Vidal C., 2,3 Portu A., 2,4 Saint Martin G. Resumen

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1 DESARROLLO DE UN SISTEMA INFORMÁTICO INTEGRAL PARA EL ANÁLISIS DE MUESTRAS HISTOLÓGICAS AUTORRADIOGRÁFICAS EN EL MARCO DE LA TERAPIA POR CAPTURA NEUTRÓNICA EN BORO 1 Vidal C., 2,3 Portu A., 2,4 Saint Martin G. 1 Facultad de Ingeniería, Universidad Favaloro 2 Comisión Nacional de Energía Atómica (CNEA). 3 Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas (CONICET). 4 Instituto Jorge Sábato, Universidad Nacional de San Martín portu@cnea.gov.ar Resumen La distribución de boro en muestras biológicas provenientes de protocolos de BNCT (Terapia por Captura Neutrónica de Boro) puede determinarse a través del análisis de imágenes autorradiográficas formadas a partir de trazas nucleares en detectores poliméricos. En base a este método se desarrolló el programa BNCT-AR que permite estimar de manera fácil y rápida la concentración de Boro en una determinada región de interés de un tejido evaluando los niveles de gris de la imagen autorradiográfica generada a partir de un corte histológico, por comparación directa con la imagen histológica correspondiente. El programa permite obtener valores de concentración de boro estimativos con incertezas menores al 30% en los rangos de mayor concentración en un tiempo del orden de 15 minutos. Además, gestiona el almacenamiento de los estudios generados en una base de datos desarrollada con tal fin. Esto lo convierte en una excelente herramienta para evaluar rápidamente las muestras, que eventualmente podrán luego ser medidas por el método cuantitativo en los casos que así lo requieran. La versatilidad del software permitirá a futuro extender la aplicación a nuevas condiciones de procesado de la muestra y a nuevas aplicaciones. 1

2 BNCT-AR : SOFTWARE DEVELOPMENT FOR THE ANALYSIS OF HISOLOGICAL AND AUTORADIOGRAPHIC IMAGES FROM NEUTRON CAPTURE THERAPY PROTOCOLS 1 Vidal C., 2,3 Portu A., 2,4 Saint Martin G. 1 Facultad de Ingeniería, Universidad Favaloro 2 Comisión Nacional de Energía Atómica (CNEA). 3 Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas (CONICET). 4 Instituto Jorge Sábato, Universidad Nacional de San Martín portu@cnea.gov.ar Abstract Boron distribution in biological samples from BNCT (Boron Neutron Capture Therapy) protocols can be determined by analyzing the autoradiographic images produced on polimeric nuclear track detectors. Based on this method, a software program (called BNCT-AR) was developed to estimate the distribution and concentration of boron in a given region of interest of the studied tissue. The program evaluates the grey levels of the autoradiographic image formed by nuclear tracks produced by particles coming from a histological section, making a direct comparison with the corresponding histological picture. In this way the boron distribution can be estimated. BNCT-AR can estimate boron concentration values very quickly (about 15 minutes) with uncertainties lower than 30% (measurements in the high concentration range can reach this uncertainty level). Besides, it manages the storage of generated studies in a database developed for this purpose. These features make it an excellent tool for a rapid evaluation of the samples, which eventually can be thoroughly measured by the quantitative method if it is necessary. The versatility of the software enables future applications to new conditions of sample processing and different samples and procedures. 2

