USE OF A BACTERIAL BIOPREPARED TO STIMULATE THE SEEDS GERMINATION AND THE VEGETATIVE GROWTH OF RICE (Oryza sativa) AND CORN (Zea mays).

Transcripción

1 APLICACIÓN DE UN BIOPREPARADO DE ORIGEN BACTERIANO PARA ESTIMULAR LA GERMINACIÓN DE LAS SEMILLAS Y EL CRECIMIENTO VEGETAL EN LOS CULTIVOS DEL ARROZ (Oryza sativa) YEL MAÍZ (Zea mays). Annia Hernández 1, Mayra Heydrich 1, Narovis Rives 2, Yanelis Acebo 1, Ana N. Hernández 3, B. Diallo 4, M. El Jaziri 4 1. Facultad de Biología. Universidad de La Habana. Cuba 2. Instituto de Investigaciones del Arroz 3. Centro de Desarrollo de Productos Bióticos. Morelos. México 4. Universidad Libre de Bruselas. Bélgica. RESUMEN Las bacterias promotoras del crecimiento vegetal (PGPB) han sido aplicadas en un amplio rango de cultivos incrementando la productividad de las plantas. Este trabajo tiene como objetivo la caracterización cromatográfica y biológica de un biopreparado de origen bacteriano a partir de una cepa autóctona de Burkholderia sp, y su aplicación en los cultivos del arroz y del maíz. El biopreparado fue caracterizado integralmente mediante métodos colorimétricos y cromatográficos, utilizándose columnas de Sephadex LH20, placas de cromatografía de capa fina y cromatografía liquida de alta resolución. Se desarrollaron experimentos de interacción planta-bacteria in vitro (medio MS), en los cultivos del arroz y maíz, para conocer su efecto en la promoción del crecimiento vegetal. Los resultados mostraron que el biopreparado estimula la germinación y el crecimiento de los cultivos del arroz y el maíz (altura de la planta, peso fresco aéreo y de raíz y largo de la raíz), con efectos similares a los producidos por el AIA. Se demostró la presencia de AIA, AS y otros metabolitos bacterianos con actividad biológica que pudieran estar involucrados en los efectos beneficiosos obtenidos. Los resultados tienen importancia práctica y demuestran las potencialidades de las PGPB al interactuar con los cultivos del arroz y el maíz. Palabras claves: arroz, maíz, PGPB, Burkholderia sp. USE OF A BACTERIAL BIOPREPARED TO STIMULATE THE SEEDS GERMINATION AND THE VEGETATIVE GROWTH OF RICE (Oryza sativa) AND CORN (Zea mays). ABSTRACT Plant Growth Promoting Bacteria (PGPB) have been used in several crops to increase plant yield. This study is aimed to characterise chromatographically and biologically a bioproduct obtained from and autochthonous Cuban Burkholderia sp. strain and to evaluate its application to maize and rice crops. The bioproduct was integrally characterised through colorimetric and chromatographic methods, using Sephadex L20 columns, Thin Layer Chromatography and High Performance Liquid Chromatography. The strains plant growth promoting abilities in maize and rice were tested through in vitro bioassays in MS medium. The results showed that the bioproduct was able to stimulate seed germination and plant growth (plant height, root and shoot fresh weight and root length) in maize and rice, with 26

