UNIVERSIDAD AUSTRAL DE CHILE FACULTAD DE CIENCIAS VETERINARIAS INSTITUTO DE CIENCIA ANIMAL

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1 UNIVERSIDAD AUSTRAL DE CHILE FACULTAD DE CIENCIAS VETERINARIAS INSTITUTO DE CIENCIA ANIMAL EFECTO DE LA ADMINISTRACIÓN INTRAVAGINAL DE PLASMA SEMINAL DE LLAMA (LAMA GLAMA) Y TORO (BOS TAURUS) SOBRE LA DINÁMICA FOLICULAR Y LUTEAL EN VACAS HOLSTEIN FRIESIAN PREVIAMENTE SINCRONIZADAS CON PROGESTERONA Memoria de Título presentada como parte de los requisitos para optar al TÍTULO DE MÉDICO VETERINARIO JAIME RODRIGO VARGAS UGARTE VALDIVIA CHILE 2012

2 PROFESOR PATROCINANTE Dr. Marcelo Ratto Nombre Firma PROFESOR COPATROCINANTE Dr. Claudia Letelier Nombre Firma PROFESOR CALIFICADOR Dr. Alfredo Ramírez Nombre Firma PROFESOR CALIFICADOR Dr. Jorge Oltra Nombre Firma FECHA DE APROBACIÓN: 17 de Enero del 2012

3 A mis padres y familiares, por su amor y apoyo incondicional.

4 ÍNDICE Capítulo Página 1. RESUMEN SUMMARY INTRODUCCIÓN MATERIAL Y MÉTODOS RESULTADOS DISCUSIÓN REFERENCIAS AGRADECIMIENTOS...21

5 1 1. RESUMEN Las especies domesticas han sido clasificadas de acuerdo a su mecanismo de ovulación en ovuladores espontáneos o inducidos basándose en el tipo de estímulo responsable para inducir la liberación de GnRH desde el hipotálamo. A partir de esta división, varios estudios se han realizado con el fin de esclarecer el proceso de ovulación para cada grupo. El plasma seminal ha sido caracterizado como un vehículo para transportar los espermatozoides, sin embargo, se sabe que contiene sustancias que podrían modular la función espermática como así también la función reproductiva de la hembra. El objetivo de este estudio fue determinar el efecto de la administración intravaginal de plasma seminal de llama y toro sobre la función ovárica en vacas Holstein Friesian en lactancia. Un grupo de hembras adultas, de condición corporal 3,0 en promedio, en periodo de lactancia con más de 45 días post-parto (n=15), con 400 kg de peso vivo aproximadamente, fueron utilizadas en este estudio durante los meses de marzo-abril. Todos los animales fueron sincronizados utilizando un protocolo basado en Benzoato de estradiol más un Dispositivo Intravaginal Bovino (DIB, Syntex, Argentina), además de una dosis de prostaglandina. Este protocolo consistió en la inserción intravaginal de un dispositivo conteniendo 1 g de progesterona acompañado de una administración intramuscular de 2 mg de Benzoato de estradiol (Día 1= Inserción del dispositivo). El dispositivo fue retirado por el día 8 junto con una administración intramuscular de 25 mg de PGF2 α. Al retiro de los dispositivos intravaginales, los animales fueron asignados al azar para recibir una dosis intravaginal de 2 ml de: a) plasma seminal de llama, b) plasma seminal de toro y c) PBS (control negativo, Fosfato Buffer Salino). La respuesta ovárica fue monitoreada en forma diaria mediante ecografía transrectal (Aloka SSD-500, Aloka, Japón), utilizando un transductor lineal de 7.5 MHz comenzando el día del retiro de los dispositivos y administración del plasma seminal, hasta el día 28 de tratamiento con el propósito de detectar cambios en el folículo dominante luego de administrar la dosis de plasma seminal, intervalo desde el tratamiento hasta la ovulación (Día=0) y emergencia de onda folicular, máximo diámetro del folículo dominante de la onda emergente y cambio en el tamaño del CL posterior al tratamiento intravaginal. No se observo efecto de plasma seminal de llama y toro sobre el intervalo desde el momento del tratamiento a la ovulación, pero se observó una tendencia con respecto al intervalo desde el tratamiento a la emergencia de la nueva onda folicular para los animales tratados con plasma seminal de llama y toro al igual que en el intervalo desde inicio del tratamiento y la aparición del folículo dominante de la onda emergente. En vacas tratadas con plasma seminal de llama se observo una temprana regresión del folículo dominante de la onda emergente acortando su vida media en comparación con el resto de los grupos. Además, se observo que solo el plasma seminal de toro tuvo un marcado efecto en el tamaño y duración del cuerpo lúteo sugiriendo que el plasma seminal contiene factores con acción luteotrópico. Palabras clave: Plasma seminal, intravaginal, ovulación, cuerpo lúteo.