3 Introducción Actualmente, una de las técnicas utilizadas para determinar cualitativa y cuantitativamente la distribución de boro es la autorradiografía neutrónica en detectores de trazas nucleares (NTD). Cuando partículas ionizantes penetran en un NTD, se forman zonas dañadas a lo largo de las trayectorias de los iones, o trazas latentes. Estas trazas pueden ser amplificadas mediante un ataque químico apropiado para poder ser visualizadas mediante microscopía óptica o electrónica (Fleischer y col., 1975). Si los proyectiles provienen del corte histológico de muestras biológicas provenientes de protocolos de BNCT (Terapia por Captura Neutrónica de Boro), que se ha puesto en contacto con el detector, el estudio de las imágenes autorradiográficas obtenidas permitirá determinar la distribución espacial de los elementos emisores de dichas partículas (en este caso, B-10), que puedan estar presentes en el tejido. Más aún, la concentración de B-10 en muestras de tejido puede determinarse midiendo la densidad de trazas en el detector, siempre que se cuente con curvas de calibración construidas con patrones de referencia (Durrani & Bull, 1984). Previo a someter el detector al ataque químico, la muestra biológica se explora a fin de delimitar las regiones de interés (ROI). Luego, en el proceso de revelado de las trazas nucleares se pierde la muestra biológica. En nuestro laboratorio se ha desarrollado una técnica de autorradiografía cuantitativa para la medición del valor de concentración por conteo de las trazas nucleares (Portu y col., 2011a). Esta técnica requiere la utilización de un sistema de referencias para correlacionar espacialmente la imagen histológica y su autorradiografía. Este co-registro entre las imágenes requiere múltiples etapas de procesamiento a partir de diferentes programas independientes, con el objetivo de poder comparar en forma cualitativa la imagen histológica y su autorradiográfica correspondiente. Cuando se busca conocer en forma cuantitativa la concentración de B-10 dentro de las ROI delimitadas en las imágenes previamente co-registradas, es necesario volver a evaluar la imagen autorradiografica utilizando alta magnificación (40X) dentro de la zona de interés con el fin de realizar el conteo de eventos individuales (autorradiografía cuantitativa, AQT). En estos casos, si la densidad de trazas en el NTD es considerable, el detector entra en un régimen de saturación en el cual el conteo de eventos individuales se dificulta por la superposición de los mismos. En estos casos es conveniente utilizar un método que aproveche el efecto óptico colectivo producido por las trazas en el detector. En estas condiciones la opacidad de la folia luego del ataque químico se hace apreciable a simple vista, sugiriendo la posibilidad de evaluar la densidad de trazas nucleares a través de la medición de la densidad óptica (DO) del material. Experiencias preliminares utilizando este método (Portu y col., 2011b) demostraron dificultades para la reproducibilidad de la experiencia y la implementación rutinaria de esta técnica. En este trabajo se desarrolló el software BNCT-AR que permite estimar fácil y rápidamente la concentración de Boro en una determinada región de un tejido, evaluando los niveles de gris en imágenes autorradiográficas generadas a partir de un corte histológico, y el análisis de la distribución de boro en la muestra, por comparación directa con la imagen histológica correspondiente. 3

4 Materiales y Métodos El programa se desarrolló en el lenguaje C# en el entorno de desarrollo interactivo (IDE) Microsoft Visual Studio Consiste en una interfaz gráfica vinculada a una base de datos relacional y permite generar un estudio, almacenando datos del experimento (características de la muestra, condiciones de irradiación y procesado de muestras, entre otros). Las imágenes y la información se almacena en la base de datos, que es completamente transparente al usuario. El programa BNCT-AR está formado por un grupo de espacios de trabajo como se detalla en la Figura 1, que se denominan formularios. Cada formulario permite al usuario interactuar con el programa. Figura 1 - Cuadro en Bloques representando los principales formularios del programa BNCT-AR. El formulario principal se denomina Main-BNCT y desde allí se puede acceder a cuatro formularios que dan herramientas y funciones diferentes al usuario. Éstos son: - Acceso Base Datos, que permite al usuario modificar los parámetros guardados en la base de datos, las condiciones generales en que se realizan los estudios autorradiagráficos y buscar estudios existentes previamente generados. - Corrección Luz es una herramienta complementaria que permite corregir los posibles defectos generados sobre la imagen autorradiagrafica por la iluminación no uniforme del microscopio. - Curva Calibración permite al usuario generar una curva de calibración entre la tonalidad de gris de la imagen y la concentración de B-10 mediante imágenes de muestras Patrón (muestras de Lexan que tengan una distribución uniforme de una concentración conocida de B-10). - Por último, Generar Estudio lleva a una secuencia de tres formularios (Figura 2) que permiten al usuario completar todo el proceso desde la carga de las imágenes de interés (Edición), el análisis, comparación y cuantificación de las diferentes ROIs (Análisis) hasta la generación del informe final (Informes) esquematizando todos los datos y resultados obtenidos en una versión apta para almacenar digitalmente e imprimir. Figura 2 - Diagrama del módulo Elaboración de Estudio representando el flujo de trabajo. 4

