2. UNIDAD 2. MÉTODOS BASADOS EN LA EMISIÓN DE ENERGÍA

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1 2. UNIDAD 2. MÉTODOS BASADOS EN LA EMISIÓN DE ENERGÍA Introducción Como se explicó en la unidad anterior, cuando una sustancia química absorbe un tipo de radiación, sus electrones pasan de un estado basal a un estado electrónico excitado. Al suceder el fenómeno de absorción muchas sustancias disipan el exceso de energía en forma de calor, sin embargo, solo un grupo de especies pierde una cantidad del exceso de energía en forma de calor, y emite la energía restante en forma de radiación electromagnética de distinta longitud de onda que la absorbida, a una longitud de onda mayor, puede utilizarse con fines analíticos. De acuerdo con este fenómeno de emisión remanente de energía con que cuentan las especies químicas luego de ser irradiadas, es que se puede emplear la espectroscopia de emisión atómica (E.E.A.) y la espectroscopía de Fluorescencia tanto para la identificación de sustancias atómicas como para la cuantificación de las mismas. Al igual que la técnica instrumental de absorción atómica, la E.E.A. genera espectros de emisión conformados por picos muy estrechos, los cuales explican las transiciones energéticas de los electrones que conforman los átomos de un elemento en particular. También, estos espectros representan una huella digital inequívoca de los elementos metálicos, al igual que cualquier otra propiedad física, como por ejemplo, el punto de fusión, el índice de refracción, etc. En el último capítulo se abordaran algunas técnicas espectroscópicas modernas de caracterización y análisis de superficies actualmente utilizadas como son espectroscopia fotoelectrónica de rayos X (XPS), microscopia electrónica de barrido (SEM) y Microscopia Electrónica de Transmisión (TEM). En la presenta unidad se abordará la información necesaria para entender el fenómeno de emisión de energía a escala atómica y todo lo relacionado con la técnica de análisis instrumental de superficies.

2 CAPITULO 4: ESPECTROSCOPÍA DE EMISIÓN ATÓMICA Lección 16: La radiación electromagnética Es de vital importancia enfatizar en algunos aspectos sobre la radiación electromagnética, por su repercusión en la espectroscopia en general, haciendo énfasis en la de emisión atómica. La radiación electromagnética es un tipo de energía que se transmite a enormes velocidades por el espacio y que adopta muchas formas; entre las más conocidas se encuentran la luz y el calor radiante. Muchas de las propiedades de la radiación electromagnética se describen con certeza según el modelo clásico de los fenómenos ondulatorios. Este modelo considera la radiación electromagnética como una serie de ondas constituidas por un campo eléctrico perpendicular entre sí y a la dirección de propagación de dicha onda. Figura 54. Ondas electromagnéticas Ciertos fenómenos suceden cuando interacciona la radiación electromagnética con la materia, como la absorción y emisión de dicha radiación. Para explicar estos fenómenos es necesario considerar que la radiación electromagnética es una corriente de paquetes discretos de energía. Estos paquetes de energía se comportan como partículas individuales, llamadas fotones. Cada fotón se

3 caracteriza por una frecuencia. Estas dos formas de ver la radiación electromagnética como partícula y como onda no se excluyen sino que se complementan. La espectroscopia es la medición e interpretación de la radiación electromagnética absorbida, dispersada o emitida por átomos, moléculas u otras especies químicas. Estos fenómenos están asociados con cambios en los estados de energía de las diferentes especies; por consiguiente, dado que cada especie posee estados energéticos característicos, la espectroscopia puede utilizarse para identificarlas. El método espectroscópico se ha usado durante largos años para el reconocimiento sensible de muchos elementos. El análisis del espectro con fines cuantitativos fue introducido por Lockyer y Roberts en 1873, pero estos tuvieron poca repercusión. Posteriormente la introducción del principio de estandarización interna propuesta por Gerlach en 1925 determina un nuevo período en la elaboración de procedimientos analíticos cuantitativos.

4 Lección 17: Principios básicos de la espectroscopia de emisión atómica (E.E.A). Los métodos espectroscópicos atómicos se basan en la interacción entre la radiación electromagnética y la materia. La espectroscopia de emisión atómica (E.E.A.), es un método instrumental de análisis químico, que se fundamenta en el estudio de la radiación emitida por átomos en todas las regiones del espectro. Cuando estos absorben energía, se excitan y en dicho estado permanecen un tiempo muy corto (del orden de 10-6 s.), luego el átomo o molécula vuelve a su estado fundamental o no excitado emitiendo el sobrante de energía en forma de luz o cuantos luminosos. A B Figura 55. A. Explicación de las transiciones electrónicas; B. Espectro de emisión del hierro. Esto ocurre cuando una muestra es sometida a una descarga eléctrica suministrada por una fuente de excitación. El proceso descrito puede expresarse

5 de acuerdo a la condición de frecuencia de Bohr. Si E 1 y E 2 son los estados inicial y final respectivamente, la energía emitida se expresará como: Ecuación 2.1 Donde: = Frecuencia de la radiación emitida Los iones o moléculas gaseosas, cuando se excitan térmica o eléctricamente emiten una radiación característica en la zona del ultravioleta visible que puede ser medida y utilizada para el análisis cualitativo y cuantitativo, ya que la intensidad de las líneas es proporcional cantidad de átomos excitados, en dependencia de las condiciones de excitación y a la concentración de la muestra. Mientras que la mayoría de las técnicas espectroscópicas sirven para el análisis de moléculas y de átomos, la espectroscopia de emisión sólo sirve para análisis de átomos. Esto se debe a la gran energía que se necesita para excitar la mayoría de las especies químicas, de forma que esta energía disocia los compuestos en átomos o iones. La espectroscopia no al ser excitada la muestra, se rompe la estructura e ioniza el átomo. Como consecuencia de lo señalado anteriormente se puede concluir que, esta técnica no es útil para la determinación del estado químico de combinación. En Espectroscopia de Emisión Atómica la cantidad física que es usada para caracterizar y medir la concentración que será determinada, se refiere como intensidad. El análisis cuantitativo determina la concentración o cantidad de una sustancia a partir de una medición, que puede ser la lectura de un voltímetro, que se refiere a la energía radiante, en mediciones fotográficas. En la práctica no es necesario decir que tipo de energía radiante se está midiendo. Entonces la expresión intensidad puede ser empleada para expresar la fuerza relativa de una línea espectral. Luego la intensidad de una línea espectral o del fondo es una expresión relativa al referirse a la cantidad medida por el receptor de dicha señal. La dimensión es pues la unidad, sin embargo, no es necesario referirse a unidades pues queda explícito en el término intensidad por su valor relativo respecto a otra línea de referencia interna en el espectro usado. La base del análisis cuantitativo por emisión atómica lo constituye la simple relación empírica entre el contenido de un elemento en la muestra y la intensidad de la línea espectral de dicho elemento, característico para una longitud de onda

6 determinada, en la zona del espectro analizada. Esta relación se conoce usualmente como la ecuación de Lomakim-Scheibe: Ecuación 2.2 Donde, I = Intensidad lineal espectral. c = Contenido del elemento. a = Coeficiente de proporcionalidad donde se asume en principio que la intensidad es proporcional a la concentración. Las desviaciones de esta proporcionalidad están causadas fundamentalmente por la autoabsorción, tomada en cuenta a través del exponente b. Cuando el registro es fotográfico, la ecuación se representa gráficamente en coordenadas logarítmicas Ecuación 2.3 En la espectroscopia de emisión, son los electrones de valencia de los elementos los que se excitan, para dar lugar a espectros atómicos formados por picos bien definidos y estrechos, empleándose como líneas analíticas las líneas últimas o de referencia Ventajas Este método tiene una serie de ventajas que se describen a continuación: Excelente método para el análisis de trazas (contenidos <1 mg l -1 ) Empleado la determinación de metales, metaloides y otros elementos Se requiere una pequeña cantidad de muestra (un nanogramo) Determinación simultáneamente de varios elementos, sin necesidad de separaciones previas. Es un método rápido y fácilmente automatizado. La exactitud y la precisión suele ser del 2 %

7 Desventajas Este método también posee una serie de desventajas como lo son: Equipamientos relativamente caros. Destrucción total de la muestra, cuando es en polvo. Se realiza solo la determinación en forma de elementos Fuentes de energía. Las fuentes de energía para la emisión pueden ser provocadas por energía térmica o eléctrica. Esta fuente ejerce una gran influencia en el tipo de intensidades de los picos que constituyen el espectro de cada uno de los elementos. De acuerdo a lo anterior se puede decir que la fuente de energía tiene dos funciones: Debe proporcionar suficiente energía como para convertir los compuestos en átomos e iones gaseosos. En este proceso es importante que la distribución de los elementos en el vapor se relacione reproduciblemente con la concentración y la distribución en la muestra. Debe proporcionar suficiente energía como para excitar los electrones de los átomos gaseosos de forma también reproducible. Al excitar a una sustancia se obtiene un espectro de emisión típico, parecido al de una llama de O 2 y H 2, donde se observan tres tipos de radiación o espectros: De líneas estrechas y bien definidas. De bandas. Continuo. Los espectros de líneas se deben a emisiones atómicas o iónicas. En relación a ello se expone que sólo existen niveles electrónicos en los átomos y, por lo tanto, las emisiones procedentes de ellos serán picos más o menos estrechos y bien definidos. Por su parte Skoog, indica que los espectros de bandas se deben a emisiones de radicales o moléculas sencillas. Pero en realidad, son espectros de líneas que se superponen y que el instrumento no es capaz de resolver. Estos espectros de bandas se eliminan utilizando fuentes de energía a mayor temperatura, que romperán los radicales.

8 Energía de excitación Resulta evidente que para que un elemento en estado de oxidación cero emita una única línea espectral, es necesario que previamente haya absorbido una energía equivalente a su potencial de excitación, que es la energía necesaria para subir un electrón del estado fundamental al primer estado excitado; pero para que un elemento muestre una emisión completa, debe absorber una energía equivalente a su potencial de ionización. Como cada fuente de energía tiene una cantidad de energía fija, los potenciales de ionización pueden servir como vía para conocer las sensibilidades relativas de los distintos elementos en espectroscopia de emisión. Así, aquellos elementos que tienen bajos potenciales de ionización, como son los alcalinos, se podrán determinar con gran sensibilidad, mientras que los elementos no metálicos con alto potencial de ionización, se determinarán con poca sensibilidad. Por lo expresado anteriormente se puede concluir que la complejidad de los espectros de emisión dependerá de la configuración electrónica del elemento, por lo que los metales alcalinos presentan espectros muy simples, mientras que los de transición los presentan muy complejos.

9 Lección 18: Instrumentación de la E.E.A. Los componentes básicos de un espectrómetro de emisión son: una fuente de excitación, que proporcione energía a la muestra, un monocromador, que seleccione las diferentes radiaciones emitidas y un sistema de detección Fuentes de excitación La energía suministrada para la excitación de la muestra en análisis espectroquímico procede de una descarga eléctrica entre dos electrodos. Uno de ellos normalmente contiene la muestra, pulverizada, en forma sólida, o el residuo procedente de una disolución. Si la muestra es un metal o una aleación, uno de los electrodos, normalmente el inferior, constituye la propia muestra. Cuando la muestra no es conductora, suele colocarse en una pequeña cavidad practicada en un electrodo de grafito. También se utilizan como soporte varillas de cobre y plata cuando estos elementos no deben analizarse. El otro electrodo (contra-electrodo) suele ser grafito en todos los casos. Cuando se trata de muestras líquidas o disoluciones, lo normal es evaporar una determinada cantidad depositada sobre el propio electrodo. Para la excitación de la muestra se utilizan los siguientes dispositivos: la llama, el arco eléctrico de corriente alterna, el arco eléctrico de corriente directa, y la chispa eléctrica. Cada uno tiene ventajas y aplicaciones especiales. Sin embargo, la función de cada unidad de excitación es que la muestra se vaporice y excitar los electrones en los átomos vaporizados a niveles de energía superiores La llama Proporciona una menor temperatura por lo que solo se excitarán unas cuantas líneas, principalmente los elementos con baja energía de ionización, como los metales alcalinos y alcalinos térreos, pero esto puede constituir una ventaja, ya que las interferencias que pueden producir otros elementos quedan eliminadas al estos no emitir energía.

10 El arco eléctrico con corriente directa Producido por un voltaje entre Voltios, es un método común para introducir la muestra en la descarga. La vaporización tiene lugar por el calentamiento causado por el paso de la corriente. Las temperaturas del arco están en un rango de K. Las líneas de emisión producidas son, principalmente, aquellas debidas a átomos neutros. Esta fuente es muy sensible, con una buena relación línea-fondo. Generalmente se usa para la determinación e identificación de sustancias presentes en una muy baja concentración, ya que puede detectar elementos con bajo límite de detección El arco eléctrico con corriente alterna de alto voltaje. En este caso se utiliza una corriente alterna entre 2000 y 5000 V. con intensidades comprendidas entre 1 y 5 amperios. El arco se establece entre los electrodos, separados alrededor de 1 mm, sin necesidad de contacto previo. Si la frecuencia de la corriente es 50 Hz, el arco se extingue e invierte su dirección 100 veces por segundo, lo cual mejora considerablemente la reproducibilidad respecto al arco de corriente continua, pues el arco se establece ("pica") en una zona nueva en cada ciclo. Sin embargo, la naturaleza intermitente de la descarga hace que la temperatura alcanzada sea inferior a la que se consigue con el arco de corriente continua, con la correspondiente disminución de la sensibilidad. De cualquier forma, este dispositivo no se utiliza demasiado en el trabajo analítico ordinario La chispa eléctrica con corriente alterna Da energías da excitación mucho más altas que el arco, con menor efecto de calentamiento. Se ha comprobado que una chispa intermitente que siempre se propaga en la misma dirección, proporciona mayor precisión que los métodos considerados anteriormente. En la Figura 57 se muestran los componentes esenciales de un circuito para una fuente de chispa.

