ESPECTROFOTOMETRÍA. 1. Naturaleza de la radiación electromagnética: 1 nm = 10-9 m
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- María Josefa Toro San Martín
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1 ESPECTROFOTOMETRÍA 1. Naturaleza de la radiación electromagnética: La radiación electromagnética es una forma de energía radiante. Tiene propiedades ondulatorias, propagándose en forma de ondas. En este fenómeno ondulatorio se definen: Longitud de onda ( ): Se define como la distancia entre dos máximos de un ciclo completo del movimiento ondulatorio. Esta distancia se expresa, según el Sistema Internacional de Unidades (SI), en nanómetros. 1 nm = 10-9 m Frecuencia ( ): Es el número de ciclos por segundo. Es inversa a la longitud de onda. = c/, siendo c la velocidad de la luz La luz está formada por fotones, paquetes discontinuos de energía. La energía de un fotón depende de su frecuencia y de su longitud de onda: erg/seg). E = h = hc /, siendo h la constante de Plank (6,62 x Como se puede observar en la relación anterior, la relación entre la longitud de
2 onda y la energía de una radiación electromagnética es inversa, de manera que cuanto mayor es la longitud de onda de un haz de luz, menor es su energía. El espectro electromagnético cubre un amplio intervalo de energía radiante, incluyendo desde los rayos gamma, de longitud de onda corta, hasta las ondas de radio, de longitud de onda larga. El espectro de divide en regiones, que abarcan intervalos de longitudes de onda más estrechos. Espectro electromagnético Longitud de onda (nm) Rayos gamma Rayos X Ultraviol. Visible Infrarrojo Microond. 0, x 10 3 El ojo humano responde a la radiación electromagnética entre los 380 y 750 nm aproximadamente, pero actualmente disponemos de instrumentos que suplen nuestra limitación, y permiten la medida de radiaciones de longitudes de onda mayores (IR) y menores (UV). La luz solar, o la luz emitida por un filamento de tungsteno, es una mezcla de radiaciones de distinta longitud de onda que al ojo humano se reconoce como blanca. 2. Fenómenos de interacción entre luz y materia: Cuando se produce una interacción entre un haz de luz y la materia, se producen, entre otros, fenómenos de absorción o emisión energética. - Procesos de absorción: Cuando una partícula, que se encuentra en estado de reposo, interacciona con un haz de luz, absorbe energía, y pasa a lo que se denomina estado excitado. La partícula en estado excitado tiende a regresar espontáneamente a su estado de reposo, desprendiendo la energía absorbida en forma de calor. Espectro de absorción: Cada especie absorbente (cromógeno) tiene lo que se llama un espectro de absorción característico. Este espectro representa la relación entre la longitud de onda incidente y la absorbancia que presenta una solución de la especie, en condiciones definidas de trabajo. Al gráfico que resulta de representar en un eje de coordenadas absorbancia (ordenadas) frente a longitud de onda (abscisas), es a lo que llamamos espectro de absorción.
3 Los espectros de absorción son de utilidad tanto para seleccionar la longitud de onda más adecuada para una medida cuantitativa (longitud de onda a la que la absorción es máxima), como para fines de identificación cualitativa. - Proceso de emisión: Algunos compuestos tienen la propiedad, tras ser excitados, de retornar a su estado fundamental, produciendo una emisión de energía radiante. La luz se puede medir, y ello constituye el principio de algunas técnicas, como la fotometría de llama o la fluorescencia. 3. Leyes de absorción: Cuando un haz de luz de intensidad Io incide sobre una cubeta que contiene una solución coloreada que absorbe luz a una determinada longitud de onda, se produce en la solución un proceso de absorción, y el haz de luz que sale después de atravesar la cubeta tiene una intensidad menor, Is. Se define como transmitancia la relación entre la luz incidente y la luz transmitida: T = Is/Io En la práctica, se define el porcentaje de transmitancia: %T = Is/Io x 100
4 En la práctica se emplea, en lugar del valor de transmitancia, el de absorbancia (A), ya que la relación entre la concentración de una solución y su transmitancia es inversa y logarítmica, mientras que la relación entre la absorbancia y concentración es directamente proporcional: A = 2 - log %T La ley de Beer dice que la absorbancia de una solución es directamente proporcional a la concentración y a la longitud del paso de luz. Esta ley tiene una aplicación práctica: determina los métodos experimentales para averiguar la concentración de una sustancia de interés en una solución. Basándonos en la relación lineal entre absorbancia y concentración, podemos conocer la concentración de una solución problema de dos maneras: a) Por comparación con una solución conocida: Si tenemos dos soluciones conocidas, P (problema) y S (estándar de concentración conocida), podemos establecer la siguiente relación matemática entre ellas: As / Ap = Cs / Cp -> Cp = Cs x Ap / As Conocemos el valor de Cs, y para la serie de análisis determinamos experimentalmente el valor de As y el de Ap; con estos datos, calculamos el cociente Cs / As, estableciendo así el valor de un factor, que es constante, y que multiplicado por las absorbancias de sucesivos problemas que se ensayen en la misma serie, nos dará el valor de las concentraciones de estas soluciones problema. b) Curva de calibración: Es la representación gráfica en un eje de coordenadas de absorbancia (ordenadas) frente a concentración (abscisas). El método de trabajo con curva de calibración consiste en ensayar varias soluciones de concentraciones conocidas, y determinar sus absorbancias; a continuación, se construye la curva de calibración (que debe ser una recta), representando las concentraciones frente a sus absorbancias gráficamente. Una vez ensayadas las soluciones problema, su concentración se averigua por interpolación de las absorbancias de las soluciones problema en la recta de calibración.