6 2 2. SUMMARY EFFECT OF THE LLAMA (LAMA GLAMA) OR BULL (BOS TAURUS) SEMINAL PLASMA INTRAVAGINAL ADMINISTRATION OVER FOLLICULAR AND LUTEAL DYNAMIC ON HOLSTEIN FRIESIAN COWS TREATED WITH PROGESTERONE Domestic species have been classified according to their mechanism of ovulation in spontaneous or induced ovulators based on the type of stimulus induce the release of GnRH from the hypothalamus. From this division, several studies have been conducted to clarify the process of ovulation for each group. The seminal plasma have been characterized as a vehicle to transport the sperm, however, is known that it contain substances that could modulate sperm and female reproductive function. The objective of this study was to determine the effect of intravaginal deposition of llama or bull seminal plasma on the ovarian function in lactating Holstein Friesian cows. For this porpoise, a group of lactating adult females with more than 45 days postpartum (n = 15), with 400 kg of live weight approximately and a body condition score of 3.0, were used in this study during the months of March-April. All females were synchronized using a protocol based on estradiol benzoate plus Bovine Intravaginal device (DIB, Syntex, Argentina). This protocol consisted in inserting an intravaginal device containing 1 g of progesterone accompanied by an intramuscular administration of 2 mg estradiol benzoate (Day 1 = Inserting the device). The device was removed at day 8 with intramuscular administration of 25 mg of PGF2 α. At the withdrawal of intravaginal devices, animals were randomized to receive intravaginal dose of 2 ml of: a) llama seminal plasma, b) bull seminal plasma c) PBS (negative control, phosphate buffered saline). Ovarian response was monitored on a daily basis transrectal ultrasonography (Aloka SSD- 500, Aloka, Japan) using a 7.5 MHz linear transducer starting the day of withdrawal of the devices and administration of seminal plasma, until day 28 of treatment in order to detect changes in dominant follicle at the time of intravaginal deposition, interval from treatment to ovulation (Day = 0) and follicular wave emergence, maximum diameter of dominant follicle emerging wave of change in the size of subsequent CL intravaginal treatment. There was no effect of llama and bull seminal plasma on the treatment to ovulation interval, but there was a trend over the treatment to emergence of new follicular wave interval for animals treated with llama and bull seminal plasma as in treatment to dominant follicle of the new wave emergence interval. In cows treated with llama seminal plasma was observed an early regression of the dominant follicle emerging wave shortening its half-life compared to other groups. In addition, we observed that only bull seminal plasma had a marked effect on the size and duration of the corpus luteum, suggesting that seminal plasma contains factors luteotrophic action. Keywords: Seminal plasma, intravaginal, ovulation, corpus luteum.

7 3 3. INTRODUCCIÓN La ovulación en las especies domesticas es un fenómeno mediante el cual un folículo maduro libera un ovocito hacia el oviducto. Varios factores son determinantes del mecanismo ovulatorio tales como ambientales, químicos y/o mecánicos (Vetharaniam y col, 2010). Conaway (1971), clasificó las especies de acuerdo al tipo de ovulación en ovuladores espontáneos o inducidos. Esta clasificación se basa en el tipo de estímulo responsable de la liberación de la hormona liberadora de gonadotrofínas (GnRH) desde el hipotálamo. En especies ovuladoras espontáneas, esta liberación se gatilla cuando en presencia de niveles bajos de progesterona, el estradiol producido por un folículo preovulatorio alcanza un determinado umbral capaz de desencadenar la secreción de GnRH, seguida de un alza preovulatoria de hormona luteinizante (LH). En especies ovuladoras inducidas o reflejas, el estímulo que libera GnRH es una señal neural ligada a la cópula, activándose de igual forma el centro preovulatorio de GnRH (Adams y col, 2005).Varios estudios se han realizado con el propósito de caracterizar y esclarecer el proceso de ovulación para cada grupo y en especial para el de ovuladores reflejos, ya que al igual que en los espontáneos, el aumento de LH parece ser requerido en la ovulación, sin embargo, este se encuentra relacionado a una señal neural durante la cópula capaz de estimular la liberación de GnRH. (Adams y col 2005; Tanco 2008). Existen teorías que sugieren que los ovuladores espontáneos evolucionaron de los ovuladores inducidos. Los ovuladores inducidos, aparecieron temprano en el orden Lagomorpha y Rodentia, y posteriormente en los íntimamente relacionados Insectivora y Carnivora (Conaway, 1971). Sin embargo, la existencia de ovuladores inducidos en el orden Artiodactyla como son los camélidos, sugiere que este fenómeno podría no ser una característica ancestral (Ratto y col, 2006). Algunas hipótesis que avalan esto, son aquellas que señalan que la ovulación inducida se generó en ciertas especies por selección natural de esta característica que favorecía el proceso de reproducción a través de un estado constante de receptividad al apareamiento que permitirían máximas posibilidades de concepción en animales que constantemente cambiaban de ambientes, como el caso de los camélidos, los que se originaron en Norte América y fueron forzados a desplazarse durante la última glaciación a diferentes partes del mundo, evolucionando a camellos, dromedarios y camélidos sudamericanos (Wheeler, 1995; Lariviere y Ferguson, 2003). Estudios demuestran que, existen vestigios de esta forma de ovulación en vacas, lo que sugiere que este fenómeno precede la separación del orden Tylopoda desde el orden Artiodactyla (Tanco, 2008). Existe evidencia de que el plasma seminal (PS), fase liquida del semen, induce ovulación en llamas y alpacas, con una respuesta que varía de acuerdo al sito de aplicación (Ratto y col, 2005; Tanco 2008). Actualmente se ha descubierto que un factor, presente en el plasma seminal de diferentes especies, es responsable de inducir un aumento preovulatorio de LH, seguido de ovulación y formación de Cuerpo Lúteo (CL) cuando este es administrado vía intramuscular o por vía intravaginal en llamas y alpacas. Estudios realizados en bovinos (Tanco 2008) comunicaron