11 Figura 56. Circuito para una fuente de chispa. La línea de voltaje se ajusta a kv con un transformador. El circuito secundario contiene un condensador, C, y un motor, M, cuya rotación es sincrónica con las alternancias de la línea de corriente. Durante medio ciclo el condensador almacena la carga y cuando está cargado al máximo, el rotor sincrónico permite que el circuito se cierre y salte la chispa, produciéndose una descarga amortiguada. La intensidad máxima puede ser hasta de 2000 A, pero la corriente media es solo de unos pocos amperios o menos. La excitación de la muestra con este tipo de fuente se produce por bombardeo de electrones, en lugar de ser térmica, como en otras fuentes de excitación. Los electrodos se mantienen relativamente fríos y la cantidad de muestra vaporizada es muy pequeña. No se trata de una fuente muy sensible, y por ello, no demasiado conveniente para análisis cualitativo. Sin embargo, es una fuente muy estable y reproducible, resultando muy adecuada para análisis cuantitativo. Operando con esta fuente se pueden llevar a cabo análisis de forma rápida y precisa. Por ejemplo, en análisis de control de calidad de aceros se puede efectuar un análisis en menos de 10 segundos.

12 La microsonda láser es una fuente de excitación, que se encuentra comercializada, y que parece muy prometedora. En esta fuente (Figura 58) se utiliza el láser para vaporizar la muestra en el espacio entre dos electrodos de grafito, que se utilizan como fuente de excitación de chispa. Figura 57. Microsonda láser El dispositivo permite analizar materiales no conductores y, posiblemente la mayor ventaja sea el poder enfocar sobre determinadas zonas de tamaño muy pequeño, entre 10 y 50 μm de diámetro Monocromadores. Como elementos dispersantes en espectrometría de emisión se emplean prismas y redes, cuyas características se consideraron en el capítulo 3. Actualmente parece que las redes tienden a desplazar a los prismas, por una serie de razones, entre las que se incluye el precio y, sobre todo, el hecho de que las redes proporcionan dispersiones lineales, con lo que el problema de la identificación de las líneas espectrales sobre una placa fotográfica se simplifica considerablemente. La desventaja que supone la presencia de distintos órdenes de difracción se elimina fácilmente utilizando filtros adecuados.

13 Detectores. Los espectrógrafos utilizan una película fotográfica para registrar la radiación emitida por la muestra problema, mientras que en los espectrómetros, la detección se lleva a cabo por métodos fotoeléctricos. Detección fotográfica. Casi todos los antiguos instrumentos de emisión utilizan emulsiones fotográficas para detectar la energía radiante. Estos métodos se pueden usar con fines cualitativos y cuantitativos. Su empleo en análisis cualitativo se considerará más adelante (ver: aplicaciones), mientras que aquí se mencionarán algunas de sus características para su empleo en medidas cuantitativas. Cuando una película fotográfica se expone a radiación electromagnética, y posteriormente se revela, la imagen obtenida se mide normalmente como la densidad de ennegrecimiento (peso de plata metálica producida por unidad de área). Una vez revelada la placa, la densidad de ennegrecimiento, D, (similar a la absorbancia) se mide con un micro-fotómetro llamado densitómetro. Para ello, se mide primero en una parte de la película no impresionada, Io, y después sobre la línea de interés, obteniendo la intensidad de radiación transmitida, I. La densidad es: Ecuación 2.4 La densidad de ennegrecimiento está relacionada con la exposición, E, que se define por Ecuación 2.5 donde I es la intensidad de la radiación a una longitud de onda de exposición. y t es el tiempo Para convertir densidad de ennegrecimiento, D, de una línea, en exposición, es necesario obtener experimentalmente la denominada curva de trabajo o curva H y D, que consiste en una representación gráfica de D en función de log t (Figura 59)

14 Figura 58. Curva característica H y D para una emulsión fotográfica a dos longitudes de onda. La medida de la pendiente de la zona lineal de la curva se conoce como gamma de la emulsión y es una medida del contraste, el cual depende, a su vez, de la longitud de onda. Con ayuda de la curva característica puede relacionarse la densidad de ennegrecimiento con el tiempo de exposición, y si éste se mantiene constante (que es como normalmente se opera con fines analíticos) con la intensidad relativa. Estas intensidades relativas son el parámetro dependiente de la concentración. Por supuesto, que en espectroscopia analítica, las intensidades relativas deben relacionarse con las concentraciones a través de la curva de calibrado. Detección fotoeléctrica. En los espectrómetros se utiliza como sistema de detección una serie de tubos fotomultiplicadores, en lugar de una placa fotográfica. Esto requiere la colocación precisa de toda una serie de rendijas de salida a lo largo de la curva focal del espectrómetro, para seleccionar líneas espectrales individuales, o grupos de líneas, con objeto de detectar muchos elementos simultáneamente. Normalmente, los espectrómetros tienen espacio para unas 90 rendijas, si bien, solo entre 20 y 35 detectores y lectores, llamados canales, se utilizan para un determinado análisis. Estos instrumentos se denominan de "lectura directa".

15 Asociado a cada tubo fotomultiplicador se dispone un sistema electrónico que integra la señal del detector durante un periodo de tiempo, almacenada en un condensador, leyéndose al final de la exposición. La medida de la pendiente de la zona lineal de la curva se conoce como gamma de la emulsión y es una medida del contraste, el cual depende, a su vez, de la longitud de onda. Con ayuda de la curva característica puede relacionarse la densidad de ennegrecimiento con el tiempo de exposición, y si éste se mantiene constante (que es como normalmente se opera con fines analíticos) con la intensidad relativa. Estas intensidades relativas son el parámetro dependiente de la concentración. Por supuesto, que en espectroscopia analítica, las intensidades relativas deben relacionarse con las concentraciones a través de la curva de calibrado.

16 Lección 19: Espectrometría de emisión atómica con fuente de plasma Las fuentes de excitación consideradas como tradicionales, y que se han considerado anteriormente, presentan una serie de inconvenientes, entre los que destacan: Llamas. La temperatura que se alcanza en las llamas es relativamente baja, por lo que resulta difícil, si no imposible, analizar elementos refractarios o elementos con grandes energías de excitación. Además, los productos de combustión y los gases de la llama dan lugar a interferencias químicas y espectrales. Arco y chispa. Los arcos y las chispas son capaces de proporcionar altas temperaturas de excitación, pero la naturaleza de la descarga eléctrica es afectada fuertemente por el tipo de muestra. Así, pequeñas variaciones en la composición pueden originar cambios importantes en las condiciones de excitación. Para tratar de evitar estos inconvenientes, se ha venido desarrollando una técnica para el análisis multi-elemental por espectroscopia de emisión atómica basada en el empleo de plasmas. Las fuentes de plasma ofrecen varias ventajas comparadas con los métodos de llama y electrotérmicos. Una de las ventajas constituye la de ser una técnica para elementos múltiples y tiene un amplio rango de trabajo. Las fuentes de plasma actuales brindan un método mucho más fácil para la manipulación de muestras gaseosas y líquidas. El espectro para docenas de elementos puede ser registrado al mismo tiempo, algo muy importante cuando la muestra es pequeña. Figura 59. Espectrómetro de emisión con plasma de acoplamiento inductivo

17 Las altas temperaturas alcanzadas aumentan el número de elementos que se pueden determinar, tanto cualitativa como cuantitativamente, ya que la temperatura se puede estabilizar. Presenta una gran versatilidad, exactitud y reproducibilidad, permitiendo trabajar con pequeños volúmenes de muestra, rebajando considerablemente los límites de detección. Se emplea en el análisis de metales, líquidos biológicos, usándose junto a la cromatografía de gases en la determinación del plomo en sangre, arsénico, antimonio, plomo en aire y agua. Un plasma se define como un gas ionizado, esto es, una mezcla gaseosa que contiene una concentración significativa de cationes y de electrones. El plasma de argón es el que se utiliza para la mayoría de los espectrómetros, puede llegar a tener una temperatura de K, estableciéndose el siguiente equilibrio: Ar + Ar + + e - - En función de como se aporte esta energía externa, se han desarrollado tres tipos de fuentes de alimentación: una fuente de corriente continua (DCP), consistente en dos electrodos sumergidos en la corriente de gas argón, y otras dos que utilizan potentes campos de microondas (MIP) y de radiofrecuencia (ICP). De las tres, la de radiofrecuencia (ICP) es la más interesante desde el punto de vista analítico. Bobina de inducción de radiofrecuencia Muestra en forma de aerosol o vaporizada en argón Flujo tangencial que soporta el plasma de argón Figura 60. Típica fuente de plasma de acoplamiento inductivo

18 La Figura 61 muestra un esquema de una fuente típica de plasma de acoplamiento inductivo denominada antorcha. Esta consiste en tres tubos concéntricos de cuarzo a través de los cuales fluyen corrientes de argón. El gas argón fluye a través de un tubo de cuarzo de unos 2.5 cm de diámetro, rodeado en su extremo superior por tres o cuatro anillos de una bobina de inducción alimentada por un generador de radiofrecuencias. La frecuencia de operación estándar es de unos 27 MHz y la potencia de 1 a 3 kw. Figura 61. Representación esquemática de la formación del plasma. La corriente de alta frecuencia fluyendo a través de la bobina de inducción genera campos magnéticos oscilantes cuyas líneas de fuerza están orientadas axialmente en el interior del tubo. La ionización del argón que fluye por el interior del tubo se inicia por medio de una descarga producida por una bobina Tesla. Los iones originados en esta descarga y sus electrones asociados interaccionan entonces con el campo magnético oscilante, como consecuencia de lo cual hace que se muevan en trayectorias anulares cerradas, encontrando resistencia a ese movimiento, lo que origina un calentamiento óhmico. El plasma, una vez formado, se auto-mantiene, y el resultado es un gas altamente ionizado con temperaturas entre 6000 y K. Por el mecanismo explicado anteriormente, se origina una especie de "llama" fuertemente luminosa, pero no hay combustión. En el plasma pueden distinguirse dos zonas: un núcleo blanco brillante que termina en una cola en forma de llama. En el núcleo tiene lugar una intensa emisión continua procedente de la recombinación de los electrones con los iones argón. Esta emisión se desvanece unos 10 mm por encima del núcleo, por lo que la región situada entre unos 15 y 20 mm es ópticamente transparente, y es donde se llevan a cabo las medidas analíticas. La antorcha de plasma está constituida por tres tubos concéntricos. La muestra, normalmente en disolución, es aspirada por un sistema nebulizador y transportada por el tubo central, arrastrada por el gas

19 portador (argón) a una velocidad relativamente pequeña ( 1 ml/min). Como la temperatura obtenida es muy elevada, es necesario aislar térmicamente el plasma para evitar el sobrecalentamiento del tubo de cuarzo. Para ello, se introduce argón tangencialmente por el tubo más externo a la velocidad de L/min. Este flujo de argón enfría las paredes internas del tubo de cuarzo externo, y a la vez, estabiliza y centra el plasma. Figura 62. Plasma acoplado inductivamente Introducción de la muestra Aunque la muestra puede ser introducida en el plasma en forma gaseosa, líquida, o incluso como polvo muy fino, casi siempre se usan dispositivos semejantes a los que se emplean en los métodos de llama. Figura 63. Nebulizador concéntrico

20 En la Figura 64, se muestra un nebulizador concéntrico acoplado a la antorcha de plasma. Aunque este tipo de nebulizadores se utiliza muy extensamente en ICP, se han desarrollado otros con objeto de aumentar el rendimiento. Así, con nebulizadores ultrasónicos, se incrementa la sensibilidad entre 3 y 10 veces Características del plasma de acoplamiento inductivo (ICP) La fuente ICP proporciona gran calidad en análisis multi-elemental, pues con ella se obtienen óptimos resultados para muchos elementos. Además, es posible trabajar con casi las mismas condiciones de operación para muchos de ellos. La mayor temperatura del ICP, comparada con la combustión en las llamas, permite la determinación de elementos refractarios, tales como P, B, W, Zr, U. Los límites de detección para muchos elementos son excelentes. Suelen ser mejores que con llama, arco o chispa, si bien no siempre más favorables que con horno de grafito. La mayor temperatura alcanzada, y también el mayor tiempo de residencia del analito en la antorcha de plasma, hace que la atomización sea más completa y haya menos problemas de interferencias químicas. Este hecho también está favorecido porque la atomización tiene lugar en un medio inerte, que evita la formación de óxidos. Por otra parte, a pesar de la mayor temperatura, hay menos problemas de interferencias de ionización. Ello se debe al efecto tampón de los electrones procedentes de la ionización del argón. En la zona del plasma situado entre 10 y 30 mm por encima de la bobina de inducción, la emisión debida al fondo es mínima. Al no haber electrodos, no hay problemas relacionados con su contaminación, como en los métodos de arco o chispa. La fuente presenta una gran estabilidad durante largos periodos de operación. Por ello, no es necesario un recalibrado frecuente, a diferencia de los métodos de llama, arco o chispa.