5 Por otra parte, el programa está vinculado a una base de datos que permite almacenar y gestionar de manera segura: imágenes, estudios con todos los datos pertinentes: características de la muestra, condiciones de irradiación y procesado de muestras. Las muestras de tejido analizadas provienen de un protocolo de carcinogénesis química de la bolsa de la mejilla del hámster (Kreimann y col., 2001). Los animales fueron infundidos con GB-10, luego de la normalización de vasos sanguíneos (Molinari y col., 2012). Se tomaron muestras de tumor, tejido premaligno y tejido sano (bolsa contralateral) de este modelo y se montaron sobre láminas de policarbonato de 250 µm, utilizadas como NTD. Luego, se irradiaron en la facilidad biomédica del reactor RA-3 (CAE) con dos fluencias diferentes: n.cm -2 para el método de conteo individual de trazas y n.cm -2 para un análisis en BNCT-AR. Para el ataque químico se utilizó solución PEW (30g KOH, 80g alcohol etílico y 90g agua destilada) a 70 o C. Se utilizaron tiempos de etching de 2 min para AQT y 4 min para BNCT-AR. Para tomar las imágenes, se utilizaron dos microscopios ópticos con sistema de adquisición digital: Olympus DP70 y Carl Zeiss MPM 800 (Lanais CNEA-CONICET). La posición original de la muestra en la platina se reprodujo luego del ataque químico. Para la validación del programa, se analizaron cortes consecutivos mediante el método de conteo individual de trazas y BNCT-AR procesando las muestras en las condiciones establecidas para cada método. Resultados y discusión En esta sección se presentan las diferentes etapas disponibles en el programa para la generación de un estudio cuantitativo por nivel de gris y los resultados comparativos obtenidos en el proceso de validación descripto en la sección previa. El primer paso para la generación de un nuevo estudio consiste en la carga de la imagen del tejido y de su respectiva autorradiografía, junto con los datos descriptivos de las imágenes y de la irradiación a la que fue sometida. El programa permite posteriormente editar esas imágenes dentro del espacio de trabajo Edición como se muestra en la Figura 3, visualizar ambas imágenes en paralelo y alinearlas para generar el co-registro espacial. La alineación puede llevarse a cabo mediante dos rutinas diferentes: alineación por puntos y por entornos, de acuerdo a las marcas de referencia utilizadas. 5

6 Figura 3 Vista del Espacio de Trabajo Edición. Al guardar los cambios, las imágenes editadas se almacenan en la base de datos en formato tiff y son cargadas automáticamente al espacio de trabajo Análisis, donde BNCT-AR permite delimitar ROIs en la imagen histológica. El programa genera máscaras que se superponen automáticamente en la autorradiografía. Sobre las ROIs delimitadas el programa calcula el nivel de gris promedio en la autorradiografía, como se muestra en Figura 4. Así, pueden calcularse cocientes entre el nivel de gris de diferentes regiones, permitiendo conocer las relaciones de acumulación de boro en las diferentes estructuras tisulares de interés. Figura 4 Vista del Espacio de Trabajo Análisis. Si el usuario ingresó en el módulo Curva Calibración las imágenes de muestras patrón y generó una curva de calibración, BNCT-AR permite convertir los niveles de gris promedio calculados en valores estimados de concentración de B-10 sobre las 6