8 4 que la administración intramuscular de plasma seminal de llamas indujo cambios en la dinámica folicular y luteal como así también en la secreción de progesterona. 3.1 HEMBRA BOVINA: UNA ESPECIE OVULADORA ESPONTANEA Especies pertenecientes al grupo de los ovuladores espontáneos son aquellas capaces de ovular a intervalos regulares sin la necesidad de estimulación física del coito. Esta categoría incluye muchas de las especies domésticas, como son los equinos, caninos y bovinos (Tanco, 2008). La hembra bovina en este caso, es un animal poliéstrico continuo, con un ciclo estral aproximado de 21 días. En un animal ovulador espontáneo, el ciclo reproductivo está regulado por hormonas producidas en diferentes tejidos u órganos, como son; GnRH secretada por el hipotálamo; hormona folículo estimulante (FSH) y LH, secretadas desde la adenohipófisis, esteroides tales como progesterona (P 4 ) y estradiol producidos por diferentes estructuras ováricas tal como el cuerpo lúteo y folículo respectivamente y prostaglandina F2α (PGF2α), producida a nivel uterino (Evans y Canty, 2004; Forde y col 2010). Estas hormonas funcionan a través de un sistema de retroalimentación, tanto positiva como negativa que rigen el ciclo estral (Forde y col 2010). Dentro del ciclo estral, se pueden establecer dos periodos bien definidos, como son la fase folicular y la fase luteal, a lo largo de los cuales se desarrollan las ondas foliculares (Sirois y Fortune, 1988; Ginther y col, 1989). En cuanto a la fase folicular, esta es la más corta de las dos fases, con una duración de 4-6 días y se extiende desde la regresión del cuerpo lúteo hasta la ovulación del folículo dominante. Este periodo abarca el proestro y estro, donde se producirá además la expresión del comportamiento de estro característico de la hembra (Tanco 2008; Forder y col 2010). Es importante destacar que la duración de esta etapa está determinada por el folículo preovulatorio y la relación que se genera entre el estradiol producido por este y los niveles bajos de progesterona (Vetharaniam y col 2010). Por otro lado, la fase luteal es la más larga del ciclo, teniendo una duración de días, y comienza inmediatamente después de la ovulación abarcando el metaestro y diestro, pudiendo observarse un cuerpo lúteo como estructura predominante (Forder y col, 2010). El crecimiento, desarrollo y maduración de los folículos ováricos es fundamental para una alta eficiencia reproductiva. (Forder y col, 2010). Una onda folicular se caracteriza por la emergencia sincrónica de un grupo de folículos en el cual uno de ellos será seleccionado como potencial folículo ovulatorio. (Evans y Canty, 2004; Sirois y Fortune, 1988; Henao, 2001). Cada onda folicular está precedida de un aumento de FSH, responsable del reclutamiento de un grupo de folículos fisiológicamente aptos para seguir con su desarrollo, de aproximadamente 5 mm de diámetro (Adams y col, 1992; Tanco, 2008). Tres días posteriores a la emergencia folicular se selecciona un folículo del resto de la población, el cual se diferenciara en tamaño de los otros folículos, proceso conocido como selección del folículo dominante, en esta etapa este folículo adquiere receptores de LH y continuara su crecimiento mediante pulsos de LH (Tanco, 2008; Adams y col, 2008). En el caso de que exista presencia de un cuerpo lúteo funcional, el folículo dominante eventualmente se atresia al igual que los subordinados, debido a la constante falta de

9 5 FSH y LH (Adams y col, 1992; Tanco, 2008). La involución del folículo dominante disminuye la producción de inhibina y estradiol, acabándose así la retroalimentación negativa que bloquea hipotálamo/hipófisis, por lo que la secreción de FSH puede aumentar emergiendo de esta forma una nueva onda folicular (Forder y col, 2010). Sin embargo el folículo dominante de la onda preovulatoria secreta estradiol el cual al llegar a un determinado umbral de concentración estimula el centro preovulatorio de LH y ovulación (Evans y Canty, 2004; Tanco, 2008; Adams y col, 2008). 3.2 HEMBRA LLAMA: UNA ESPECIE OVULADORA INDUCIDA Según la división, hecha por Conaway (1971), los ovuladores inducidos, son aquellos animales en que la ovulación no ocurrirá a menos de ser estimulados por el coito, como son conejos y gatos, además de camélidos del viejo y del nuevo mundo o sudamericanos, entre otras especies (Adams y col, 2005; Tanco, 2008). La mayor cantidad de investigación en camélidos sudamericanos se ha realizado en las dos especies domésticas, como son la alpaca (Lama pacos) y la llama (Lama glama) (Vaughan y Tibary, 2005). En general, en ausencia del macho, las hembras de llamas y alpacas permanecen receptivas aproximadamente por 36 días para luego caer en un periodo corto de no receptividad, no mayor a 48 horas (San-Martin y col, 1968). Esta receptividad a la monta, se mantiene la mayor parte del tiempo y es independiente el desarrollo folicular (Vaughan, 2010). No obstante, las hembras requieren estimulación coital y eyaculación para inducir la ovulación del folículo dominante, además del hecho de que el animal no se encuentre en fase luteal o gestante. Otros estímulos físicos, olfatorios y visuales, sin la asociación del coito, pueden inducir la ovulación, pero estos son menos efectivos que la monta. En llamas y alpacas se describe un 5% de ovulación espontánea, observándose una mayor incidencia en hembras posparto (Vaughan y Tibary, 2005). El ciclo sexual de los camélidos, al igual que en la hembra bovina puede ser dividido en fases, folicular y luteal. Durante la fase folicular, al igual que en la vaca, la estructura dominante en el ovario, son folículos que crecen en patrón de ondas, con selección de uno dominante y regresión de los subordinados. Sin embargo, la ovulación no ocurre en intervalos irregulares, como en vacas. De ocurrir la ovulación, la hembra entra en fase luteal, caracterizada al igual que en la vaca por la presencia de un cuerpo lúteo, elevados niveles de progesterona y conducta no receptiva a la monta. (Tanco, 2008). La regulación hormonal de la dinámica folicular no ha sido tan estudiada como en el caso del bovino, pero actualmente se conoce que los niveles de estradiol plasmático se correlacionan positivamente al tamaño folicular días luego de iniciado el crecimiento folicular, pero no estimulan el alza preovulatoria de LH (Vaughan y Tibary, 2005). Aumentos periódicos de FSH responsables del estímulo de emergencia de ondas foliculares no han sido demostrados en llamas, como en el caso de la hembra bovina. Cambios en la frecuencia de pulsos de LH regula la etapa final del crecimiento folicular en los camélidos sudamericanos (Vaughan y Tibary, 2005).