21 La temperatura en la sección transversal del plasma es relativamente uniforme y como consecuencia de ello, no se producen los efectos de autoabsorción y auto-inversión, por lo que se obtienen curvas de calibrado con amplios márgenes lineales. Este gran margen lineal permite la determinación simultánea de constituyentes mayores, menores y de trazas, sin necesidad de diluciones ni otras operaciones sobre la muestra Aplicaciones de la ICP Las fuentes de plasma acoplado inductivamente proporcionan datos analíticos mejores que otras fuentes de emisión. La calidad de estos resultados radica en la gran estabilidad, bajo ruido, poca radiación de fondo y en la ausencia de interferencias de las fuentes, cuando se opera en las condiciones experimentales apropiadas. Esta técnica se emplea para una amplia variedad de aplicaciones, ya que un gran número de elementos pueden ser determinados rápidamente a niveles traza (ppm, ppb), y porque una amplia variedad de tipos de muestras pueden ser analizados utilizando esta técnica. Agricultura y alimentos: Análisis de suelos, fertilizantes, materias vegetales, alimentos... Requiere una rigurosa preparación de la muestra. Biología y clínica: El mayor problema de los ensayos de este campo, está en la contaminación de las muestras antes del análisis. Ejemplos de determinaciones: - Cr, Ni y Cu en orina. - Al en sangre. - Cr en heces. - Ni en leche materna. - B, P y S en huesos. Geología: Las aplicaciones van desde los elementos mayoritarios, minoritarios y las trazas. Medio ambiente y aguas:

22 Se requiere un tratamiento previo de la muestra con digestiones ácidas, microondas... Incluyen análisis de suelo, sedimentos, tejidos animales y vegetales, además de varios tipos de aguas. Metales: Una dificultad asociada es el gran número de interferencias espectrales de algunos metales. Aun así, se obtienen buenos resultados.

23 Lección 20: Espectroscopia de emisión con fuentes de arco y chispa Fueron los primeros métodos instrumentales utilizados en el análisis. Están basados en la obtención mediante la excitación del espectro de emisión de los elementos por medio de arco eléctrico o chispa eléctrica. Estos espectros permiten la determinación cualitativa y cuantitativa de elementos metálicos en varios tipos de muestras incluyendo metales, aleaciones, suelos, minerales y rocas. En las fuentes de arco y chispa, la excitación de la muestra se produce en el pequeño espacio existente entre un par de electrodos. El paso de electricidad entre los electrodos a través de este pequeño espacio proporciona la energía necesaria para atomizar la muestra y producir átomos o iones en el estado electrónico excitado Tipos de muestra y manipulación de la muestra En esta técnica se utilizan muestras sólidas y se clasifican en muestras metálicas, y no metálicas. En las muestras metálicas, si el metal es una aleación, uno o ambos electrodos se pueden preparar fresando, torneando o vertiendo el metal fundido en un molde. Para algunas muestras es más conveniente emplear la superficie plana pulimentada de un trozo grande de metal como uno de los electrodos y tomar una varilla de grafito o de metal como el otro. En caso de muestras solidas no metálicas la muestra se coloca a menudo sobre un electrodo cuyo espectro de emisión no interfiera en el análisis. Los electrodos de carbono son ideales para muchas aplicaciones. Los fabricantes ofrecen electrodos de carbono de muchos tipos, tamaños y formas. Normalmente, uno de los electrodos tiene forma cilíndrica con un pequeño cráter abierto en uno de los extremos, en el cual se introduce la muestra finamente pulverizada. El otro electrodo es, en general, una varilla de carbono en forma cónica, con la punta ligeramente redondeada. Esta configuración, proporciona el arco o la chispa más estables y reproducibles.

24 Figura 64. Algunas formas características de los electrodos de grafito. Otro método se normalmente se utiliza para la atomización de muestras pulverizadas consiste en la compactación, conocida también como briquetting, o peletilización de la muestra. En este caso la muestra finamente triturada se mezcla con una cantidad relativamente grande de polvo de grafito, cobre u otra sustancia conductora y compresible. La mezcla resultante se comprime a elevada presión para darle la forma de un electrodo Instrumentos para la espectroscopia con fuentes de arco o de chispa Las fuentes de arco y de chispa, debido a su inestabilidad, requieren integrar las señales de emisión durante al menos 20 s, y a menudo, durante un minuto o más. Este requisito hace que el empleo de espectrómetros secuenciales no sea práctico para la mayoría de las aplicaciones y esto exige instrumentos multicanal simultáneo. Se han aplicado 2 tipos de instrumentos multicanal a la espectroscopia de arco y chispa, los cuales son: espectrógrafos y espectrómetros multicanal Espectroscopia de emisión con fuente de arco La fuente de arco usual para un análisis espectroquímico está constituida por un par de electrodos de grafito o de metal separado por unos milímetros. El arco se enciende por una chispa de baja intensidad de corriente que provoca la formación momentánea de iones que transforman en conductor el espacio entre los electrodos, una vez iniciado el arco, la ionización térmica mantiene la corriente, luego se separan a la distancia deseada.

25 Características de las fuentes de arco La electricidad es producida en un arco mediante el movimiento de los electrones y los iones que se forman por ionización térmica; la elevada temperatura que se produce es el resultado de la resistencia de los cationes a este movimiento en el espacio donde se produce el arco, por tanto, la temperatura del arco depende de la composición del plasma que a su vez depende de la velocidad de formación de partículas atómicas a partir de la muestra y de los electrodos. Esta temperatura del plasma se encuentra en un rango de 4000 a 5000 K. En el caso de átomos, los espectros obtenidos en un típico arco son ricas en líneas intensas y contienen un número menor de líneas en el caso de especies iónicas Bandas espectrales debido al cianógeno Cuando con un electrodo de carbono o grafito se produce el arco en una atmosfera de aire, se emiten unas bandas muy intensas de cianógeno, por eso se utiliza una atmosfera controlada de nitrógeno o dióxido de carbono para controlar esas emisiones Velocidad de emisión Se ha demostrado experimentalmente que la velocidad a que las especies se volatilizan y se excitan diferente considerablemente unas que otras. Los espectros de unas especies aparecen pronto y después desaparecen a medida que la muestra se consume; los espectros de otras especies alcanzan su máxima intensidad a tiempos mayores. Por ello es necesario integrar señales de emisión por un minuto más Aplicaciones de la fuente de arco Las fuentes de arco son muy útiles para el análisis cualitativo y semicuantitativo de muestras no metálicas, como suelos, muestras vegetales, rocas y minerales. Normalmente, de 2 a 50 mg de muestra en forma de polvo, molienda, pequeños trozos o limaduras se mezclan con una cantidad pesada de grafito y se introducen en la cavidad de los electrodos de grafito, donde generalmente, el electrodo portamuestras hace de ánodo y el segundo contraelectrodo actúa de cátodo.

26 En el análisis cualitativo de muestras no rutinarias, se utiliza de manera habitual el registro fotográfico obteniéndose varios espectros en una placa moviendo verticalmente la cámara tras cada excitación. La excitación con arco también se utiliza para análisis cuantitativo. Sin embargo, la precisión obtenida con el arco es significativamente más pobre que con la chispa y mucho más pobre que con el plasma o la llama. Además, las intensidades de emisión de las muestras sólidas dependen en gran medida de la muestra y debido a esto es necesario igualar la matriz en los patrones y en las muestras para obtener resultados satisfactorios Fuentes de chispa y espectros de chispa. Se han desarrollado diversos circuitos que producen chispas de alta tensión para espectroscopia de emisión. Una chispa intermitente que siempre se propaga en la misma dirección proporciona mayor precisión y menor deriva de la emisión radiante. Se utiliza un conjunto de circuitos de estado sólido para el control de la frecuencia y la duración de la chispa que por lo general con una corriente de 60 Hz se producen cuatro descargas de chispa por cada semiciclo. Con una chispa de alta tensión. La corriente promedio es generalmente bastante menor que en un arco típico. Por otra parte, en la fase inicial de la descarga, la corriente instantánea puede sobrepasar los 1000 A; en este caso, la electricidad circula por un canal estrecho que ocupa una minúscula parte del espacio total en el que se produce la chispa. La temperatura en esta región puede llegar a ser de K. Así, mientras la temperatura media de una fuente de chispa es mucho menor que la de un arco, la energía en el pequeño volumen del canal puede ser varias veces mayor. Como consecuencia, los espectros los espectros de iones son más pronunciados en una chispa de alta tensión que en un arco Aplicaciones de la espectroscopia con fuente de chispa Los análisis cuantitativos con chispa requieren el control preciso de muchas variables que intervienen en la preparación y excitación de la muestra, y también en el procesado de la película en los espectrógrafos. Además, las medidas cuantitativas requieren la preparación cuidadosa de una serie de patrones para el calibrado los cuales deberían aproximarse lo más posible a la composición y propiedades físicas de las muestras a analizar.

27 Actualmente, la principal aplicación de la espectroscopia de emisión con fuente de chispa es la identificación y análisis de metales y otros materiales conductores. La detección se realiza normalmente con un policromador equipado con tubos fotomultiplicadores. Los espectrómetros con fuente de chispa, y en menor grado los de fuente de arco, se utilizan habitualmente y de manera importante en fundiciones, fábricas, chatarrerías e industrias metalúrgicas. Los instrumentos utilizados en estas aplicaciones son con frecuencia móviles y están equipados con una pistola portátil con la fuente de arco o chispa que el operador puede poner en contacto con la superficie metálica para producir la excitación. Dichos equipos se utilizan para la identificación rápida de aleaciones y para el análisis de la mezcla fundida antes de obtener la pieza de fundición.

28 Ejercicios (Unidad 2 Capítulo 4) 1. Cuál de las siguientes afirmaciones NO es cierta para la espectroscópica de emisión atómica? a. Es un buen método para análisis de trazas con concentraciones del orden de ppm. b. Se necesita mucha cantidad de muestra. c. Las muestras pueden analizarse sin preparaciones, sin separaciones químicas previas. d. Ninguna de las anteriores. 2. Cuál de las siguientes NO hace parte de la instrumentación de un equipo de emisión atómica? a. La llama b. El arco eléctrico con corriente directa c. La chispa eléctrica con corriente alterna d. Los prismas e. La microsonda láser 3. Cuál de las siguientes es una aplicación de la emisión atómica? a. Análisis de suelos, fertilizantes, materias vegetales, alimentos, entre otros. b. Detección de elementos presentes en la superficie. c. Investigaciones geomineras, cristalográficas, mineralógicas y petrológicas. d. Control de calidad y estudio de fatiga de materiales, características texturales.

29 4. El plasma de argón es el que se utiliza para la mayoría de los espectrómetros, puede llegar a tener una temperatura de K. cuál de los siguientes equilibrios se establece para el argón? a. b. c. 5. Cuál NO hace parte de la emisión atómica a. Fuente de plasma b. Plasma de acoplamiento inductivo c. Cañón electrónico d. Fuentes de chispa e. Fuentes de arco

30 CAPÍTULO 5: ESPECTROSCOPIA DE FLUORESCENCIA Introducción La espectroscopia de fluorescencia atómica (AFS) es una técnica de emisión que ofrece una gran sensibilidad en la región ultravioleta. Sin embargo, su sensibilidad es mucho menor en la región visible debido a las intensas interferencias que experimenta en la línea base y a procesos de quenching en esta zona espectral. Para que pueda producirse el proceso de emisión fluorescente, previamente debe haber tenido lugar un proceso de absorción que implicará dos o más transiciones electrónicas. El proceso emisivo fluorescente puede producirse de diversas formas lo que implica que existan distintos tipos de fluorescencia: fluorescencia resonante, fluorescencia sensibilizada, fluorescencia Stokes o anti-stokes, fluorescencia retardada. La fluorescencia es un proceso de emisión en el cual las moléculas son excitadas por la absorción de radiación electromagnética. Las especies excitadas se relajan al estado fundamental, liberando su exceso de energía en forma de fotones. Una de las características más atractivas de los métodos de fluorescencia es su sensibilidad inherente, la cual es, con frecuencia, de uno a tres órdenes de magnitud mejor que las de la espectroscopia de absorción. No obstante, los métodos de fluorescencia se aplican mucho menos que los métodos de absorción debido al número relativamente limitado de sistemas químicos que se pueden hacer fluorescer.