5 En las determinaciones fotométricas se deben conocer la linealidad que es el intervalo de concentraciones del cromógeno entre las cuales existe una relación lineal entre concentración y absorbancia, es decir, se cumple la ley de Beer. Cuando la concentración de cromógeno en la solución sobrepasa los límites de linealidad, la ley de Beer deja de cumplirse, convirtiéndose la recta de la gráfica en una curva a partir de este punto de concentración. La lectura de una absorbancia fuera de los límites de linealidad se traduce en una concentración falsamente baja de cromógeno; ante esta situación, hay que diluir la muestra, para que su concentración entre dentro de los límites de linealidad. 4. Tipos de aparatos: Según la disposición de los componentes fotométricos, se pueden clasificar en espectrofotómetros de haz simple o de doble haz. a) Los de haz simple constan de: la luz emitida que pasa a través de un monocromador que seleccionará la longitud de onda deseada; unas rendijas de entrada y
6 salida consiguen que el haz de luz sea estrecho, y evitan la luz difusa; la luz pasa a través de la cubeta, donde se produce el proceso de absorción; la luz no absorbida es transmitida al detector, que convierte la energía radiante en energía eléctrica, que es registrada en un lector. Al trabajar con estos aparatos, es necesario un ajuste inicial a 0% de transmitancia, que se consigue sustituyendo la cubeta por un sistema que no deje pasar la luz hasta el detector. A continuación se hace un blanco, colocando una cubeta con todos los componentes de la solución de trabajo exceptuando el cromógeno, y haciendo un ajuste a 100 por 100 de transmitancia (0 de absorbancia). Se hacen lecturas de estándares (soluciones de concentración conocida), y a continuación las de las soluciones problema (concentración desconocida), y se averigua la concentración de los problemas por comparación con los estándares. b) Los espectrofotómetros de doble haz se clasifican como tales en el espacio y en el tiempo. b.1) Espectrofotómetro de doble haz en el espacio: Todos los componentes están duplicados menos la lámpara. Dos haces de luz asan al mismo tiempo a través de los diferentes componentes separados en el espacio. Esta disposición compensa las variaciones de intensidad de la fuente de energía radiante y también las variaciones de absorbancia a medida que se varía la longitud de onda de lectura en una operación de barrido. b.2) Espectrofotómetros de doble haz en el tiempo: Normalmente utilizan los mismos componentes que un instrumento de haz simple. Dos haces de luz pasan a través de los mismos componentes, pero no en el tiempo. Emplean un chopper, consistente en un interruptor rotativo del haz luminoso (es una rueda giratoria con secciones plateadas y rendijas alternas) colocado a continuación de la rendija de salida. Un sistema de espejos dirige la porción de luz reflejada por el chopper a través de una cubeta de referencia y de ahí al detector común. El detector ve alternativamente el haz de luz procedente de la muestra y el de referencia. Esta disposición compensa la variación de la fuente de energía radiante, así como las variaciones de sensibilidad del detector. 5. Fuente de energía radiante:
7 La misión de la fuente de energía es proporcionar energía radiante en forma de luz visible o no visible. UV: Existen distintas lámparas que emiten en distintas zonas del espectro visible y Lámparas de filamento de tungsteno: longitudes de onda del espectro visible y UV próximo Lámparas de filamentos de haluros de tungsteno: emiten mucha luz a longitudes de onda cortas. Lámparas de hidrógeno y deuterio: Producen un espectro continuo en la región UV (220 a 360 nm). Lámparas de vapores de mercurio: emiten un espectro discontinuo o espectro de líneas (313, 365, 405, 436 y 546 nm). 6. Rendijas: La función de las rendijas de entrada es reducir al máximo la luz difusa y evitar que la luz dispersa entre en el sistema de selección de longitud de onda. Las rendijas de salida tienen como función impedir que la luz difusa atraviese la cubeta, lo que generaría desviaciones a la Ley de Beer. 7. Sistemas de selección de longitud de onda: Su finalidad es seleccionar la longitud de onda o intervalos de longitud de onda deseados para el análisis. Se clasifican en filtros y monocromadores. a) Filtros: Es un mecanismo sencillo compuesto por un material que transmite selectivamente una longitud de onda y absorbe todas las demás. b) Monocromadores: El elemento dispersante de la luz puede ser un prisma o una red de difracción: Prismas: Tienen forma de cuña, de vidrio, cuarzo, cloruro sódico o cualquier otro material que permita la transmisión de la luz. Debido a la variación del índice de refracción en función de la longitud de onda, la luz que penetra en prisma se dispersa en mayor o menor medida según la longitud de onda de la luz.