2 similar effects to those of synthetic IAA. It was proved the presence of IAA, SA and other metabolites with biological activity in the bioproduct, which could be involved in its beneficial effects. These results have practical relevance and show the potentialities of PGPB when interacting with rice and maize crops. Key words: rice, maize, PGPB, Burkholderia sp. INTRODUCCIÓN La importancia de los cereales en la nutrición de millones de personas de todo el mundo es ampliamente reconocida. En la agricultura de América Latina, el arroz y el maíz ocupan una posición destacada, destinándose principalmente al consumo humano, aunque son utilizados también como materia prima para la elaboración de alcohol, glucosa, ácido acético, acetona, aceite, productos farmacéuticos, combustibles, abonos y alimentos de consumo animal (Arregocés y González, 2005). La producción de cereales se enfrenta a graves limitaciones, entre las que se encuentran una tasa descendente de crecimiento de las cosechas, la escasez de mano de obra, los conflictos basados en el género, las limitaciones institucionales y la contaminación medioambiental. Problemas que favorecen al hambre creciente, la pobreza y a la malnutrición de buena parte de la Humanidad, por ello se reclama una acción conjunta por parte de todos los agricultores del mundo. (Infoarroz, 2007) Una de las alternativas más prometedoras dentro del contexto agrícola mundial, lo constituye el uso de biopreparados a partir de microorganismos, utilizándose diferentes grupos microbianos para estos fines. Entre ellos, las bacterias promotoras del crecimiento vegetal (PGPB) se destacan por sus efectos beneficiosos tanto para las plantas como para los ecosistemas. El efecto beneficioso de las PGPB se manifiesta a través de diferentes mecanismos de acción, entre los que se destacan el aumento en la toma de agua y nutrientes por la planta, la producción de fitohormonas y el control biológico de patógenos, dado fundamentalmente por la producción de sideróforos, la antibiosis y la inducción de resistencia en los cultivos contra un amplio espectro de plagas y enfermedades. (Rives et al., 2007) Teniendo en cuenta lo anteriormente planteado, en este trabajo nos trazamos como objetivo la caracterización cromatográfica y biológica de un biopreparado de origen bacteriano en los cultivos del arroz y del maíz. Cultivos microbianos: Se utilizó una cepa autóctona de Burkholderia sp., previamente aislada de la rizosfera del cultivo del maíz variedad Francisco mejorado en el año 2002 (Hernández, 2002). La misma se encontraba conservada en Caldo LB (DUCHEFA BIOCHEME) con glicerol al 40%, a -20 o C. Material vegetal: Se utilizaron semillas de arroz (Oryza sativa) de la variedad J-104 y maíz (Zea mays) de la variedad Francisco mejorado, colectadas en Cuba y conservadas a 4 C. 27

3 Para la desinfección, las semillas fueron sumergidas durante 5 minutos en una solución de Tween 80 (500 µl/200ml). Posteriormente se colocaron un minuto en etanol al 70% y 20 minutos en solución de hipoclorito de calcio al 5% con Tween 80 (500 µl/200ml), la que fue preparada según metodología descrita por Hernández et al. en el año Finalmente se realizaron cuatro lavados sucesivos con agua destilada estéril (2 minutos por lavado) y se conservaron en cámaras húmedas para su posterior utilización. Bioensayos de interacción planta-microorganismo: Las semillas previamente desinfectadas se sumergieron durante 45 minutos en las soluciones que constituían los tratamientos. Las semillas tratadas fueron colocadas en cámaras húmedas e incubadas a 37 o C. Después de 16, 24, 48 y 72 horas las semillas germinadas fueron contadas. Se colocaron 20 semillas por placa y 5 placas por tratamiento. Los experimentos fueron repetidos 3 veces. Para conocer el efecto de las soluciones microbianas sobre la estimulación del crecimiento vegetal en los cultivos en estudio, semillas de arroz y maíz previamente desinfectadas y germinadas fueron colocadas en medio Murashige and Skoog (MS) durante 12 días. Posteriormente se extrajeron las plantas y se realizaron las siguientes determinaciones: altura de la planta (cm), masa fresca aérea y de raíz (g), diámetro del tallo (mm), número de hojas por planta y largo de la raíz principal (cm). Análisis cromatográfico: Se utilizaron columnas de Sephadex LH20. Los metabolitos producidos por la cepa seleccionada, previamente concentrados mediante liofilización, se disolvieron en 10 ml de agua Milli Q. Se utilizó agua, la mezcla agua-metanol y acetona para eluir las muestras. Las fracciones colectadas fueron liofilizadas, redisueltas en 2 ml de agua mili Q y analizadas mediante cromatografía de Silica Gel G, utilizando acetato de etilo/ isopropanol/agua como sistema de solventes (45:35:20, vol/vol) y el reactivo de Salkowski como revelador. Para cuantificar los metabolitos de tipo sideróforos se utilizó el medio Caldo Casimino Ácido (CAA). La extracción y cuantificación de ácido salicílico se realizó mediante la detección del complejo púrpura formado por la unión del hierro y el AS, utilizándose el mismo medio de cultivo y condiciones de incubación que se describe para los sideróforos. Se determinó la actividad biológica de las fracciones a través de la determinación de su efecto sobre la germinación de las semillas de los cultivos en estudio, como se describe previamente. Las fracciones activas fueron analizadas mediante cromatografía liquida de alta resolución (HPLC), según metodología descrita por Hernández et al. (2008). Análisis biométricos: Los porcentajes de germinación fueron analizados usando la prueba no paramétrica de Kruskal Wallis seguido de la prueba de comparación múltiple de medias no paramétrica de Student-Newman-Keuls (SNK). Los parámetros de crecimiento de las plantas se analizaron mediante un diseño completamente aleatorizado, las medias fueron comparadas mediante SNK paramétrico. Todas las pruebas estadísticas realizadas están contenidas en el paquete estadístico Statistica

