PRÁCTICA XIV: EXTRACCIÓN DO ADN

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1 PRÁCTICA XIV: EXTRACCIÓN DO ADN OBXECTIVOS: Extraer o ADN de diferentes mostras vexetais. FUNDAMENTO: 1º.- A extracción do ADN require unha serie de etapas básicas: En primero lugar ten que racharse a parede celular e a membrana plasmática para poder acceder ao núcleo da célula. A continuación debe racharse tamén a membrana nuclear para deixar libre o ADN. Os deterxentes utilizados como lavalouzas emulsionan os lípidos das membranas celulares e ráchanas. 2º.- O sal evita a unión das proteínas ao ADN. 3º.- Para illar o ADN hai que facer que precipite en alcohol. O ADN é soluble en auga, pero cando se atopa en alcohol desespirilízase e precipita na interfase entre o alcohol e a auga. Ademáis de permitirnos ver o ADN, o alcohol separa o ADN doutros compoñentes celulares, os cales son quedan na solución acuosa. MATERIAL: Mostra vexetal: Pode tratarse de cebola, tomate, plátano, chícharos, etc. Auga destilada ou mineral, alcohol de 96º moi frío, sal de mesa, deterxente lavalouzas, variña de vidro, tubos de ensaio, batidora, cóitelo, vasos de precipitados, colador, probeta ou pipeta PROCEDEMENTO: 1.- No vaso de precipitados pequeno bota 3 culleradiñas de deterxente. 2.- Engade unha cullerrada de sal. 3.- Engade 25 mililitros de auga destilada. É necesario utilizar a pipeta para extraer a cantidade de auga adecuada 4.- Manter nun baño de xeo esta disolución. 5.- Corta a zona central do vexetal elixido en cadrados. 6.- Tritura os anacos do vexetal (no vaso de precipitados grande) cun pouco de auga na batidora (a mestura de células e auga debe ser opaca), accionando 2 veces a impulsos de 10 segundos. Así racharánse moitas células. 7.- Mestura no recipiente grande o triturado celular coa disolución inicial. 8.- Axita vigorosamente a mezcla durante alo menos 5 minutos, sen formar espuma. 9.- Fai pasar o líquido obtido por un colador Retira 5 ml. da mestura a un tubo de ensaio e engade coa pipeta 5 mililitros de alcohol enfriado a 0º C. débese deixar escurrir lentamente o alcohol pola cara interna do tubo de ensaio, tendoo inclinado. O alcohol quedará flotando sobre a mestura Deixa repousar durante 5 minutos ata que se forme unha zona turbia entre as 2 capas. (Mentres agardas este tempo, podes ir recollendo e limpiando tódolos recipientes empregados anteriormente) Introduce unha variña xusto debaixo do alcohol (a zona turbia que queda entre as 2 capas). Remove a variña cara adiante e atrás e pouco a pouco iranse enrolando os fragmentos de maior tamaño de ADN.

2 13.- Pasado un minuto, retira a variña atravesando a capa de alcohol, co cal o ADN quedará adherido a o seu extremo, co aspecto dun copo de algodón mollado Se queres podes observalo ao miccroscopio e para conservarlo ADN pode deixarse secar sobre un papel de filtro. RESULTADOS: O produto filamentoso obtido da extracción non é ADN puro, xa que, entremezclado con el, hai fragmentos de ARN. Unha extracción profesional realizase engadindo enzimas que fragmentan as moléculas de ARN e que impiden que se unan ao ADN. ACTIVIDADES: 1.- Que finalidade ten o expoñer as células a un deterxente forte. 2.- Realiza un debuxo da acción do deterxente sobre as células. 3.- Investiga e explica brevemente en que consiste a electroforese.

3 Cada célula está rodeada pola membrana celular. O ADN atópase dentro do núcleo de cada célula. Para ver o ADN tes que romper estas dúas membranas. Esto é o que facemos co deterxente. Porque deterxente? Como funciona? Pensa porque usas xabón para lavar os cacharros ou as túas mans: para remover a graxa e a suciedade. As moléculas do xabón e da graxa están feitas de dúas partes: A cabeza, a quen lle gusta a auga (hidrófila). As colas, as cales odian a auga (hidrófobas). As moléculas de graxa e xabón organízanse estruturalmente formando burbullas (esferas), as cales teñen as cabezas hacia fora (de forma que estén orientadas hacia a auga) e as súas colas hacia adentro para ocultarse da auga.

4 Cando o xabón entra en contacto coa graxa, a similitude das súas estruturas causa que se combinen formando unha bola de graxa xabonosa. A membrana das células ten dúas capas de moléculas de lípidos (graxa) con proteínas atravesándoas. Cuando o deterxente entra en contacto coa célula, captura os lípidos e as proteínas.

5 Despois de engadir o deterxente. Electroforesis Electrophoresis. Técnica para separar moléculas iónicas mediante la migración diferencial en un soporte sólido de acuerdo con el tamaño y la carga iónica de las moléculas en el campo eléctrico. Las moléculas separadas se localizan mediante su teñido o revelado. Un método que permite separar grandes moléculas (como proteínas o fragmentos de DNA) en una mezcla de moléculas similares. Se pasa una corriente eléctrica por el medio de suspensión y cada molécula. «viaja» por el medio a velocidades diferentes que dependen de su tamaño y carga eléctrica. La separación se basa en estas diferencias. La agarosa y los geles de acrilamida se usan comúnmente para separar ácidos nucleicos y proteínas. Electroforesis en gel con gradiente desnaturalizante Denaturing gradient gel electrophoresis (DDGE). Técnica para detectar sustituciones de una sola base en fragmentos de DNA. Las dos cadenas de DNA se disocian al aumentar la concentración de un agente desnaturalizante como la urea, comenzando por las regiones que están unidas más débilmente. Como la unión entre el par AT es más débil que la del par GC, las regiones ricas en AT tienden a separarse antes en estas condiciones desnaturalizantes. Cuando se somete a un DNA de doble hélice a una electroforesis en gradiente desnaturalizante, en el punto en el que las cadenas comiencen a separarse la velocidad de migración se reduce brúscamente debido a la configuración más relajada del dúplex. Si el fragmento de DNA contiene un mal apareamiento en una región de la molécula que se desnaturaliza pronto, se altera el perfil electroforético cuando se compara con el de un homoduplex de cadenas perfectamente complementarias. Electroforesis en gel con campo pulsante Pulse-field gel electrophoresis (PFGE). Técnica que se emplea para separar moléculas de DNA de tamaño superior a 20 kb, ya que la electroforesis en gel de agarosa al 0,5 1,0% no separa las moléculas mayores de este tamaño. Se utilizan alteraciones frecuentes de la dirección del campo eléctrico. Existen diferentes formas prácticas para esta técnica, las dos más generales son: 1. Electroforesis de gradiente en gel con campo pulsante (Pulse field gradient gel electrophoresis). Utiliza al menos dos campos eléctricos alternativos que se cruzan en el plano del gel. 2. Electroforesis en gel con inversión de campo (Field inversion gel electrophoresis). Utiliza un sólo campo eléctrico cuya polaridad se invierte periódicamente.