8 8. Cubetas: Redes de difracción: Consisten en un gran número de líneas (hendiduras) paralelas, situadas a distancias iguales entre sí, trazadas sobre un vidrio o superficie metálica. Cuando incide la luz blanca sobre ella, cada hendidura se comporta como un pequeño prisma; la luz se refleja o atraviesa la red de manera que la luz blanca se descompone en varios colores. Es el recipiente donde se coloca la muestra para la medición espectrofotométrica. Pueden ser de forma redondas, cuadradas, o rectangulares, y de tamaño menor o mayor. Habitualmente tienen 1 cm de paso de luz. La mayoría están fabricadas en vidrio, lo cual permite trabajar satisfactoriamente entre longitudes de onda que van de 320 a 950 nm. También existen cubetas de plástico. Para medidas por debajo de 320 nm (UV) es necesario emplear cubetas de cuarzo, que también se podrían emplear para mediciones a longitudes de onda superiores, pero su costo lo desaconseja. 9. Sistemas de detección: Existen dos tipos de detectores empleados tanto en las regiones del visible como del UV: células fotovoltaicas y fototubos. a) Fotocélulas o células fotovoltaicas semiconductoras, o células con capa de barrera: Consisten en una lámina de cobre sobre la que se ha depositado una capa de material semiconductor, como selenio u óxido cuproso. Esta capa está cubierta por una capa de metal transparente que sirve como electrodo colector Al iluminarse a través del electrodo transparente, se produce un flujo de electrones que puede ser medido con un amperímetro. La corriente producida es directamente proporcional a la energía que llega. b) Fototubos multiplicadores: Es un tubo que contiene en su interior un cátodo consistente en una placa de metal que emite electrones de forma proporcional a la energía que incide sobre ella. Contiene además un
9 ánodo, que recoge los electrones, y de 9 a 14 dínodos o niveles de energía. Los electrones producidos en el primer choque contra el cátodo pasan a chocar contra una superficie secundaria, donde cada electrón produce entre 4 y 6 electrones adicionales que van a otro nivel (dínodos), y así sucesivamente, multiplicándose de este modo el efecto del primer choque de la luz contra el cátodo, hasta que los electrones llegan al ánodo, y la señal se amplifica en cientos o miles de veces. 10. Aspectos prácticos: Empleo de blancos: Antes de efectuar una lectura, se debe hacer siempre un blanco. Esta maniobra eliminará las posibles interferencias de absorción o reflexión por parte de la propia cubeta o el solvente del cromógeno. Consiste en hacer una primera medida en la misma cubeta, sólo con el solvente; se establecerá una intensidad inicial relativa a la cubeta y a la solución, que marcará las condiciones iniciales de trabajo. La absorbancia del blanco se restará de las absorbancias que se midan para los problemas. Desviaciones de la Ley de Beer: Son desviaciones producidas en la linealidad de la relación entre concentración y absorbancias. Pueden causarlas diversos factores (concentraciones muy elevadas de cromógeno, la radiación incidente no es monocromática, la absorbancia del solvente es significativa comparada con la del soluto, la luz es transmitida por otros mecanismos, los lados de la cubeta no son paralelos, interferencias con otros cromógenos, existencia de fenómenos de fluorescencia). Curvas de calibración: Relaciona las absorbancias con las concentraciones. Se construye ensayando soluciones de distintas concentraciones, y estableciendo para cada una de ellas su absorbancia a una determinada longitud de onda. Las unidades de concentración empleadas en la curva deben ser las mismas que se vayan a utilizar luego para expresar los resultados. En la construcción de la curva se emplean un mínimo de tres puntos, que se representan en la gráfica, y a continuación se traza una línea recta que se aproxime a ellos lo más posible. Generalmente, a una concentración de 0 corresponde una absorbancia de 0. La curva debe abarcar un rango de concentraciones que se encuentren dentro del límite de linealidad, para que se cumpla la Ley de Beer, y al mismo tiempo la interpolación de cualquier resultado en esta gráfica ofrezca un resultado fiable. Empleo de factores de calibración: Este factor es el resultante de la aplicación de la ecuación básica de la espectrofotometría, y se halla por una simple regla de tres, tras el ensayo de un estándar. Cs/Cp = As/Ap Cp= (Cs/As)Ap Cp= F Ap Para reactivos estables y sistemas fotométricos estables, este factor se puede mantener constante, siendo sólo necesario ensayar las muestras problema, multiplicando la absorbancia resultante por el factor, para conocer la concentración. Cualquier cambio en las condiciones de trabajo (reactivos, ajustes del aparato, etc.) requiere el cálculo de
10 un nuevo factor de calibración.
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