4 RESULTADOS Estimulación del crecimiento vegetal En este estudio se demostró que el biopreparado empleado estimula el crecimiento de las plantas de arroz y maíz de 5 días de edad, destacándose por los mejores resultados los tratamientos con el biopreparado diluido al 40% y 30% (Figuras 1 y 2). 29

5 Los cromatogramas indican que las fracciones 17, 19, 21 y 22 contienen AIA y las fracciones 12, 13, 14, 15, 16 y 17 AS. Estos resultados demuestran la presencia de AIA y AS en los metabolitos bacterianos, los que son reguladores del crecimiento de las plantas y podrían estar involucrados en la actividad estimuladora del crecimiento y biocontroladora de patógenos asociados al cultivo. Los análisis mediante HPLC confirman que la cepa en estudio produce AIA (Figura 3) y AS y demuestran la existencia de otros metabolitos que promueven el crecimiento de las plantas, como los sidéforos. Figura 3. Caracterización cromatográfica de las fracciones activas del biopreparado. Actividad biológica de las fracciones Los bioensayos demostraron que en los productos del metabolismo de la bacteria en estudio existen varias fracciones con actividad biológica. Entre estas fracciones activas se destacan algunas que no contienen metabolitos del tipo AIA, lo que indica que además de esta auxina, existen otros metabolitos responsables de la actividad biológica que se observan en los cultivos del arroz y el maíz. Es de destacar que todos los tratamientos mostraron diferencias significativas con el control durante los primeros periodos de tiempo evaluados, comportamiento que no ocurrió en la última evaluación, donde no se mostraron diferencias significativas entre las semillas inoculadas y el control. 30