31 Lección 21: Teoría de la fluorescencia molecular Normalmente, el tiempo de vida media de una especie excitada es breve porque hay diversas formas en las cuales un átomo o una molécula excitada liberan su exceso de energía y se relajan a su estado fundamental. Dos de las más importantes de estos mecanismos son la relajación (desactivación) no radiante y la relajación fluorescente. Relajación no radiante Relajación vibracional Conversión interna Fenómeno de relajación vibracional Señalada por las flechas onduladas cortas entre los niveles de energía vibracionales, tiene lugar durante las colisiones entre moléculas excitadas y las moléculas del disolvente. Durante estas colisiones el exceso de energía vibracional se transfiere a las moléculas del disolvente en una serie de etapas como se indica en la Figura 66. Figura 65. Diagrama parcial de energía para un sistema fotoluminiscente

32 La ganancia de energía vibracional del disolvente se refleja en un ligero incremento de la temperatura del medio. La relajación vibracional es un proceso tan eficiente que el tiempo de vida promedio de un estado vibracional excitado es de s aproximadamente. También puede ocurrir el relajamiento no radiante entre el nivel vibracional inferior de un estado electrónico excitado y el nivel vibracional superior de otro estado electrónico. Este tipo de relajación llamado algunas veces conversión interna, se ilustra por las flechas onduladas largas. En la figura se ilustra el otro proceso de relajación: la fluorescencia. Se puede observar que las bandas de radiación son producidas cuando las moléculas fluorecen debido a que las moléculas electrónicamente excitadas se pueden relajar a cualquiera estados vibracionales del estado electrónico fundamental. De igual forma que las bandas de absorción molecular, las bandas de fluorescencia molecular están formadas por una multitud de líneas espaciadas tan estrechamente que son muy difíciles de resolver. El camino más probable hacia el estado fundamental es aquel que minimiza el tiempo de vida media del estado excitado. Por tanto, si la desactivación por fluorescencia es rápida con respecto a los procesos sin radiación, se observa tal emisión. Por otro lado, si un camino sin radiación tiene una constante de velocidad favorable, la fluorescencia no tiene lugar o es menos intensa. La fotoluminiscencia está limitada a un número relativamente pequeño de sistemas que incorporan características estructurales y ambientales que hacen que la velocidad de los procesos de desactivación sin radiación se reduzcan hasta el punto que la reacción de emisión puede competir cinéticamente. Se observa que las bandas de fluorescencia molecular están formadas principalmente por bandas que tienen longitudes de onda más largas y, por tanto, energías menores que la banda de radiación responsable de su excitación. Este desplazamiento hacia longitudes de onda mayores se llama desplazamiento de Stokes. En aquellos casos en los que la radiación absorbida sea emitida sin cambio en la longitud de onda (misma energía) se conoce como radiación de resonancia o resonancia fluorescente. Debido a que las diferencias de energía entre los estados vibracionales es aproximadamente el mismo, tanto para el estado fundamental como para el excitado, la absorción, o espectro de excitación, y el espectro de emisión o fluorescencia de un compuesto frecuentemente aparece como una imagen especular de uno a otro con una sobreposición que ocurre en la línea de resonancia.

33 Figura 66. Espectro de fluorescencia de antraceno en alcohol. (a) espectro de excitación; (b) espectro de emisión Variables que afectan la fluorescencia Rendimiento cuántico El rendimiento cuántico o la eficacia cuántica de la fluorescencia es simplemente la relación entre el número de moléculas que emiten fluorescencia respecto al número total de moléculas excitadas. Las moléculas altamente fluorescentes, por ejemplo, la fluoresceina, tienen eficiencias cuánticas que, en ciertas condiciones, se aproximan a la unidad. Las especies no fluorescentes tienen eficiencias que son prácticamente cero Estructura La fluorescencia más intensa y la más útil es la que presentan los compuestos que contienen grupos funcionales aromáticos. Los compuestos que contienen estructuras alifáticas y alicíclicas de carbonilo o estructuras con dobles enlaces muy conjugados pueden presentar también fluorescencia. La mayoría de los

34 hidrocarburos aromáticos no sustituidos son fluorescentes en disolución, la eficacia cuántica aumenta con el número de anillos y con su grado de conjugación. La sustitución en un anillo aromático causa desplazamientos en la longitud de onda de absorción máxima y los cambios correspondientes en los picos de fluorescencia. Además, la sustitución afecta frecuentemente la eficiencia de la fluorescencia como se demuestra en la Tabla 5. Tabla 5. Efecto de la sustitución en la fluorescencia del benceno Compuesto Fórmula Longitud de onda de la fluorescencia, nm Intensidad relativa de la fluorescencia Benceno C 6 H Tolueno C 6 H 5 CH Propilbenceno C 6 H 5 C 3 H Fluorobenceno C 6 H 5 F Clorobenceno C 6 H 5 Cl Bromobenceno C 6 H 5 Br Iodobenceno C 6 H 5 I - 0 Fenol C 6 H 5 OH Ion fenolato C 6 H 5 O Anisol C 6 H 5 OCH Anilina C 6 H 5 NH Ion anilinio C 6 H 5 NH Acido benzoico C 6 H 5 COOH Benzonitrilo C 6 H 5 CN Nitrobenceno C 6 H 5 NO 2-0

35 Rigidez estructural Empíricamente se encuentra que la fluorescencia está particularmente favorecida en moléculas que poseen estructuras rígidas. Por ejemplo, las eficacias cuánticas para el fluoreno y el bifenilo están próximas a 1'0 y 0'2, respectivamente, bajo condiciones similares de medida. Fluoreno Binefilo La influencia de la rigidez también tiene importancia en el aumento de la fluorescencia de ciertos quelatantes orgánicos cuando están formando un complejo con un ion metálico. Por ejemplo, la fluorescencia de la 8- hidroxiquinoleína es mucho menor que la de su complejo con zinc Temperatura y disolvente La eficacia cuántica de la fluorescencia disminuye en muchas moléculas con el aumento de la temperatura, ya que el aumento de la frecuencia de las colisiones a temperatura elevada hace aumentar la probabilidad de desactivación no radiante (conversión externa). Una disminución en la viscosidad del disolvente también aumenta la probabilidad de conversión externa y produce el mismo resultado Efecto del ph La fluorescencia de un compuesto aromático con sustituyentes ácidos o básicos en el anillo depende normalmente del ph. Tanto la longitud de onda como la intensidad de emisión son probablemente diferentes para la forma ionizada y no ionizada del compuesto. Por lo tanto será muy frecuente en los métodos fluorimétricos el control estricto del ph.

36 Efecto de la concentración La potencia de la radiación fluorescente F es proporcional a la potencia radiante del haz de excitación que es absorbido por el sistema. ( ) Ecuación 2.6 Donde P 0 es la potencia del haz incidente sobre la disolución y P es su potencia después de atravesar la longitud b del medio. La constante K' depende de la eficacia cuántica del proceso de fluorescencia. Con objeto de relacionar F con la concentración c escribimos la ley de Beer así: Sustituyendo nos queda: Ecuación 2.7 ( ) Ecuación 2.8 Si desarrollamos el término exponencial como una serie de Maclaurin será; [ ( ) ( ) ] Ecuación 2.9 Siempre que 2'303 bc < 0'05 podemos escribir que, Ecuación 2.10 y si P0 se mantiene constante, Ecuación 2.11 Cuando c es suficientemente elevada como para que la absorbancia multiplicada por 2'303 sea mayor que 0'05, los términos de mayor orden de la expresión anterior no son despreciables y la linealidad se pierde. Este efecto es un resultado de autoapagamiento, en el cual las moléculas del analito absorben la fluorescencia producida por otras moléculas de analito.

37 Lección 22: Instrumentación Como la mayor parte de los instrumentos utilizados en los métodos espectroscópicos, los componentes principales de un fluorímetro son: una fuente de radiación, un sistema selector de longitudes de onda (filtro o monocromador), una célula conteniendo la muestra, y un detector. Sin embargo, una diferencia importante entre la fluorimetría (también la fosforimetría) y los demás métodos espectroscópicos es la presencia de dos filtros (o dos monocromadores); uno para seleccionar la longitud de onda de excitación y otro para la de emisión. En la Figura 67 se han representado los componentes básicos de un fluorímetro. En espectrómetros de luminiscencia se necesitan fuentes de radiación más intensas que las lámparas de volframio o de deuterio que se utilizan en las medidas de absorción. Anteriormente se indicó que la intensidad de fluorescencia es directamente proporcional a la potencia del haz incidente. La lámpara de arco de xenón presenta un espectro esencialmente continuo que se extiende por las regiones ultravioleta y visible, siendo muy utilizada en espectrofluorímetros de red. Por otra parte, en los fluorímetros de filtro, suele utilizarse la lámpara de arco de mercurio, la cual emite un intenso espectro de líneas sobre un fondo continuo. El uso de esta fuente puede implicar una mayor sensibilidad, debido a la alta intensidad de las líneas del mercurio. Figura 66. Componentes básicos de un fluorímetro Los sistemas para seleccionar la longitud de onda más empleados en instrumentos de luminiscencia son filtros y redes. De hecho, los instrumentos se clasifican en fluorímetros de filtro y espectrofluorímetros de red. De los primeros,

38 los más utilizados son los filtros de interferencia, por proporcionar pequeñas anchuras de banda. Por lo que respecta a las redes, ofrecen las ventajas de presentar resolución uniforme y dispersión lineal a todas las longitudes de onda. El mayor inconveniente es que pasan varios órdenes espectrales, lo cual puede evitarse usando filtros en el camino óptico Los prismas Se usan poco en instrumentos para luminiscencia, porque, aunque proporcionan una gran dispersión en el ultravioleta, es en el visible donde se realizan muchas medidas, y, además, para obtener una sensibilidad adecuada se necesitaría un prisma muy grande, lo cual no es económico Las cubetas Son utilizadas para contener la muestra, suelen ser de cuarzo para permitir el paso de la radiación ultravioleta. Las más típicas son de 1 cm de espesor, como las utilizadas para medidas de absorción, excepto que todas las caras son transparentes a la radiación (están pulidas), ya que generalmente las medidas de fluorescencia se realizan en un ángulo de 90º respecto a la radiación incidente; a otros ángulos, la dispersión por la disolución y las propias paredes de la cubeta puede originar mayor ruido de fondo Los detectores La mayor parte de los fluorímetros y espectrofluorímetros actuales usan tubos fotomultiplicadores como sistemas para detectar la radiación de fluorescencia. Finalmente, mencionar que mientras que los más precisos espectrofotómetros de absorción ultravioleta y visible utilizan un dispositivo de doble haz, esta operación no es práctica en instrumentos de luminiscencia. Por ello, hay que tener en cuenta siempre los problemas inherentes al empleo de haz sencillo.

39 Lección 23: Relación entre intensidad de fluorescencia y concentración La intensidad de fluorescencia, If, es directamente proporcional a la concentración, C, de la sustancia absorbente, pero solo a concentraciones relativamente bajas, lo cual puede demostrarse como sigue: la fracción de radiación transmitida, según la Ley de Beer, es: Ecuación 2.12 donde, Po = potencia del haz incidente P = potencia del haz transmitido ε = absortividad b = espesor de la cubeta (camino óptico) C = concentración La fracción de radiación absorbida es: Ecuación 2.13 y la cantidad de radiación absorbida es: ( ) Ecuación 2.14 La intensidad de la radiación fluorescente, If, está relacionada con la cantidad de radiación absorbida de la forma siguiente: ( ) Ecuación 2.14 Donde k es una constante de proporcionalidad, que depende de parámetros instrumentales (eficacia del sistema detector y geometría) y φf es el rendimiento cuántico de la fluorescencia (relación entre el número de fotones emitidos y los absorbidos por unidad de tiempo). El término 1 10 εbc puede desarrollarse como una serie de McLaren, Ecuación 2.15

40 [ ( ) ( ) ] de donde, [ ( ) ( ) Ecuación 2.16 ( ) ( ) ] Ecuación 2.17 Para bajas concentraciones, cuando el término εbc sea menor que aproximadamente 0.05, todos los términos de la Ecuación 2.17, excepto el primero, son muy pequeños, y la expresión se reduce a Ecuación 2.18 Así, para disoluciones muy diluidas, la intensidad de fluorescencia será directamente proporcional a la concentración: Ecuación 2.19 En la Figura 68 se muestra una representación gráfica de la variación de la intensidad de fluorescencia con la concentración. Figura 67. Relación entre la intensidad de fluorescencia y la concentración

41 A concentraciones relativamente altas, los términos de mayor orden de la Ecuación 2.19, pueden ser lo suficientemente importantes, para que se pierda la linealidad, como ya se comentó anteriormente. Sin embargo, existen otras causas para la no linealidad a concentraciones altas. Son las siguientes: Autoatenuación. Se produce como consecuencia del choque entre moléculas excitadas, lo cual origina una desactivación en forma de energía no radiante. Lógicamente, al aumentar la concentración, aumentará la probabilidad de que se produzcan esas colisiones Autoabsorción. En este caso, la fluorescencia de una molécula es absorbida por otra molécula del mismo soluto en estado fundamental, y la probabilidad de tales eventos crece al aumentar la concentración. La auto-absorción reduce la intensidad de fluorescencia, salvo que φf sea la unidad. Por ello, la representación gráfica de I f frente a C puede hacerse incluso descendente para altos valores de C. Como ya se vio, I f es proporcional a la absortividad molar: a mayor absorción, mayor fluorescencia. Sin embargo, cuando la absorción es demasiado grande y la disolución bastante concentrada, la porción de la disolución más próxima a la fuente luminosa absorbe mucha radiación, de forma que queda muy poca disponible para el resto. Si la concentración es tan grande que toda la radiación incidente es absorbida, I f = k φf (P o P) = k φf P o, en cuyo caso, I f tiende al valor de k P o (ver Figura 68). Muchas moléculas aromáticas (especialmente aquellas con grupos funcionales capaces de unirse por enlaces de hidrógeno) forman dímeros u otros agregados en disolución. Esta tendencia, lógicamente será mayor a altas concentraciones de soluto. Considerando que, con frecuencia, los dímeros son menos fluorescentes que el correspondiente monómero, se observará un descenso de I f como consecuencia de la formación de estas especies dímeras.