10 6 El mecanismo relacionado a la ovulación involucra la estimulación del aumento preovulatorio de LH. Administración de estradiol exógeno en conejos no induce secreción de LH a diferencia de la vaca. Al igual que en ovuladores espontáneos, GnRH es secretada en forma de pulsos desde el hipotálamo (Tanco, 2008). Estudios en llamas demuestran que los pulsos de LH aumentan luego de 15 minutos de la copula, sufriendo un alza luego de 2 horas y disminuyendo a niveles basales luego de 7 horas (Ratto y col, 2005). El estímulo que gatilla la activación del aumento preovulatorio de LH en ovuladores inducidos, se ha atribuido primariamente a una respuesta neuroendocrina a una estimulación física a nivel genital durante la copula u otros estímulos físicos a nivel olfatorio, auditivo o visuales (Bravo y col, 1990). Se ha podido concluir que la monta acompañada de la intromisión del pene es necesaria para estimular la ovulación (Adams y col, 2005). Recientemente se ha documentado la existencia de un factor inductor de ovulación (OIF) presente en el plasma seminal de llamas y alpacas. (Ratto y col, 2005, 2006, 2010,2011). Se ha demostrado que este factor induce el peak preovulatorio de LH seguido de ovulación cuando es administrado en forma intramuscular o depositado intravaginal en alpacas y llamas. 3.3 FACTOR INDUCTOR DE OVULACIÓN (OIF) Hace 50 años atrás, Thaddeus Mann, dio a conocer las propiedades naturales del plasma seminal como un vehículo para el transporte de espermatozoides, controlador de la motilidad y capacitación espermática, y como estimulador de las contracciones uterinas (Ratto y col 2010). Actualmente se conoce que además contiene sustancias como proteínas, citoquinas, factores de crecimiento y hormonas que afectan los espermatozoides, además de la función reproductiva de la hembra (Robertson, 2007). El OIF, posee una masa molecular de aproximadamente 14 kda, resistente a la digestión de proteinasa K, a la incubación a 38 C por 12 hrs o a 65 C durante 1 hora, siendo solo degradado enzimáticamente por pronasa E, resultando este compuesto en una molécula proteica resistente (Ratto y col, 2010). Se demostró que la administración de plasma seminal vía intravaginal e intramuscular induce ovulación en llamas y alpacas, sin embargo el mayor porcentaje de ovulación se obtuvo con el plasma seminal administrado vía intramuscular, 90%. (Ratto y col, 2005; Tanco 2008). Además, la administración de plasma seminal, tuvo un efecto marcado en el aumento de LH preovulatoria, observándose posteriormente cuerpo lúteo de mayor tamaño y concentración de P 4 plasmática mayor que los animales tratados con GnRH (Ratto y col, 2010) por lo tanto se ha postulado que este factor podría tener un efecto luteotrofico. En la actualidad, se ha comenzado a estudiar el rol del semen y plasma seminal en la inducción de la ovulación en diferentes especies (Tanco, 2008). Este factor inductor de ovulación, ha sido detectado en el plasma seminal de especies de ovulación espontanea, como son el bovino, equino y porcino (Ratto y col 2010). Se ha demostrado que un 26% de las llamas tratadas con plasma seminal de toro ovularon (Ratto y col, 2006). Un estudio anterior, sugiere que la presencia de OIF en semen de toro permitiría la ovulación en camélidos (Chen y col, 1985). Así mismo, la monta natural realizada dentro de las

11 7 primeras 6-8 horas del estro en bovinos adelanta el alza preovulatoria de LH como así también la ovulación (Marion y col, 1950). Estas evidencias sugieren que el plasma seminal de las especies domesticas cumple un rol mucho más activo del que se pensaba (Transporte de espermatozoides) sino que también podría participar en procesos de la actividad ovárica y uterina. El rol del OIF en el bovino no ha sido determinado por completo, un estudio realizado en la Universidad de Saskatoon, Canada (Tanco, 2008), demostró que la administración intramuscular de OIF de llama en hembras bovinas pre púberes no induce ovulación, sin embargo indujo un alza de FSH seguido de la emergencia de una nueva onda folicular. Cuando OIF fue administrado en vacas adultas se observaron efectos sobre secreción de gonadotrofinas y sobre el desarrollo del folículo dominante, como así también sobre el cuerpo lúteo aumentando la producción de progesterona. Este efecto parece ser más evidente cuando la administración del OIF es realizada 6 días posterior a la ovulación (Tanco, 2008; Ratto, 2010). Dado estos antecedentes presentados, el plasma seminal de llamas y toros podrían tener un efecto modulador de la dinámica folicular y luteal en vacas lecheras. En el presente estudio, se plantea como hipótesis que la administración intravaginal de plasma seminal de toro y llama modifican la dinámica folicular y luteal en vacas Holstein Fresian en lactancia.