6 Tabla 1. Actividad biológica de las fracciones del bioproducto. Tratamientos Porcentaje de germinación en arroz Porcentaje de germinación en maíz 24 horas 40 horas 72 horas 16 horas 24 horas 40 horas CONTROL 0 d 33.3 c 100 a 0 d 0 g 100 a BIOPREPARADO 11.1 c 77.7 b 100 a 22.2 b 44.4 c 100 a Fracción 1 0 d 22.2 d 77.8 c 0 d 0 f 91 b Fracción 2 0 d 44.4 c 91 ab 0 d 0 f 100 a Fracción 3 0 d 0 e 100 a 0 d 0 f 77.8 c Fracción 4 0 d 0 e 100 a 0 d 0 f 77.8 c Fracción 5 0 d 0 e 100 a 0 d 0 f 100 a Fracción 6 0 d 0 e 100 a 0 d 0 f 100 a Fracción 7 0 d 0 e 100 a 0 d 0 f 88.9 b Fracción 8 0 d 33.3 c 100 a 0 d 0 f 100 a Fracción 9 0 d 66.6 b 100 a 0 d 0 f 100 a Fracción 10 0 d 44.4 c 100 a 0 d 11.1 f 100 a Fracción c 44.4 c 100 a 0 d 11.1 f 100 a Fracción 12 0d 44.4 c 100 a 0 d 11.1 f 100 a Fracción c 77.7 b 100 a 33.3 a 55.5 b 100 a Fracción 14 0 d 55.5 c 100 a 11.1 a 55.5 b 100 a Fracción 15 0 d 66.6 c 100 a 11.1 a 66.6 b 100 a Fracción 16 0 d 44.4 c 100 a 0 d 11.1 f 100 a Fracción c 55.5 c 100 a 11.1 c 33.3 d 100 a Fracción 18 0 d 55.5 c 100 a 0 d 22.2 e 100 a Fracción 19 0 d 55.5 c 100 a 0 d 11.1 f 100 a Fracción 20 0 d 66.6 b 100 a 0 d 33.3 d 100 a Fracción c 77.7 b 100 a 33.3 a 55.5 b 100 a Fracción a 88.8 a 100 a 33.3 a 66.6 a 100 a Fracción 23 0 d 33.3 c 100 a 11.1 c 33.3 d 100 a Fracción 24 0 d 33.3 c 100 a 0 d 22.2 e 100 a Fracción 25 0 d 66.6 b 100 a 0 d 33.3 d 100 a Fracción c 44.4 c 100 a 11.1 c 44.4 c 100 a Fracción 27 0 d 22.2 d 88.9 b 0 d 33.3 d 100 a Fracción 28 0 d 44.4 c 100 a 0 d 11.1 f 100 a Fracción a 88.8 a 100 a 33.3 a 77.7 a 100 a Fracción b 55.5 c 100 a 22.2 b 55.5 b 100 a CONCLUSIONES El biopreparado estimula la germinación y el crecimiento vegetal en los cultivos del arroz y el maíz, obteniéndose la mayor factibilidad biológica cuando es diluido al 40% y 30%. 31

7 Entre los principales componentes del biopreparado se destacan las auxinas (fracciones 17, 18, 19, 20, 21 y 22), los sideróforos (25, 26, 27, 33 y 34) y el ácido salicílico (13, 14, 15, 16 y 17). La actividad biológica no se debe solamente al ácido indolacético, existen otros metabolitos que podrían estar involucrados en los resultados obtenidos in vivo. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS 1. InfoArroz (2007). Informativo mensual del mercado mundial del arroz, Julio n Arregocés, O.; Rosero, M. y González, J. (2005). GUÍA DE ESTUDIO Morfología de la Planta de Arroz. Publicaciones Centro Internacional de Agricultura Tropical CIAT, Cali, Colombia. 3. Rives, R. N., Acebo, G. Y., Hernández, R.A. (2007). Bacterias promotoras del crecimiento vegetal en el cultivo del arroz (Oryza sativa L.). Perspectivas de su uso en Cuba. Cultivos Tropicales. 28(2): Hernández, A. (2002). Obtención de un bioestimulador del crecimiento vegetal a partir de rizobacterias asociadas al cultivo del maíz (Zea mays L). Tesis para optar al grado de Doctor en Ciencias Biológicas. Facultad de Biología. Universidad de La Habana. 91p. 5. Hernández, A., M. Heydrich, Y. Acebo, M. G. Velazquez, A. N. Hernández. Antagonistic activity of Cuban native rhizobacteria against Fusarium verticillioides (Sacc.) Nirenb. In maize (Zea mays L.). Applied Soil Ecology 39 (2008)