales y Método - Pesar 10 gramos materia seca, suspender en 5 L. Agua grado reactivo clase 3, sedimentar por 18 h. a temperatura ambiente. - Descartar sobrenadante y transferir sedimento a tubos centrífuga y centrifugar 5 min. a 400g. - Descartar sobrenadante y resuspender sedimento con 3 volúmenes de solución NaNO3 ph 7.0. Centrifugar 3 min. a 400g. - Recuperar sobrenadante, diluir con agua grado reactivo hasta obtener solución de densidad _1 mg/l - Sedimentar durante 3 horas. - Centrifugar por 3 min. a 660g. - Resuspender sedimento en solución alcohol-ácido y éter 1,5:1. - Centrifugar 3 min. a 660g. - Recuperar sedimento y lavar con H2SO4 0,1N.Observar sedimento en cámara Sedgwick-Rafter bajo microscopio para identificación y cuantificación de los huevos. - Recuperar el sedimento observado lavando cuidadosamente la cámara. - Agregar 1 ml de Hipoclorito de Sodio al 0,5% y dejar reposar por 1 min. - Agregar 5 ml de Na Cl 1M, centrifugar por 5 min. a 660 g. - Adicionar al sedimento solución de azul de Trypan. - Observar sedimento en cámara Sedgwick Rafter para viabilidad. - Los huevos viables presentarán coloración café sin teñir, los huevos no viables presentarán tinción azul-violeta.

6 _ Expresión de Resultados V = Volumen de sedimento obtenido después de la concentración y que corresponde a 10g de materia seca inicialmente pesada. NT = Número total de huevos de nematodos y cestodos, contados en el volumen V. Nne = Número de huevos de nematodos observados en el volumen V, sin estructura interna organizada o presentando burbujas de aire. Nc =Número de huevos de Cestodos no viables, presentando un color azulvioleta. N = Número de huevos de Helmintos viables. Luego: N= NT - (Nne + Nc) Resultados Frecuencia de Géneros de Huevos de Helmintos Viables Identificados en Lodos Géneros Trichuris Toxocara Hymenolepis Ascaris Taenia % 22,2 9,3 66,9 1,3 0,3 Géneros de Helmintos identificados en Lodos Trichuris Toxocara Hymenolepis Ascaris Taenia Géneros de huevos identificados (N muestras =20) Porcentaje % Relación %Humedad Lodo v/s Cantidad Promedio de Huevos de Helmintos/10g Materia Seca % Humedad Cantidad Promedio de Huevos/10 g Mat. Seca Lodo Rcto. Total de Huevos Rcto. Huevos Viables 1 a 20% a 40% a 80%

7 50 1 a a a 80 % Humedad (N muestras=20) Cantidad Promedio de Huevos/10g mat. Seca Rcto. Total Huevos Rcto. Huevos viables Discusiones El problema real y significativo en la determinación de la viabilidad de huevos de helmintos, radica fundamentalmente en qué debemos esperar observar un huevo con su estructura interna intacta, organizada, presentando divisiones o una larva formada en su interior? La utilización del Método EPA modificado (Gaspard y Schwartzbrod, 1993; Gaspar et al, 1997), permite dar una respuesta clara a la viabilidad de cestodos y nematodos en muestras de lodo de Plantas de Tratamiento, tal como lo muestra el presente trabajo. Conclusiones Definitivamente la reutilización de los Lodos generados en las Plantas de Tratamiento significa un gran beneficio para la recuperación de suelos y tierras cultivables por el considerable aporte de nutrientes tales como: Nitrógeno, Fósforo, Potasio. El método presentado es una excelente herramienta para dar cumplimiento al Anteproyecto Proyecto Definitivo de Reglamento Sobre Manejo de Lodos No Peligrosos CONAMA El Método EPA modificado (Gaspard y Schwartzbrod, 1993; Gaspar et al, 1997) permite la extracción de los huevos de muestras de Lodos de Plantas de Tratamiento de Aguas Servidas y la determinación de viabilidad a aquellos Nematodos que presentan su estructura interna sin daños, con algún estado de desarrollo, o bien con una larva móvil ya formada (ver anexo ). En cuanto a los Cestodos, la viabilidad está dada por aquellos huevos que son resistentes a la tinción con Azul de Trypan (ver anexo). Con la utilización de esta metodología se ha podido determinar que los géneros de huevos más frecuentes en las muestras de Lodos corresponde a Cestodos, específicamente Hymenolepis y Nematodos Trichuris, Toxocara y Ascaris. Esto puede deberse a que existe un mayor número de personas y animales infectados con este tipo de parásito.

8 Si bien los Huevos de Helmintos tienen una gran resistencia a condiciones ambientales adversas, se puede señalar que la humedad juega un papel importante, pues una gran cantidad de huevos sólo es detectada en muestras con % de humedad entre 60 a 80%. Según las bibliografías consultadas, si bien Chile no es país con graves problemas de helmintiasis, sí se tiene antecedentes que habría una alta incidencia de personas infectadas principalmente con Hymenolepis y Trichuris y si consideramos el aporte de animales que también pueden estar infectados, se explica que este tipo de huevos sean los de mayor frecuencia en las muestras de lodos. Anexo Nematodos viables Toxocara y las consecutivas divisiones o estados de desarrollo hasta la formación de larva (La secuencia de fotografía demuestra la movilidad de la larva de Toxocara) Trichuris y las consecutivas divisiones o estados de desarrollo hasta la formación de Larva Ascaris y las consecutivas divisiones o estados de desarrollo hasta la formación de Larva Nematodos NO Viables Son los que presentan estructura interna dañada o presentando burbujas de aire por ejemplo estos Trichuris Cestodos Viables Son Aquellos que resisten la coloración con Azul de Trypan y conservan su color original Hymenolepis Taenia Dipylidium Cestodos NO Viables Son aquellos que se tiñen de color azul violeta, después de la tinción con azul de Trypan por ejemplo como estos Hymenolepis. Notas Importantes: _ Todos las fotografías de huevos de helmintos que aparecen en este trabajo fueron tomadas con los equipos del Área de Microbiología de ANAM S.A. _ Aumento microscópico de 40x.