42 Por otra parte, ciertos compuestos en estado singulete excitado tienen tendencia a formar asociaciones con moléculas de su misma especie en estado fundamental. El espectro de emisión de estas asociaciones suele estar desplazado hacia mayores longitudes de onda respecto al del correspondiente monómero.

43 Lección 24: Aplicaciones de los métodos de fluorescencia En cuanto a las aplicaciones de los métodos fluorimétricos, y ante la imposibilidad de dar cuenta de todas ellas, se citarán algunos ejemplos específicos, dentro de los grupos que se relacionan seguidamente Sustancias inorgánicas Las sustancias inorgánicas pueden determinarse por los métodos siguientes: Análisis directo Aunque, bastantes especies inorgánicas presentan fluorescencia en estado sólido, pocos son los sistemas de este tipo aplicables analíticamente. En disolución, tampoco son demasiado numerosas las determinaciones directas; prácticamente se circunscriben a compuestos de uranilo (las sales de uranio tetravalente y los uranatos no son fluorescentes), algunos elementos pertenecientes a las tierras raras [Ce(III), Eu(III), Tb(III), Dy(III)] y Tl(I). Este último, en presencia de cloruro (TlCl 4 3 ) muestra una intensa emisión fluorescente a 450 nm. Un ensayo cualitativo para Tl(I) se basa en su fluorescencia violeta en presencia de KCl Formación de quelatos fluorescentes. La formación de quelatos fluorescentes por combinación de un ión metálico con un ligando orgánico proporciona uno de los métodos más sensibles y selectivos para la determinación de muchos elementos. En la Tabla 6 se muestran algunos ejemplos. La mayor parte de las aplicaciones inorgánicas de la fluorimetría se han desarrollado para elementos que no son de transición, pues aunque muchos iones metálicos de transición forman quelatos muy estables y complejos con ligandos aromáticos, un número relativamente pequeño de ellos son fluorescentes. Ello se debe a lo siguiente: en primer lugar, muchos iones de transición son paramagnéticos, lo cual favorece el cruzamiento entre sistemas y, en

44 consecuencia, disminuye la probabilidad de desactivación por fluorescencia. Además, muchos complejos de metales de transición poseen una gran cantidad de niveles energéticos poco espaciados, lo cual aumenta la probabilidad de desactivación por conversión interna. Tabla 6. Determinación fluorimétrica de especies inorgánicas. Especie Reactivo Sensibilidad (μg/ml) Ag + Butilrodamina S 0.01 Al 3+ Morina 0.05 Al 3+ Rojo de alizarina Cu 2+ Luminocupferrón 0.1 Li + 8-hidroxiquinoleína 0.2 Sn 4+ Flavonol 0.1 Determinaciones indirectas Especie Reactivo Sensibilidad (μg/ml) Cl - Nitrato de uralino 1.0 F - Al-morina 0.2 PO4 3- Al-morina Determinaciones indirectas. Algunos aniones, tales como F o CN pueden determinarse indirectamente por medida de la disminución de la intensidad de fluorescencia de un determinado quelato (Ver Tabla 6). Así, por ejemplo, el fluoruro puede determinarse indirectamente mediante el descenso de la fluorescencia que su presencia ejerce sobre la fluorescencia del complejo aluminio morina, con un límite de detección de 0.2 μg/ml. En otros casos tiene lugar la liberación de un ligando y la formación

45 posterior de un quelato fluorescente con otra especie. Así, es posible la determinación de cianuro mediante el proceso descrito en la Figura 69. Figura 68. Determinación fluorimétrica del cianuro Sustancias orgánicas Existe una amplia variedad de compuestos orgánicos que pueden determinarse por métodos fluorimétricos a niveles inferiores a 1 ppm (μg/ml), y algunas de las especies más fluorescentes, tales como la fluoresceína o la quinina a niveles considerablemente inferiores. Hay que recordar que, en principio, presentarán fluorescencia molecular especies altamente absorbentes, como compuestos no aromáticos altamente conjugados, aromáticos y heterocíclicos. Por eso, gran cantidad de hidrocarburos, colorantes, ácidos, aldehídos, alcoholes, compuestos nitrogenados, hidratos de carbono, pesticidas, porfirinas, esteroides, fármacos, etc. son susceptibles de ser detectados o determinados por métodos fluorimétricos. A modo de ejemplo, puede citarse la determinación de vitaminas, interesante desde el punto de vista histórico, por ser uno de los primeros grupos de compuestos biológicamente activos para los que se describieron métodos fluorimétricos. Muchos de estos compuestos tienen estructuras que presentan fluorescencia nativa, mientras que otros pueden convertirse en fluoróforos por procedimientos sencillos (Tabla 7).

46 Tabla 7. Determinación fluorimétrica de vitaminas Vitamina Reactivo λ ex λ em A Fluorescencia nativa B 1 + ferricianuro B 2 Fluorescencia nativa B 6 + KMnO B 12 Fluorescencia nativa C Ac. Dehidroascórbico + o-fenilendiamina D 2 D 3 + Ac. tricloroacético E Fluorescencia nativa K La vitamina A puede determinarse aprovechando la fluorescencia nativa que presenta, midiendo la radiación emitida a 480 nm. Figura 69. Estructura química de la vitamina A. Dentro del grupo de vitaminas B, las hay que presentan fluorescencia nativa, como la B 2 (riboflavina) y la B 12 (cianocobalamina), mientras que otras, como la B 1 (tiamina) y la B 6 (piridoxina) necesitan una transformación previa, lo cual se consigue por oxidación con ferricianuro y permanganato respectivamente.

47 La vitamina C requiere la transformación previa en ácido dehidroascórbico y posterior condensación con o-fenilendiamina, para originar un fluoróforo azul. Por su parte, las vitaminas D 2 y D 3 dan productos altamente fluorescentes cuando se tratan con ácido tricloroacético y otros ácidos. El tocoferol (vitamina E) puede determinarse fluorimétricamente haciendo uso de su fluorescencia nativa, o bien, puede condensarse con o-fenilendiamina, después de oxidación para dar un derivado fluorescente de fenacina. Para la vitamina K no se han descrito métodos fluorescentes debido a que sufre descomposición a la luz ultravioleta. Dentro de este epígrafe general en el que se trata de las aplicaciones de la fluorimetría a la detección y determinación de compuestos orgánicos, se indican seguidamente algunas aplicaciones dentro de campos concretos Química clínica La más extensa aplicación de los métodos fluorimétricos, en términos de número de análisis realizados por día, tiene lugar, probablemente, en química clínica. Muchas determinaciones clínicas importantes se realizan rutinariamente por estos métodos en muchos laboratorios. La alta sensibilidad, simplicidad y bajo coste de la instalación son factores importantes en la adopción de estos métodos. De los centenares de métodos descritos para decenas de compuestos diferentes, se citan, a modo de ejemplo, y como curiosidad algunos de ellos. La determinación de fenilalanina es posible fluorimétricamente usando solamente 25 μl de suero. Es importante esta determinación para la prevención de ciertos tipos de subnormalidad, ya que, la incapacidad para metabolizar este aminoácido hace que tenga lugar su acumulación en los tejidos, originando daños en el cerebro y retraso mental progresivo. Asimismo, pueden determinarse estrógenos en orina, en concentraciones del orden de 0.05 μg/ml, corticosteroides, de gran importancia para evaluar la función de las glándulas suprarrenales, catecolaminas, importantes por su influencia sobre el sistema vascular, porfirinas en orina, que pueden servir para indicar defectos en la médula ósea, trastornos hepáticos e incluso envenenamiento por plomo, así como otras especies de gran importancia práctica en muchos casos de interés clínico.

48 La fluorimetría también se utiliza con éxito en análisis bioquímico. Así, por ejemplo, es posible la determinación de la secuencia de nucleótidos en el ADN con marcas fluorescentes, lo cual es fundamental para la elaboración de los códigos genéticos. La forma de proceder consiste en "marcar" las unidades fundamentales de terminación de cadena con grupos fluorescentes que emitan a longitudes de onda determinadas Análisis forense La gran sensibilidad de muchos métodos fluorimétricos hace que sean particularmente adecuados en muchas determinaciones relacionadas con análisis forense. Como ejemplo se muestra seguidamente la forma de detectar huellas digitales latentes por fluorescencia producida por láser. Cuando un dedo presiona sobre una superficie, aproximadamente 0.1 mg de material permanece adherido a ella. De él, el % es agua, que se evapora, quedando un residuo del orden de 1 μg. Aproximadamente, la mitad son sustancias inorgánicas (por ejemplo, NaCl) y el resto una mezcla de sustancias orgánicas (aminoácidos, lípidos, vitaminas). La detección de los restos de aminoácidos se lleva a cabo por tratamiento con ninhidrina (I), la cual reacciona con ellos originando un producto púrpura (II), no fluorescente, invisible si la cantidad es muy pequeña (ver Figura 71). Figura 70. (I) Ninhidrina reactivo empleado en la detección de huellas; (II) producto obtenido de la reacción con ninhidrina. Posteriormente, por tratamiento con cloruro de cinc, se forma un producto fluorescente (III) que se pone de manifiesto mediante su fluorescencia inducida por láser.

49 Figura 71. Producto fluorescente obtenido en la reacción realizada en la detección de huellas Fármacos y drogas La fluorimetría también encuentra amplia aplicación en el análisis de fármacos y drogas. Su importancia se basa en la gran sensibilidad y selectividad de las técnicas fluorimétricas. Hay que considerar que la farmacología requiere métodos analíticos capaces de distinguir entre varios medicamentos y sus productos metabólicos. Debido a que muchos fármacos se administran en dosis muy pequeñas, con frecuencia inferiores a 100 μg diarios, los métodos analíticos deben ser altamente sensibles, sensibilidad que debe ser suficiente para detectar las pequeñas cantidades expulsadas del organismo. En la Tabla 8 se muestran algunos ejemplos de determinaciones fluorimétricas para este tipo de sustancias. Tabla 8. Determinación fluorimétrica de fármacos y drogas Sustancia Condiciones λ ex (nm) λ em (nm) Sensibilidad (μg/ml) Adrenalina ph Ac. salicílico ph Ampicilina Hidrólisis Aspirina HAc-CHCl Atropina eosina Codeina ph Digital HCl-glicerina

50 Estreptomicina ph LSD ph Morfina ph Pentotal ph Quinina ph Química Agroalimentaria También se utilizan las técnicas luminiscentes con cierta extensión. Así, por ejemplo, los antioxidantes son sustancias que se añaden a los alimentos que contienen grasas o aceites para evitar su degradación durante el proceso de elaboración. Una de las sustancias empleadas es el hidroxianisol butilado (BHA). Esta sustancia está permitida por la legislación vigente y puede separarse por destilación con arrastre en corriente de vapor y determinarla directamente en el destilado por espectrofluorimetría ( ex =293 nm; em =323 nm) Contaminación ambiental Muchas aplicaciones de los métodos fluorimétricos en relación con la contaminación atmosférica se refieren a la determinación de hidrocarburos aromáticos polinucleares, muchos de los cuales son cancerígenos. En ocasiones, pueden cuantificarse productos no fluorescentes mediante una reacción previa que origine un fluoróforo y en combinación con técnicas de separación cromatográfica. Así, por ejemplo, se han encontrado isocianatos alifáticos (muy perjudiciales para la salud) en el aire de lugares de trabajo donde se emplean espumas de poliuretano. El procedimiento consiste en tratar con 1-naftilmetilamina para formar derivados fluorescentes que pueden separarse por cromatografía líquida.