12 8 4. MATERIALES Y MÉTODOS 4.1 COLECCIÓN DE PLASMA SEMINAL El semen fue colectado de machos adultos (7 llamas, 7 toros), 2 veces por semana, durante un periodo de dos meses usando una vagina artificial y un maniquí. Para disminuir la viscosidad del semen de llama, este fue diluido en una proporción de 1:1 con un Buffer Fosfato Salino (PBS). Las muestras fueron centrifugadas a 1500 x g por 30 minutos para separar los espermatozoides del plasma seminal. Una gota del sobrenadante se evaluó al microscopio óptico para confirmar la ausencia de gametos. De haber presencia de espermatozoides remanentes se centrifugó y nuevamente fue evaluada la muestra al microscopio. Muestras libres de espermatozoides fueron almacenadas a -70 C hasta su uso. 4.2 ANIMALES Y TRATAMIENTO El presente estudio se realizó en los predios Santa Rosa y Vista Alegre de la Universidad Austral de Chile, Valdivia, Chile. Un grupo (n=15) de vacas lecheras adultas, de entre 3 y 7 años de edad, raza Holstein Friesian en lactancia, con mas 45 días post-parto, 400 kg de peso vivo aproximado y un promedio 3,0 de condición corporal (C.C.), fueron utilizadas en este estudio durante los meses de marzo-abril. Para sincronizar el estado folicular de los animales, se utilizó un protocolo de sincronización a base de Benzoato de estradiol más un Dispositivo Intravaginal Bovino (DIB, Syntex, Argentina) y prostaglandina F2α (PGF2α). Este protocolo consiste en la inserción intravaginal de un dispositivo conteniendo 1 g de progesterona acompañado de una administración intramuscular de 2 mg de Benzoato de estradiol (Día 1= Inserción del dispositivo). El dispositivo fue retirado por el día 8 junto con una administración intramuscular de 25 mg de PGF2α. Al retiro de los dispositivos intravaginales, los animales fueron asignados al azar para recibir una dosis intravaginal de 2 ml de: a) plasma seminal de llama, b) plasma seminal de toro y c) PBS (control negativo, Fosfato Buffer Salino). La respuesta ovárica fue monitoreada diariamente mediante ecografía transrectal (Aloka SSD-500, Aloka, Japón), utilizando un transductor lineal de 7.5 MHz comenzando el día del retiro de los dispositivos y administración del plasma seminal, hasta el día 28 de tratamiento con el propósito de detectar cambios en el folículo dominante al momento del depósito intravaginal, intervalo desde el tratamiento hasta la ovulación (Día=0) y emergencia de onda folicular, máximo diámetro del folículo dominante de la onda emergente y cambio en el tamaño del CL.

13 9 4.3 ANALISIS ESTADÍSTICO Diámetro folicular (mm) al momento del tratamiento, número de hembras por grupo que ovularon, intervalo (días) desde el tratamiento a la ovulación, desde tratamiento a la emergencia de una onda folicular y a la observación del folículo dominante de la nueva onda, diámetro máximo (mm) del cuerpo lúteo, día de primera observación del cuerpo lúteo y diámetros luteales entre los días 5-7 y al día 10 posterior a la ovulación, fueron analizados mediante análisis de varianza de una vía y de existir diferencias entre los tratamiento se utilizo un pos-test de Tukey. Datos seriados, como perfil de diámetros de folículos dominantes y cuerpos lúteos, fueron comparados entre grupos por análisis de varianza de una vía para muestras repetidas.

14 10 5. RESULTADOS 5.1 SEGUIMIENTO POR ULTRASONOGRAFÍA TRANSRECTAL Dinámica folicular El diámetro del folículo preovulatorio fue similar entre los grupos al momento del tratamiento, al igual que para el caso de la condición corporal (CC) de los animales (Tabla 1, Gráfico 1). Las hembras pertenecientes a todos los grupos experimentales ovularon, sin embargo el intervalo entre el tratamiento y ovulación no difirió entre los grupos. El intervalo entre el tratamiento y la emergencia de una nueva onda folicular tendió (P=0,15) a ser más corto en los grupos tratados con plasma seminal de llama (5,5 ± 1,2 d) y toro (5,8 ± 0,4 d) en comparación a lo observado en el grupo control (7,5 ± 0,3 d). Similarmente el intervalo entre el tratamiento a la detección del folículo dominante tendió (P=0,18) a ser más corto en los grupos tratados con plasma seminal de llama y toro respectivamente (Tabla 1). Tabla 1. Efecto de la administración intravaginal de plasma seminal de toro, llama o PBS (Control negativo) sobre el intervalo de tiempo desde el tratamiento a ovulación, emergencia folicular y detección del folículo dominante de la onda emergente en vacas en lactancia (media ± EE). Tratamientos Variables PBS PSLL PSB P-Valor Tamaño folicular al momento del tratamiento 14 ± 2,8 13,5 ± 1,9 12 ± 0,8 0,7304 Total hembras ovuladas 4 ± 0 4 ± 0 5 ± 0 0,9827 Intervalo tratamientoovulación 4,5 ± 0,3 4,75 ± 1,1 4,2 ± 0,5 0,8496 Intervalo tratamientoemergencia 1º onda folicular 7,5 ± 0,3 5,5 ± 1,2 5,8 ± 0,4 0,1522 Intervalo tratamientofolículo dominante 1º onda 10,2 ± 1,6 7 ± 1,8 7 ± 0,4 0,1846 *PBS= Fosfato Buffer Salino; PSLL=Plasma Seminal de Llama; PSB= Plasma Seminal Bovino)