51 Figura 72. Método fluorimétrico para la determinación de hidrocarburos aromáticos polinucleares. Respecto a la contaminación de aguas, se encuentra un interesante ejemplo en el uso del espectro de fluorescencia casi como "huella digital" para la identificación de crudos y otros materiales petrolíferos procedentes de vertidos. La técnica, relativamente moderna, proporciona unos resultados tan dignos de confianza, al menos, como los obtenidos por procedimientos de identificación convencionales, habiendo sido adoptada por los servicios de guarda costas de algunos países. Ejemplo Se desea analizar vitamina B 1 en un preparado comercial de g por el método del tiocromo. Se extrae con HCl y fosfatasa y se diluye a 100 ml. Se purifica una alícuota de 15 ml pasándola por una columna cromatográfica, y por causas inherentes al proceso se diluye a 25 ml. De la anterior solución, se forman dos porciones de 5 ml, una de ellas se trata con ferricianuro y ambas se aforan a 10 ml para examen fluorimétrico. Una solución de referencia de 0.2 ppm de tiamina se somete al mismo tratamiento que la muestra problema, con excepción de que la porción introducida en la columna conserva su volumen original. Se toman dos alícuotas de 5 ml y una se oxida y ambas se aforan a 10 ml. Se mide la fluorescencia de ambas muestras dando lugar a intensidades de fluorescencia de 18 y 13 unidades de fluorescencia, respectivamente. Calcular los ppm de vitamina B 1 en la muestra. Solución: Como el tratamiento del patrón y de la muestra problema son idénticos, salvo la dilución de 15 a 25 ml en la columna cromatográfica, hacemos referencia a la concentración de patrón de 0.2 ppm de tiamina, que da una fluorescencia de 13

52 unidades. Por tanto, 18 unidades de fluorescencia se corresponden a una concentración de tiamina de: Esta concentración debe ser corregida por la exclusiva dilución cromatográfica que sufre la muestra problema. Luego la concentración de tiamina en los 100 ml es: ( ) Para obtener los mg de tiamina en la muestra, se multiplica la concentración por el volumen expresado en litros: mg de tiamina en 100 ml o 2 gramos de muestra = (mg/l) * 0.1 L = mg. Para obtener los ppm (mg analito / Kg muestra) de tiamina en la muestra: ppm de tiamina en la muestra = (mg) / 2x10-3 Kg = 23.1 ppm Ejemplo En ausencia de autoabsorción, la intensidad de fluorescencia de una muestra es proporcional a la concentración, solo a concentraciones bajas. Calcular el porcentaje de error que se comete suponiendo que la respuesta es lineal cuando se mide la intensidad relativa de fluorescencia de disoluciones 2.5x10-5 y 2.5x10-6 M de un compuesto cuya e=4000 L mol -1 cm -1 si el valor de b es 1 cm. Solución: Teóricamente, la intensidad de fluorescencia, IF, es proporcional a la eficacia cuántica, F, y a la intensidad de radiación absorbida por la muestra (I0-I), diferencia entre la intensidad incidente y la intensidad transmitida: ( ) Ecuación 2.20 Por otra parte, la transmitancia se define como la relación entre la Intensidad transmitida, I, y la intensidad incidente I0, siendo la Absorbancia, A, el logaritmo decimal de la transmitancia cambiado de signo:

53 Por tanto: ( ) ( ) 10 -εbc se puede aproximar, a concentraciones bajas a la serie de Taylor. Para ello es necesario hacer un cambio de base: por lo tanto ( ) El desarrollo de la serie de Taylor para e x cuando x tiende a cero es: ( ) ( ) ( ) ( ) ( ) ( ) ( ) De tal manera que, cuando x tiende a cero (bajas absorbancias): Entonces ( ) ( ) ( ) Si la absorbancia es pequeña, (A < 0.05) se pueden despreciar los términos de orden 2 y superiores, por tanto: y la intensidad de fluorescencia aproximada; ( ) El porcentaje de error que se comete:

54 ( ) ( ) ( ) - Si la concentración es 2.5x10-5 M: que supera el valor de 0.05 ( ) - Si la concentración es 2.5x10-6 M: ( )

55 Ejercicios (Unidad 2 Capítulo 5) 1. La forma reducida del dinucleótido de nicotinamida y adenina (NADH) es una coenzima importante y muy fluorescente. Tiene un máximo de absorción de 340 nm y un máximo de emisión a 465 nm. Las soluciones patrón de esta sustancia generan las siguientes intensidades de fluorescencia: La ecuación de calibración de los anteriores datos, para hallar la concentración del NADH en función de las intensidades relativas es: a. I rel = 19,45 c NADH + 2,8 x 10-4 b. I rel = 20,65 c NADH + 6,1 x 10-4 c. I rel = 22,35 c NADH + 3,6 x 10-4 d. I rel = 21,43 c NADH + 2,5 x De acuerdo con el enunciado del ejercicio 1. calcule la desviación estándar de la pendiente y la que corresponde a la regresión de la curva. a. 0,1747 y 0,2696 b. 0,2134 y 0,2576 c. 0,1853 y 0,2787 d. 0,2046 y 0,2448

56 3. Con los datos consignados en la tabla del enunciado 1 desarrolle el siguiente ejercicio: una solución desconocida tiene una fluorescencia relativa de 12,16. Cuál será su concentración en NADH? a μm b μm c μm d μm 4. En algunos métodos fluorimétricos, el amortiguamiento de la fluorescencia es proporcional a la concentración de las especies deseadas, por ejemplo, el metal X puede suponerse que amortigua la fluorescencia del ligando L. En una serie de medidas se obtuvieron los siguientes datos: La relación molar del complejo formado entre X y L es: a. 6,42 x M b. 3,46 x M c. 2,36 x M d. 5,63 x M

57 5. A cuatro alícuotas de 10,0 ml de una muestra de agua se adicionaron 0.00, 1.00, 2.00 y 3.00 ml de una solución estándar de NaF que contenía 10.0 ppb de F- tal y como se muestra resumido en la tabla. Se adicionaron a cada una 5.00 ml exactos de una solución que contenía un exceso de complejo de Al con el rojo de Alizarina R, un complejo fuertemente fluorescente, y las disoluciones se diluyeron a 50.0 ml. La intensidad de de fluorescencia de las cuatro disoluciones y de un blanco fueron las siguientes: Las partes por billón (ppb) de F en la muestra son: a. 0,361 ppb b. 0,634 ppb c. 0,381 ppb d. 0,564 ppb

58 CAPÍTULO 6: ANÁLISIS DE SUPERFICIES POR MÉTODOS ESPECTROSCÓPICOS Introducción Mediante éste capítulo se pretende introducir al estudiante en una nueva rama de la química analítica: la química analítica de superficies o análisis de superficies. Su presentación como entidad propiamente dicha, ha surgido gracias a dos eventualidades preponderantes: 1. El desarrollo de tecnologías cada vez más complejas ha permitido el diseño y utilización de instrumentos poderosos que pueden revelar la estructura atómica y la composición química de las superficies; 2. la información que se obtiene a partir de los análisis de superficies e interfaces, se ha constituido como una base potente para conocer procesos químicos fundamentales de gran importancia, tales como: corrosión, adsorción, quimisorción, reactividad, oxidación, pasivación, o difusión entre otros, lo que ha permitido avanzar enormemente en el desarrollo de otras ramas de la Ciencia y la Tecnología (producción de catalizadores, semiconductores, circuitos microelectrónicos, polímeros, etc.).

59 Lección 25: Espectroscopia fotoelectrónica de rayos X (XPS) Descripción de la técnica La espectroscopia fotoelectrónica de rayos X (XPS), es el método de caracterización de superficies más ampliamente utilizado hoy en día. La popularidad de esta técnica deriva del alto contenido de información que suministra y la flexibilidad para ser utilizada en una gran variedad de muestras. La técnica XPS se cataloga dentro de las técnicas analíticas de espectroscopias electrónicas, denominadas de este modo porque se miden electrones. El más básico análisis XPS de una superficie puede proporcionar información cualitativa y cuantitativa de todos los elementos presentes, excepto H y He. Figura 73. Equipo de espectroscopia fotoelectrónica de rayos X Con aplicaciones más sofisticadas de la técnica se obtiene información detallada de la química, organización y morfología de la superficie. La gran potencia de esta herramienta de trabajo se vislumbra en las siguientes aplicaciones, realizadas en los primeros 10 nm de una superficie:

60 Identificación de todos los elementos presentes (excepto H, He) en concentraciones mayores al 0.1%. Determinación semicuantitativa de la composición elemental de la superficie (error < ± 10 %). Información acerca del entorno molecular: estado de oxidación, átomos enlazantes, orbitales moleculares, etc. Información sobre estructuras aromáticas o insaturadas a partir de las transiciones Π* Π. Información de grupos orgánicos utilizando reacciones de derivatización. Perfiles de profundidad de 10 nm no-destructivos y destructivos de profundidades de varios cientos de nanómetros. Variaciones laterales en la composición de la superficie. Estudio sobre superficies hidratadas (congeladas) Interacción de la radiación X sobre la materia. Para conocer la técnica XPS se ha de comprender el efecto fotoeléctrico y de fotoemisión. Cuando un fotón se encuentra con un átomo puede ocurrir: que pueda atravesarlo sin interacción alguna que sea dispersado por un electrón de un orbital atómico con lo que ocurre una pérdida de energía. que el fotón interaccione con electrón de un orbital atómico con una transferencia total de la energía del fotón hacia el electrón, ocurriendo la emisión del electrón del átomo. El segundo proceso es conocido como Compton scattering y puede ser importante en procesos de alta energía, mientras que el tercer proceso resulta ser básico para la técnica XPS. Cuando ningún electrón ha sido emitido por el átomo, se debe a que la frecuencia de excitación del fotón es demasiado baja. Cuando aumentamos gradualmente la energía del fotón se comienza a observar la fotoemisión de electrones del átomo. Una vez superada la frecuencia umbral, el número de electrones emitidos será proporcional a la intensidad de iluminación (mayor número de fotones de alta frecuencia de excitación).

61 Figura 74. (Izquierda) Superficie irradiada con una fuente de fotones de alta energía que provoca la emisión de electrones. (Derecha) El fotón imparte su energía a un electrón de un nivel electrónico interior, y este es emitido Por otra parte, la energía cinética de los electrones emitidos es linealmente proporcional a la frecuencia de los fotones excitantes, si se utiliza fotones de energía muy superior a la umbral; el exceso de energía es transmitido al electrón que se emite. El proceso de fotoemisión resulta ser extremadamente rápido, s, y su física básica se describe mediante la ecuación de Einstein: Ecuación 2.21 Donde E B es la energía de enlace del electrón en el átomo, hν es la energía de la fuente de rayos X, y KE es la energía cinética del electrón detectado que es medida por el espectrómetro del XPS. Un electrón cargado negativamente se unirá al átomo por atracción con su núcleo positivo. Cuanto más interno es el electrón, más fuerte será su enlace. La energía de enlace de un electrón variará según el tipo de átomo (valor absoluto de su carga nuclear) y de los átomos que a él se unan (los cuales pueden alterar la distribución electrónica). En el caso de los isótopos, estos poseen distinto número de neutrones pero igual carga nuclear, por tanto no varía la energía de enlace. Las interacciones débiles entre átomos, como fuerzas de cristalización o enlace de hidrógeno, no alteran suficientemente la distribución electrónica como para que se pueda observar un cambio en la energía de enlace medible. La energía de enlace

62 que se mide por XPS se asocia siempre a enlaces de tipo iónico o covalente entre átomos. Para los gases, la energía de enlace de un electrón es igual a su energía de ionización. En cambio, en los sólidos existe una influencia por parte de la superficie, y una energía adicional es necesaria para remover un electrón de la misma, esta energía extra es denominada función de trabajo. Cuando un sólido es irradiado por rayos X, también puede ocurrir la emisión de electrones Auger. Estos electrones se diferencian de los fotoelectrones, y se caracterizan porque su energía es independiente de la energía de irradiación Energía de enlace y ajuste químico La energía de enlace de un fotoelectrón emitido es simplemente la diferencia de energía entre el electrón n-1 del estado final y el electrón n del estado inicial de energía: ( ) ( ) Ecuación 2.21 Si durante el proceso de fotoemisión no ocurre un reordenamiento de electrones en el átomo o molécula, entonces la energía de enlace será la igual al valor negativo de la energía orbital, -ε k, para el electrón fotoemitido: Ecuación 2.22 Pero durante el proceso de fotoemisión otros electrones en la muestra no han de permanecer imperturbables, sino que pueden responder a la creación del hueco electrónico mediante un reordenamiento de las capas internas, o minimizando la energía del átomo ionizado. La reducción de energía que se produce de esta manera se conoce como energía de relajación, y ocurre tanto para electrones del átomo que contiene el hueco electrónico (relajación atómica), como para electrones de átomos vecinos (relajación extra-atómica). De este modo la energía de enlace queda definida: ( ) Ecuación 2.23 El estado inicial de energía es el estado fundamental de energía del átomo antes de ser sometido a un proceso de fotoemisión. El cambio de energía de enlace es lo que se conoce como ajuste químico, y en principio este ajuste químico será el

63 mismo para todos los niveles electrónicos de un elemento. Los efectos de relajación (atómica y extra-atómica) pueden tener una significativa importancia en la energía de enlace medida. En todos los casos, el reordenamiento de electrones que ocurre durante el proceso de fotoemisión resulta en una disminución de E B. La mayoría de las componentes de la relajación atómica derivan del reordenamiento de los electrones de las capas más externas, los cuales poseen una E B menor que el fotoelectrón emitido. Los electrones más internos y con E B mayor que la del electrón fotoemitido, realizan una pequeña contribución a la energía de relajación atómica y se puede considerar despreciable. La contribución de la relajación extra-atómica depende del material que se está examinando. La magnitud de reducción de la E B por relajación extra-atómica es superior en muestras metálicas que en sólidos iónicos. Figura 75. (a) Ajuste químico para el orbital 1s del S vs estado de oxidación en especies inorgánicas. (b) Energía de enlace del orbital 2p del S vs carga calculada en especies inorgánicas y orgánicas de azufre. Otros tipos de efectos sobre el estado final de energía y que contribuyen a la E B son el desdoblamiento en multipletes y la aparición de picos satélites. El primero

64 se origina por la interacción del hueco electrónico con electrones desapareados de orbitales más externos, mientras que el segundo surge cuando el fotoelectrón emitido pierde parte de su energía cinética para excitar a un electrón de valencia hacia un orbital desocupado (transición Π Π*) Energía de enlace de referencia Dado que la E B se determina midiendo la energía cinética del fotoelectrón emitido, esto se ha de realizar de un modo riguroso, por lo que se requiere que el espectrómetro XPS sea calibrado y referenciado. Se utilizan metales conductores que son colocados en contacto con el espectrómetro, uniéndose ambos, muestra e instrumento, a una toma de tierra. Esta operación coloca el nivel de Fermi (E f ), el nivel más alto de energía ocupado, de ambos al mismo nivel de energía. La suma de la energía cinética y la de enlace no es igual a la energía de la radiación X. La diferencia es la función de trabajo del espectrómetro, Φ sp. La función de trabajo se relaciona con el nivel de Fermi y el nivel al vacío (E vac ) en la forma: Ecuación 2.24 La función de trabajo es la energía mínima requerida para impulsar un electrón hacia el más alto nivel ocupado en el vacío. De este modo E B queda: Ecuación 2.25 Se necesita medir la energía cinética y conocer la función de trabajo del espectrómetro, siendo E B f la energía de enlace referenciada al nivel de Fermi. Para muestras conductoras se ajusta el espectrómetro mediante el empleo de Au estándar, conociendo que los valores de su energía de enlace son E f = 0.0 ev, 4f 7/2 = ev. Para conseguir una linealidad en la escala de la energía de enlace se ajusta la diferencia de energía entre líneas bastante separadas de una muestra, por ejemplo los picos 3s y 2p 3/2 del Cu. La calibración se realiza por medidas reiteradas y al ultra alto vacío, que nos asegure que las superficies de las muestras no tienen contaminación alguna.