15 11 Gráfico 1. Puntuación de condición corporal (media ± EE) en vacas lactantes al momento del tratamiento (P=0,73). *PBS= Fosfato Buffer Salino; PS Plasma Seminal. En relación a la dinámica folicular, se observo un efecto de interacción Tratamiento por Tiempo sobre los perfiles de diámetro del folículo dominante de la nueva onda donde la vida media del folículo dominarte fue más corta en vacas tratadas con plasma seminal de llama (Gráfico 2).

16 12 Gráfico 2. Perfil de diametro del foliculo dominante (media ± EE) en vacas lactantes tratadas con dosis intravaginal de plasma seminal de llama, toro, o PBS (Control negativo) *PBS= Fosfato Buffer Salino; PS Plasma Seminal Dinámica luteal En relación al desarrollo luteal, no se observaron diferencias significativas en cuanto al intervalo desde el tratamiento hasta el día del primer registro ultrasonográfico del cuerpo lúteo ni en cuanto al diámetro máximo alcanzado por esta estructura (Tabla 2). De igual forma, no se observó diferencia significativa para los tamaños del cuerpo lúteo medidos los días 5-7 y 10 posterior a la ovulación entre los grupos experimentales (Tabla 2).

17 13 Tabla 2. Efecto de la administración intravaginal de plasma seminal de toro, llama o PBS (Control negativo) sobre el desarrollo del Cuerpo Lúteo de vacas en lactancia (media ± EE). Tratamientos Variables PBS PSLL PSB P -valor Día tratamiento- 1 era observación CL 5,5 ± 0,3 6,2 ± 0,8 5,4 ± 0,6 0,5632 Máximo tamaño CL 30,3 ± 4,1 29,6 ± 1,8 28,7 ± 2,1 0,9091 Tamaño CL día 5-7 postovulación 25,6 ± 6,2 23,0 ± 4,0 21 ± 1,4 0,7135 Tamaño CL día 10 postovulación 27,0 ± 4,3 25,3 ± 2,1 25,5 ± 1,8 0,9075 *PBS= Fosfato Buffer Salino; PSLL=Plasma Seminal de Llama; PSB= Plasma Seminal Bovino Con respecto al perfil de diámetro del CL, se observó un efecto de interacción Tratamiento por Tiempo donde la vida media del mismo fue más prolongada en los animales tratados con plasma seminal bovino (Gráfico 3).

18 Gráfico 3. Perfil de diametro luteal (media ± EE) en vacas lactantes tratadas con dosis intravaginal de plasma seminal de llama, toro, o PBS (Control negativo). *PBS= Fosfato Buffer Salino; PS=Plasma Seminal. 14

19 15 6. DISCUSIÓN Basados en los resultados obtenidos en el presente estudio, la administración intravaginal de plasma seminal de llama y toro en vacas en lactancia tendieron a acortar el intervalo desde el tratamiento a la emergencia de la nueva onda folicular como así también el intervalo desde inicio del tratamiento a la aparición del folículo dominante de la onda emergente. Así mismo, en las vacas tratadas con plasma seminal de llama se observo una temprana regresión del folículo dominante de la onda emergente acortando su vida media en comparación con el resto de los grupos. Además, se observó que solo el plasma seminal homólogo tuvo un marcado efecto en el desarrollo y duración del cuerpo lúteo sugiriendo que el plasma seminal contiene factores con acción luteotrópica. Solamente el plasma seminal de toro tuvo cierto efecto sobre la dinámica luteal en las hembras a pesar de haber administrado una dosis de plasma seminal mucho menor con respecto al volumen de eyaculado promedio de la especie. Sin embargo el toro posee glándulas accesorias que están ausentes en la llama por lo cual, tanto la concentración de proteínas como la presencia de otros factores pudieron haber influenciado este efecto luteotrópico. Así mismo, no se podría descartar que tal vez la concentración de OIF por ml de PS utilizado sea mayor o suficiente para inducir dicho efecto. Bogle (2009) realizó estudios, con el fin de inducir ovulación en hembras llamas, mediante la administración de diferentes dosis de plasma seminal de potro y verraco (Bogle, 2009). En dicho experimento, al utilizar una dosis alta de plasma seminal de ambas especies, no se logró inducir ovulación en ninguna de las llamas tratadas, lo que se podría deber a que se excedió la dosis máxima para ejercer un efecto y una posible desensibilización en la interacción ligandoreceptor, lo que podría explicar el porqué se observaron resultados con un volumen bajo de PS homologo, sumado al hecho de que podrían existir diferencias en la glicosilación del OIF entre especies, lo que también podría explicar la no respuesta por parte del grupo tratado con PS de llama. Por otra parte, no se observo efecto del plasma seminal de llama y toro sobre el intervalo desde el momento del tratamiento a la ovulación, a diferencia de lo observado por Marion y col (1950), quienes reportaron que la monta natural en bovinos efectuada dentro de la primeras 6-8 horas de iniciado el estro acelera la ovulación. Posiblemente, este efecto no pudo ser visualizado en el presente estudio debido a que la administración del plasma seminal fue realizada al momento del retiro del implante de progesterona por lo cual las hembras no presentaban manifestación de celo. La ovulación es un mecanismo complejo por el cual se produce la ruptura de un folículo preovulatorio y la liberación de un ovocito. Desde que Conaway (1971) clasificó las especies animales en dos categorías, ovuladores inducidos o reflejos y ovuladores espontáneos, varios

20 16 estudios se han llevado a cabo para esclarecer la naturaleza del mecanismo de ovulación en ambas categorías. Además postuló que el fenómeno de la ovulación inducida es observado a través de la mayoría de los ordenes taxonómicos y que por ende no debe ser considerado como un opuesto a la ovulación espontánea, sino que como otra vía para lograr la ovulación (Conaway, 1971). El plasma seminal ha sido considerado por muchos años como un medio de transporte de los espermatozoides a través del tracto reproductivo del macho y de la hembra durante la monta. En la actualidad, se sabe que también contiene sustancias tales como proteínas, citoquinas, factores de crecimiento y hormonas que afectan los espermatozoides y funciones reproductivas en la hembra (Tanco, 2008). Recientemente se descubrió la presencia de un OIF en el plasma seminal de alpacas y llamas, el cual es responsable de desencadenar un alza de LH e inducir ovulación en aproximadamente un 90% de las hembras al ser administrado intramuscularmente. Este hallazgo llevó a cuestionar si este factor se debe a una característica evolutiva y si está presente en otras especies (Adams y col, 2005). Hoy en día se sabe que este factor está presente en especies catalogadas como ovuladores espontáneos, tales como porcina y bovina. El primer indicio de esto fue descrito por Marion y col (1950). Otro estudio que sostiene la teoría de la presencia del OIF en diferentes especies, fue el realizado por Chen y col (1985), quienes observaron que tras administrar plasma seminal de toro en camélidos bactrianos vía intravaginal y/o uterina, se logro la ovulación en 7 de las hembras tratadas (Chen y col, 1985). De igual forma, en un estudio más contemporáneo, se logro ovulación en un 26% de hembras camélidas sudamericanas tratadas con plasma seminal de toro, dejando en manifiesto un efecto interespecie (Ratto y col, 2006). Tanco (2008) evaluó el efecto del plasma seminal de llama sobre la dinámica folicular en bovinos. Con el propósito de eliminar la variable de ovulación espontánea, realizó un primer experimento en hembras pre-púberes, donde observó que la primera onda folicular en animales que no ovularon luego del tratamiento con OIF emergió más temprano que en el grupo control, lo que se vio reflejado por una elevación en FSH plasmática en el grupo tratado con OIF, aumento que comenzó un día posterior al tratamiento y alcanzó la concentración más alta dos días después del tratamiento (Tanco, 2008). Si bien, en el presente estudio se utilizaron hembras adultas, se pudo observar que de alguna manera la administración del plasma tanto de llama y toro tendió a acortar el intervalo desde el tratamiento a la emergencia de la nueva onda folicular, a pesar de que los intervalos de ovulación no fueron diferentes entre los grupos, posiblemente el plasma de ambas especies podría estar ejerciendo un efecto regulador sobre la secreción de FSH lo cual se ve reflejado en la dinámica folicular. En el segundo estudio realizado por Tanco (2008), el plasma seminal de llama indujo un crecimiento significativo en el diámetro del CL como así también en la vida media de los mismos. Sin embargo, en nuestro estudio, solamente la administración intravaginal de plasma seminal de toro incremento el diámetro y la vida media del CL. Aunque las razones de este resultado no son muy entendibles, se podría especular a la diferente ruta de administración utilizada en este estudio, intravaginal versus intramuscular (Tanco, 2008). Basados en los resultados obtenidos en bovinos, estos podrían soportar la hipótesis de un efecto luteotrópico cuando OIF es administrado en forma intramuscular. Se ha observado que este factor permite secreción adecuada de LH, lo que se ve reflejado en concentraciones plasmáticas de progesterona dos veces el nivel fisiológico en el bovino, no así