65 Decir que la técnica XPS es sensible a la superficie. Esto se debe a que los electrones poseen menos habilidad para atravesar sólidos que los rayos X. Así, una radiación X de 1 KeV puede penetrar más de 1000 nm en un sólido, mientras que electrones de esta energía sólo penetran unos 10 nm. Por tanto los electrones que son emitidos por los rayos X que han penetrado más allá de las primeras capas de la superficie, no pueden escapar de la muestra y alcanzar el detector Características de los espectros Para realizar el análisis de un espectro de XPS se requiere conocer las características del mismo. En un análisis de XPS se ha de realizar un amplio barrido del espectro, cubriendo un rango de unos 1000 ev, y posteriormente se ha de mirar con más detalle rangos más pequeños, de unos 20 ev. En el eje horizontal se muestran valores de energía de enlace. El eje vertical representa la intensidad o cuentas medidas. Existe un aumento del ruido de fondo cuando se incrementa la energía de enlace. Esto es debido a que después de cada fenómeno de fotoemisión, existe una señal acumulativa de ruido de fondo asociada con fotoelectrones que han perdido energía debido a colisiones inelásticas en el sólido, pero que todavía tienen energía suficiente para escapar. Sobre el ruido de fondo de este espectro se observan: picos de fotoemisión asociados con sucesos de fotoionización en niveles electrónicos del átomo, y picos correspondientes a rayos-x inducidos por emisión de electrones Auger. Las emisiones Auger también se suelen encontrar tabuladas. Además se pueden distinguir de las líneas de fotoemisión cambiando la fuente de rayos X, ya que la energía cinética de las líneas Auger es la misma, mientras que las líneas de fotoemisión varían con la energía de la radiación X. Las líneas de poca intensidad que aparecen a bajas energías de enlace, 0 30 ev, son originadas por la fotoemisión de los electrones de valencia (orbitales más externos). Como regla general, un espectro XPS se estudia realizando espectros locales de alta resolución sobre cada una de las zonas características encontradas en un primer espectro de barrido amplio, corroborando toda la información que sea obtenida y procurando que no existan contradicciones. Los registros XPS aportan gran información tanto en el análisis de sistemas orgánicos como inorgánicos. En estos últimos suelen aparecer más características sobresalientes en los espectros, como es la aparición de dobletes spin-orbital, desdoblamientos multipletes y pérdidas plasmón.

66 Los análisis cuantitativos se realizan mediante estudio de la relación de áreas encerradas bajo cada pico para los diferentes elementos. Introduciendo los apropiados factores de corrección se puede determinar el porcentaje de cada elemento presente (siempre en los primeros 10 nm de la superficie y exceptuando H y He). Para estos cálculos se utiliza la ecuación: ( ) ( ) ( ) ( ) Ecuación 2.25 Donde, - I ij es el área del pico j para el elemento i. - K es una constante instrumental que contiene magnitudes como el flujo de rayos X, el área de muestra irradiada, y el ángulo sólido de fotoelectrones aceptado por el analizador. - T(KE) es la función de transmisión del analizador, que incluye la eficiencia de captación de las lentes, y la energía de analizador y eficiencia del detector. - L ij (γ) representa el factor de asimetría angular para un orbital j de un elemento i. Tiene en cuenta el tipo de orbital desde el cual un electrón es emitido, y el ángulo existente entre la radiación X incidente y los electrones fotoemitidos. - σ ij, es la sección transversal de fotoionización, e indica la probabilidad en que la radiación X creará un fotoelectrón a partir de un orbital j de un elemento i. - n i (z) indica la concentración de un elemento i a una distancia z por debajo de la superficie. - (KE) es la longitud promedia de camino libre inelástico. - θ es el ángulo que forman los fotoelectrones medidos respecto a la normal de la superficie. Para evaluar la validez de la ecuación de cuantificación se ha de trabajar con muestras estándar, las cuales se caracterizan por tener una composición conocida, ser homogéneas a diferente profundidad de capas, ser relativamente estables y estar libres de contaminantes. Estos requisitos los cumplen los polímeros politetrafluoretileno (PTFE) y polietilenglicol (PGE).

67 Figura 76. Espectro XPS del poliuretano Instrumentación Los componentes primarios de un instrumento XPS son el sistema de vacío, la fuente de rayos X, un analizador de energía del electrón y un sistema de datos. La parte central del equipo lo constituye la cámara principal de vacío en la que la muestra es analizada. La realización del experimento en condiciones de vacío se debe a: Los fotoelectrones han de viajar desde la muestra hasta el detector sin colisionar con ninguna partícula de fase gaseosa Algunos componentes tales como la fuente de rayos X requieren condiciones de vacío para mantener la operatividad. La composición superficial de la muestra ha de permanecer invariable durante el experimento. Las muestras son introducidas en una primera cámara donde se procede a vaciar la atmósfera existente y acercarse a un vacío de 10-6 torr. Alcanzar el ultra-alto vacío es una operación lenta, cuya duración oscila entre varios minutos y horas. La colocación de la muestra en el interior de la cámara se realiza mediante una barra unida a un portamuestras. Dentro de la cámara principal, la muestra puede

68 ser orientada en distintas posiciones y se puede elegir la zona de la superficie a trabajar, todo ello es controlado mediante una cámara de vídeo. La fuente de rayos X más utilizadas son las que emplean ánodos de Al o Mg, otros ánodos son Si, Zr, Ag, Ti, Cr. La radiación X es monocromatizada antes de llegar a la muestra mediante el uso de un cristal de cuarzo. Esto permite aprovechar el rango de energía en que la intensidad de la radiación X es máxima (normalmente un ancho de 1 2 ev), evitar los picos satélites de fluorescencia de rayos X, e impedir que electrones de alta energía provoquen golpes de calor a la muestra y la degraden. El área de muestra que puede ser irradiada por los rayos X varía entre zonas circulares de unos pocos centímetros de diámetro hasta unas 50 micras. Esta focalización depende de la geometría de la fuente y del tipo de cañón de electrones utilizado para estimular la emisión de rayos X. La utilización de un monocromador disminuye la intensidad de rayos X que alcanzan a la muestra. Esta disminución en el flujo energético es compensada en el sistema analizador, constituido por lentes eficaces de captación de radiación, un analizador de energía y un sistema detector multicanal Aplicaciones de la espectroscopia fotoelectrónica de rayos X Una de las aplicaciones fundamentales del XPS es el estudio de las superficies. Este estudio permite detectar los elementos presentes en la superficie, cuantificarlos y en casos particulares con los estudios adecuados se puede obtener los estados de oxidación y entornos de coordinación de los elementos presentes en esas superficies. Dentro del estudio de superficies, la caracterización de los catalizadores es de gran importancia. Por ej., en la figura X se representan los espectros XPS del Ni metal y del NiO.

69 Figura 77. Diagrama esquemático de un espectrómetro XPS. Es muy importante en los procesos de hidrogenación de aceites insaturados para obtener las grasas (p. ej. Margarinas) que se deposite níquel metal sobre el soporte y que no se oxide a NiO que es inactivo. Se puede observar un desplazamiento de las energías de ligadura que permite identificar la especie superficial como Ni metal o como cationes Ni 2+ en el óxido. Esta técnica permite diagnosticar problemas puesto que el proceso de hidrogenación puede ir mal porque no se esté impregnando el soporte correctamente con Ni.

70 Figura 78. XPS (nivel 2p) de Ni y NiO. Se pueden estudiar muchos otros tipos de materiales, p. ej., electrónicos. La miniaturización de los componentes electrónicos es cada vez mayor y actualmente se crecen, en algunos casos, capas de dimensiones nanométricas que deben ser caracterizadas convenientemente.

71 Figura 79. Perfil de composición atómica de un contacto Au/Cr/Si en función del tiempo de bombardeo de Ar +. En la fabricación de componentes electrónicos hay que metalizar para mejorar los contactos pero esto no siempre es posible. Metalizar con Au una superficie de Si presenta problemas de interdifusión. Por ello se metaliza con capas Au/Cr sobre Si que dan mejores prestaciones. El perfil de composiciones que se obtiene por espectroscopia XPS de la muestra bombardeada con Ar + se da en la Figura 80. Con estos valores se puede estimar los tamaños de las capas así como la posible difusión atómica en el proceso de fabricación de los contactos. Sin embargo, traducir los tiempos de bombardeo a profundidad de superficie es una tarea muy difícil porque cada muestra responde de forma particular y se necesitan muchas experiencias para poder dar números con fiabilidad. Pero una vez calibrada convenientemente, la técnica es poderosa.

72 Lección 26: Microscopia Electrónica de Barrido (SEM) La microscopía ha sido una de las herramientas básicas para el establecimiento de las bases de la biología. La microscopía óptica tiene limitaciones de resolución debidas a aberraciones cromáticas y a la configuración de campo. La microscopía electrónica ofrece la posibilidad de obtener mayor resolución que la óptica además de disponer de herramientas complementarias derivadas de aspectos como la posibilidad de obtener información ultramicroestructural o de obtener información química mediante el análisis de Rayos X. El fundamento de la técnica consiste en la posibilidad de extraer y acelerar electrones mediante una fuente termoiónica o de emisión de campo. Se buscan materiales metálicos con una baja función de trabajo. El SEM (del inglés Scanning Electron Microscopy) se introdujo en Desde el punto de vista biológico su principal ventaja es que permite obtener una imagen tridimensional (hasta entonces los análisis ópticos se realizaban sobre secciones y carecían por tanto de perspectiva). Además del incremento de profundidad de campo se obtiene simultáneamente un notable aumento de la resolución Δ. Δ= 1 nm Figura 80. Bacterias vistas por un SEM.

73 Antecedentes Los primeros instrumentos desarrollados para este propósito, fueron microscopios ópticos, porque con el ojo humano es imposible visualizar. Estos instrumentos fueron desde una simple lupa, hasta un microscopio compuesto. Sin embargo, aún en el mejor instrumento óptico, la resolución está limitada a la longitud de onda de la luz que se utilice, que en este caso es la luz violeta, cuya longitud de onda es de aproximadamente 400 nanómetros; por lo tanto, los detalles más pequeños que pueden resolverse, deberán estar separados no menos de esta longitud. En términos de amplificación, esto quiere decir que no podemos amplificar más de 1,000 veces. Una salida inmediata a esta limitante de resolución, es utilizar alguna radiación de longitud de onda más corta que la de la luz violeta. Los candidatos inmediatos son los rayos X, que se caracterizan por una longitud de onda del orden de 0.15 nanómetros; desafortunadamente éstos tienen la gran desventaja de ser absorbidos rápidamente por lentes de vidrio y de no poder ser desviados por lentes magnéticas. Otra posibilidad es aprovechar el comportamiento ondulatorio de los electrones acelerados por alguna diferencia de potencial. Sea el caso, por ejemplo, de electrones acelerados en un campo de 100,000 voltios que presentan comportamiento ondulatorio con una longitud de onda de nm, lo que en principio permitiría tener un aparato que resolviera detalles del mismo orden, lo cual es más de lo que se necesita para resolver detalles atómicos, puesto que los átomos en un sólido están separados en un orden de 0.2 nm. Sin embargo, en la práctica, detalles inherentes a la técnica de observación, o defectos en el maquinado de las piezas polares producen aberraciones Funcionamiento En el microscopio electrónico de barrido es necesario acelerar los electrones en un campo eléctrico, para aprovechar de esta manera su comportamiento ondulatorio, lo cual se lleva a cabo en la columna del microscopio, donde se aceleran por una diferencia de potencial de 1,000 a 30,000 voltios. Los electrones acelerados por un voltaje pequeño son utilizados para muestras muy sensibles, como podrían ser las muestras biológicas sin preparación adicional, o muestras muy aislantes. Los altos voltajes se utilizan para muestras metálicas, ya que éstas en general no sufren daños como las biológicas, y de esta manera se aprovecha la menor longitud de onda para tener una mejor resolución. Los electrones

74 acelerados salen del cañón, y son enfocados por la lente condensadora y objetiva, cuya función es reducir la imagen del filamento, de manera que incida en la muestra un haz de electrones lo más pequeño posible (para así tener una mejor resolución). Con las bobinas deflectoras se barre este fino haz de electrones sobre la muestra, punto por punto y línea por línea. Cuando el haz incide sobre la muestra, se producen muchas interacciones entre los electrones del mismo haz, y los átomos de la muestra; puede haber por ejemplo, electrones rebotados como las bolas de billar. Por otra parte, la energía que pierden los electrones al "Chocar" contra la muestra puede hacer que otros electrones salgan despedidos (electrones secundarios), y producir rayos X, electrones Auger, etc. El más común de éstos es el que detecta electrones secundarios, y es con el que se hacen la mayoría de las imágenes de microscopios de barrido. Podemos también adquirir la señal de Rayos X que se produce cuando se desprenden estos mismos de la muestra, y posteriormente hacer un análisis espectrográfico de la composición de la muestra.

75 Lección 27: Instrumentación y aplicaciones de la microscopía SEM Un SEM consta de una columna que integra un sistema de producción de electrones y una serie de lentes electromagnéticas (condensador, barrido y objetivo) que conforman un haz de electrones focalizado incidente sobre la muestra. Los electrones incidentes inducen electrones secundarios y electrones retrodispersados en la muestra. La topografía y composición de la muestra inducen un gradiente de emisión que es detectado por un sistema analizador (Trampa de Faraday+placa fotográfica o cámara CCD). Figura 81. Instrumentación de la Microscopía electrónica de barrido electrónico La región activada tiene forma de pera y solo los electrones más superficiales (secundarios) consiguen escapar de la muestra (la energía restante se disipa mediante rayos X y un incremento de T). Los electrones retrodispersados son mucho más energéticos y proceden de lugares más profundos de la muestra. Salvo excepciones, no son atrapados por la trampa de Faraday (no forman la imagen).

76 Formación de la imagen La trampa de Faraday atrapa electrones en sincronía con el barrido. Los electrones escapan de la superficie en función de la topografía (escape favorecido en las cumbres y absorción en los valles) dando lugar al contraste. La focalización del haz permite definir la resolución y la profundidad de campo. El voltaje de aceleración de los electrones puede regularse para contrarrestar el efecto del número atómico (Z) y optimizar la dimensión del volumen de excitación. Las aplicaciones del microscopio electrónico de barrido son muy variadas, y van desde la industria petroquímica o la metalurgia hasta la medicina forense. Sus análisis proporcionan datos como textura, tamaño y forma de la muestra. Entre las áreas de aplicación de esta técnica, se pueden mencionar: Geología Investigaciones geomineras, cristalográficas, mineralógicas y petrológicas. Estudio morfológico y estructural de las muestras Estudio de materiales Caracterización microestructural de materiales. Identificación, análisis de fases cristalinas y transiciones de fases en diversos materiales tales como metales, cerámicos, materiales compuestos, semiconductores, polímeros y minerales. Composición de superficies y tamaño de grano. Valoración del deterioro de

77 materiales, determinación del grado de cristalinidad y presencia de defectos. Identificación del tipo de degradación: fatiga, corrosión, fragilización, etc Metalurgia Control de calidad y estudio de fatiga de materiales, características texturales. Análisis de fractura (fractomecánica) en materiales (Ver Figura 83), un ejemplo concreto de este tipo de aplicación se expone en la parte de trabajo práctico. Figura 82. Imagen de la rotura de una varilla de acero obtenida mediante un Microscopio Electrónico de Barrido Odontología En este campo son muchas las aplicaciones de las caracterizaciones morfológicas que se pueden realizar con el microscopio electrónico de barrido. Una aplicación específica de este microscopio se obtiene al estudiar la direccionalidad de las varillas del esmalte dental. El esmalte dental posee varias fases de formación, en las cuales se van depositando elementos minerales que llegan al lugar por los vasos sanguíneos circundantes, produciéndose la mineralización total en la última fase de su formación. En esta etapa se forman cristales, que al depositarse toman una disposición en todo el tejido formado, creando las varillas del esmalte, estructura principalmente inorgánica (98%), adquiriendo una disposición muy particular de acuerdo al sector que se estudie de

78 la pieza dentaría. Estas varillas son observadas con un microscopio electrónico de barrido, notando que estas se disponen en diferentes direcciones con un sólo sentido desde él limite amelodentinario a la superficie, entrecruzándose en las cúspides y en ciertos sectores de las caras libres y proximales, lo que se denomina multidireccionalidad de las varillas. Para ello se extraen piezas dentarías humanas (con indicación quirúrgica), las que son metalizadas con oropaladio y luego son estudiadas en el SEM. De este modo se puede observar la disposición de las varillas, analizar los cambios de direcciones en el espesor del esmalte y comparar la disposición en los distintos sectores del esmalte (oclusal, 1/3 medio y 1/3 cervical). Además se pueden analizar a través del SEM las alteraciones que producen los ácidos producidos por la entrada de microorganismos y restos alimenticios en las superficies vestibulares de los dientes anteriores, ya que sobre ellos se produce la retención de los materiales odontológicos en fracturas, fisuras, ferulizaciones, etc. La entrada de los microorganismos se produce, ya que para la retención del material de restauración, desde los comienzos de la odontología, se han realizado tallados en forma de retención mecánica en las piezas dentarias, formándose estos en la interfase restauración-diente Control de Calidad En este campo, el microscopio electrónico de barrido es de gran utilidad para el seguimiento morfológico de procesos y su aplicación en el control de calidad de productos de uso y consumo.

79 Lección 28: Microscopia Electrónica de Transmisión (TEM) El TEM (Transmission Electron Microscopy) se introdujo en sucesivas etapas durante los años En esta configuración los electrones atraviesan la muestra, que debe ser lo más delgada posible. Aunque la exposición electrónica es en principio destructiva de la materia orgánica, los sistemas criogénicos avanzados han permitido aprovechar las ventajas resolutivas del TEM en estructuras biológicas. Δ= 0.05 nm. El TEM es un instrumento que aprovecha los fenómenos físico-atómicos que se producen cuando un haz de electrones suficientemente acelerado colisiona con una muestra delgada convenientemente preparada. Cuando los electrones colisionan con la muestra, en función de su grosor y del tipo de átomos que la forman, parte de ellos son dispersados selectivamente, es decir, hay una gradación entre los electrones que la atraviesan directamente y los que son totalmente desviados. Todos ellos son conducidos y modulados por unas lentes para formar una imagen final sobre una CCD que puede tener miles de aumentos con una definición inalcanzable para cualquier otro instrumento. La información que se obtiene es una imagen con distintas intensidades de gris que se corresponden al grado de dispersión de los electrones incidentes. La imagen del TEM tal como se ha descrito ofrece información sobre la estructura de la muestra, tanto si ésta es amorfa o cristalina. Figura 83. Microscopio electrónico de transmisión

80 Además, si la muestra es cristalina, es decir, hay una estructura de planos periódica, puede ocurrir que varias familias de esos planos cumplan la condición de Bragg y difracten de forma coherente la onda electrónica incidente. Esto da lugar a un diagrama de difracción, que es una imagen de distintos puntos ordenados respecto a un punto central (electrones transmitidos no desviados) que nos aportan información sobre la orientación y estructura del/los cristales presentes. Una muestra de la capacidad resolutiva viene dada por la capacidad de aumento de la imagen. Ecuación 2.26 La profundidad de campo es suficientemente grande como para que la muestra atravesada por los electrones se proyecte en la pantalla fluorescente o incluso en una cámara CCD inferior. Figura 84. Esquema instrumental de un TEM. Cañón y lentes electromagnéticas de condensador, objetivo y proyector.

81 El microscopio TEM es un instrumento relativista. Los electrones son acelerados en campos de hasta 500 kv. En esas condiciones el electrón se comporta dualmente como onda y corpúsculo con una relación directa entre su momento y su longitud de onda (DeBroglie). Las limitaciones instrumentales hacen que en realidad la resolución experimental esté limitada a 1 A aproximadamente. El aspecto relevante de esta longitud de onda es que, como los Rayos X, permite obtener información sobre la estructura de la materia, incluso a nivel atómico Instrumentación Cañón electrónico El tipo más usado de cañón electrónico consiste de un filamento de alambre de tungsteno (10) doblado en forma de V. El electrodo de control se denomina cilindro de Wehndt, y tiene una apertura circular de 1 a 3 mm de diámetro centrada en el ápice del filamento. La superficie cóncava hace las funciones de ánodo, y utilizando una superficie convexa la imagen de la fuente electrónica puede reducirse en tamaño respecto al electrodo cóncavo. La intensidad total del haz de cátodo a ánodo puede ser de 10 a 400 microamperios, pero solamente una pequeña fracción die éste llega hasta la muestra.

82 Condensadores Los dos condensadores son capaces de dar una amplia gama de intensidad ajustando el cañón electrónico. Esto reduce el área iluminada en la muestra. Sin embargo, otras partes de la muestra también sufren los efectos del haz electrónico. El primer condensador reduce la imagen de la fuente mientras que el segundo condensador obtiene la adecuada intensidad de iluminación Plataforma para la colocación de la muestra La plataforma para colocar la muestra está situada en frente del objetivo. Se introduce la muestra en la columna del microscopio a través de una abertura Objetivo El objetivo es la lente más importante en el microscopio electrónico. La distancia focal de esta lente está comprendida entre 1 y 5 milímetros, siendo 1,1mm la más frecuente. Cuanto menor es la distancia focal, mayor es la resolución. Debido a que el haz de imagen tiene la máxima apertura angular en el primer objetivo, esta lente controla la calidad de la imagen producida. Se puede corregir la aberración esférica usando un "stigmator", que es un dispositivo que permite introducir metal para compensar la inhomogeneidad inherente de la lente, y obtener elevada resolución. Otro accesorio importante, permite regular la apertura del objetivo, la cual limita la dispersión de los electrones, evitando así la degradación de la imagen. Esta apertura mejora el contraste siendo 20 y 40 micrómetros (pm) los más frecuentes Lente intermedia La lente intermedia puede aumentar o disminuir la imagen. Se puede conseguir esto, aumentando o disminuyendo la potencia de la corriente a esta lente Lente de proyección La lente (de proyección corresponde al ocular del microscopio óptico. Su función es la de proyectar la imagen real sobre la pantalla fluorescente, y permite una amplia gama de aumentos. Se puede variar la ampliación de 100 X hasta X usando lentes intermedias y de proyección.

83 Cámara de observación La cámara de observación y la pantalla fluorescente están situadas en el fondo de la columna. La imagen se enfoca sobre un punto marcado y el enfoque fino se consigue con unos binoculares de 6 y 20 X. El diámetro del punto de enfoque es de 100 µm, por lo tanto la imagen debe ser mayor que este diámetro para ser resuelta. La cámara de observación está protegida por un vidrio grueso de plomo para evitar la emisión de rayos X Cámara fotográfica La cámara fotográfica está situada debajo de la pantalla fluorescente. La pantalla fluorescente está sujetada por m lado, y al quitar el paso del haz electrónico la imagen se centra sobre la película fotográfica. Se pueden usar varios tipos de películas y placas de vidrio Modos de formación de la imagen Existen diferentes modos de formación de la imagen en un microscopio de transmisión: si la imagen se forma a partir del haz transmitido, que no ha sufrido dispersión, entonces la imagen del objeto es oscura sobre un fondo brillante. Si, por el contrario, se utilizan los electrones dispersados en este caso la imagen aparece brillante sobre un fondo oscuro. Por ello estas dos técnicas se denominan formación de imagen en campo claro y en campo oscuro respectivamente, la primera es la más utilizada. Figura 85. Formación de la imagen.

84 Por otra parte con este microscopio se puede obtener un diagrama de difracción de la muestra, lo que nos aporta una valiosa información sobre la estructura cristalina de la misma. Esto es posible si hacemos incidir el haz de electrones sobre un cristal con un ángulo capaz de satisfacer la ley de Bragg para una determinada distancia entre planos atómicos d hkl. Ya que la longitud de onda de los electrones es muy pequeña ese ángulo también lo es por lo que el haz debe incidir prácticamente paralelo a los planos reticulares. El diagrama de difracción está formado por los puntos de corte de los haces difractados y transmitido con el plano de la pantalla. Representa, por tanto, la sección de la red recíproca del cristal en el plano normal al haz de electrones. Figura 86. Proceso de formación del diagrama de difracción La posibilidad de combinar la difracción de electrones con los distintos modos de formación de la imagen hace del microscopio de transmisión una de la mejores herramientas en el estudio de la red cristalina y sus defectos.