21 17 para que se produzca ovulación. Se debe tener en consideración que la composición molecular exacta del factor inductor de ovulación del bovino no ha sido determinada aún y posiblemente sea distinta a la del OIF de llamas, hecho que tal vez pudiera explicar la falta de ovulación en bovinos. Sin embargo lo que es atractivo es su efecto en el desarrollo luteal y producción de progesterona. Es interesante destacar que en un estudio contemporáneo se ha documentado que la administración intravaginal de plasma seminal en vacas repetidoras aumenta la tasa de concepción en un 10%. Aunque este aumento no tiene una significancia estadística, lo que se puede deber al número de animales utilizados, sugiere un efecto regulador, por parte del PS, en la función ovárica o uterina en bovinos (Odhiambo y col, 2009). Lo anterior se puede atribuir a la presencia de PGF2α en el plasma seminal, ya que se ha documentado en diversas especies que inyecciones de PGF2α al momento o inmediatamente posterior a la inseminación artificial (IA), favorece tasa de parto en periodos de baja fertilidad y el tamaño de la cría en cerdas, aumento de la tasas de concepción en vacas (Prinzen y col, 1991; Peña y col, 1998). Tomando en cuenta lo anterior, en adición a que, como se describe en los materiales y métodos del presente estudio, se utilizó un protocolo de sincronización que utiliza una dosis de 25 mg de PGF2α intramuscular, con el propósito de inducir la lisis de un posible CL funcional al momento de la inyección, se genera la hipótesis de que la dosis extra de PGF2α que se administró a los animales tratados con PS de llama y toro tuvo alguna influencia sobre los resultados observados para la dinámica folicular y luteal. Esto ya que se ha documentado que el semen de toros posee entre 210,3 273,8 pg/ml de PGF2α endógena, lo que podría explicar la diferencias entre grupos (Jaeger, 2005). Algo similar, y que también podría influir particularmente en la diferencia observada sobre la vida media del CL en el grupo tratado con PS homologo, podría ocurrir con PGE 1 y E 2 contenidas en el PS, las que participan activamente en el proceso de formación y mantención del cuerpo lúteo, lo que podría explicar la prolongada vida media que experimentaron los CL del grupo antes mencionado (Del Vecchio y col, 1995; Arosh y col, 2004). Para el caso del macho llama, no se han llevado a cabo estudios que caractericen los niveles de prostaglandinas en semen, sin embargo, dado que la presencia de estos compuesto ha sido descrita en una amplia gama de especies, se presume que parte del efecto sobre la actividad ovárica por parte del PS de llama, puede deberse también a las prostaglandinas. De acuerdo a los resultados obtenidos en el presente estudio, se puede concluir que el plasma seminal posee factores que ejercen efectos en la fisiología reproductiva de la hembra; modulando la dinámica folicular al adelantar la emergencia de la nueva onda folicular y tendiendo a acortar la vida media del folículo dominante de la onda emergente. Por otro lado, se observo un efecto luteotrópico sobre el cuerpo lúteo al potenciar el crecimiento y su vida media. Finalmente, sería interesante en futuras investigaciones considerar los efectos que pudiera tener el plasma seminal administrado bajo diferentes condiciones fisiológicas de la hembra como así también bajo distintas vías de administración. Además sería útil aislar el efecto del OIF con respecto a los demás componentes que se sabe existen en el PS de las especies animales.

22 18 7. REFERENCIAS Adams G P, R Jaiswal, J Singh, P Malhi Progress in understanding ovarian follicular dynamics in cattle. Theriogenology 69, Adams G P, R L Matteri, J P Kastelic, J C H Ko, O J Ginther Association between surges of follicle-stimulating hormone and the emergence of follicular waves in heifers. J Reprod Fert 94, Arosh J A, S K Banu, S Kimmins, P Chapdelaine, L A McLaren, M A Fortier Effect of interferon-τ on prostaglandin biosynthesis, transport, and signaling at the time of maternal recognition of pregnancy in cattle: evidence of polycrine actions of prostaglandin E2. Endocrinology 145, Bogle O A Interspecies comparison of the effect of ovulation inducing factor (OIF) in seminal plasma. Tesis Master of Science, Departament of Veterinary Biomedical Sciences, University of Saskatchewan, Canadá Chen BX, ZX Yuen, GW Pan Semen-induced ovulation in the Bactrian camel (Camelus bactrianus). J Reprod Fert 73, Conaway CH Ecological adaptation and mammalian reproduction. Biol Repro d Evans ACO, MJ Canty Physiology of follicle development in cattle. Proceedings of the 23th WBC Congress, Québec, Canadá, Pp 1-5. Del Vecchio R P, W D Sutherland, R G Sasser Prostaglandin F2α, progesterone, and oxytocin production by cultured bovine luteal cells treated with prostaglandin E2 and pregnancy-specific protein B. Prostaglandins 50, Forder N, M Beltman, P Lonergan, M Diskin, J Roche, M Crowe Oestrous cycle in bos Taurus cattle. Anim Reprod Sci 4228, 1-7. Ginther O J, L Knopf, J P Kastelic Temporal association among ovarian events in cattle during oestrous cycle with two and three follicular waves. J Reprod Fert 87, Henao G Reactivación ovárica posparto en bovinos. Rev Fac Nac Agro Med 54, Pp Jaeger J R Quantitics of prostaglandins in whole and extended bovine semen and their potential effect on fertility following insemination. Tesis Doctor of Philosophy, University Oregon State, Estados Unidos.

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25 21 8. AGRADECIMIENTOS Quiero agradecer a las siguientes personas, porque de una forma u otra contribuyeron en mi formación durante todos estos años. Al Dr. Marcelo Ratto, por haberme guiado en mi formación académica, haber confiado en mi para trabajar junto a él y por haber dedicado parte de su tiempo para potenciar mis habilidades. A la Dr. Claudia Letelier, por participar de mi experimento, de mi enseñanza universitaria y por haber confiado en mí para trabajar junto a ella. A Francisca Fonseca y Andrea Gruzmacher, por acompañarme y ayudarme desinteresadamente en la parte práctica de mí ensayo. A todo el personal de los predios Vista Alegre y Santa Rosa, por su ayuda en todo momento. Al Sr. Víctor Gonzalez, por ser mi primer mentor en la Medicina Veterinaria y haberme inculcado aspectos importantes en el que hacer del Médico Veterinario de terreno. A mis amigos, por ser una parte importante de mi vida. A mis hermanos, sobrino, primos, tíos y abuelitos, por estar siempre ahí y quererme tanto. A Viviana, por su compañía durante estos 5 años de mi vida. Finalmente quiero dar especiales agradecimientos a mis padres, por el amor, la educación y los consejos que me brindaron durante toda mi vida. A ellos les debo todo lo que soy.