7 nivel de gris escala invertida regiones delimitadas. Las curvas pueden ser de tipo lineal, cuadrática o puede ingresarse una calibración externa. Por último, es posible generar un informe conteniendo todos los resultados del análisis que quedará almacenado en la Base de Datos y al que podrá accederse en el futuro. En paralelo, el estudio generado con las ROIs delimitadas se almacena en la base de datos permitiendo su acceso y eventual modificación. Para comparar los resultados de concentración de B-10 dados por niveles de gris en BNCT-AR y los obtenidos por análisis de trazas cuantitativo (conteo individual de trazas), se realizó una curva de calibración lineal para BNCT-AR, como se observa en la Figura 5. Las muestras patrón son Small Lexan Cases (SLCs) (Portu col., 2011a): Láminas de Lexan en contacto con solución acuosa de ácido bórico 99.99% enriquecido en B-10.. Se utilizaron concentraciones conocidas de ácido bórico entre 0 y100 ppm). 180 NG=90*[B-10]+0,9 R 2 =0, Conc boro (ppm) Figura 5. Curva de calibración utilizada en BNCT-AR. En la Figura 6 se presentan los valores de concentración de boro obtenidos por ambos métodos, a partir de dos muestras consecutivas del mismo tejido, para 4 tejidos diferentes (normal, precanceroso, tumores 1 y 2) sobre los que se delimitaron diversas ROIs. Se grafica la recta unidad para ilustrar la correspondencia entre ambos métodos. 7

8 Figura 6 Comparativa entre los resultados obtenidos mediante el método implementado por BNCT-AR y AQT. Cuando se analizan los valores de concentración obtenidos por ambos métodos se observa una diferencia relativa entre éstos del orden del 10% para los valores absolutos hasta 20 ppm. Regiones con concentraciones de B-10 por encima de 20 ppm incrementan su diferencia relativa alcanzando una sobrestimación por el método BNCT- AR de hasta un 30%. Como se especificó inicialmente los valores calculados con el programa son de carácter estimativo, y permiten realizar la exploración y comparación de múltiples regiones dentro de un mismo corte de manera fácil, rápida (~15 minutos) y repetitiva. Conclusiones Se ha logrado desarrollar un programa interactivo, de uso rápido y sencillo, para la visualización simultánea de imágenes histológicas y autorradiograficas, la determinación de regiones de interés y la estimación de concentración de B-10 por nivel de gris en cada una de ellas. Esto lo convierte en una excelente herramienta para evaluar rápidamente las muestras, que eventualmente podrán luego ser medidas por el método cuantitativo en los casos que así lo requieran. La versatilidad del software permitirá a futuro extender su uso a nuevas condiciones de procesado de la muestra y a nuevas aplicaciones. Agradecimientos Agradecemos a la Lic. Silvia Thorp, el Lic. Emiliano Pozzi y la Srta. Paula Curotto por las irradiaciones de las muestras en la columna térmica del reactor RA-3. 8

9 Referencias bibliográficas Durrani S.A., Bull R.K. (1987). Solid State Nuclear Track Detection. Principles, Methods and Applications. International Series in Natural Philosophy (Ed. D. ter Haar). Pergamon Press. Fleischer, R.L., Price, P., Walker, R.M., Basics of track etching. In: Nuclear Tracks in Solids. Berkeley, University of California Press. Kreimann, E., Itoiz, M., Longhino, J., Blaumann, H., Calzetta, O., Schwint, A., Boron Neutron Capture Therapy for the Treatment of Oral Cancer in the Hamster Cheek Pouch Model. Cancer Res. 61: Molinari, A., 2012b. Captura neutrónica en boro (BNCT) para el tratamiento del cáncer bucal: desarrollo de nuevas modalidades de BNCT, evaluación de su radiobiología, eficacia terapéutica y potencial radiotoxicidad en un modelo de hámster. Tesis de Doctorado. Fac. de Cs. Exactas y Naturales, Universidad de Buenos Aires. Portu, A., Bernaola, O.A., Nievas, S., Liberman, S., Saint Martin, G., 2011a. Measurement of 10B concentration through autoradiography images in polycarbonate nuclear track detectors. Rad. Meas. 46: Portu, A., Saint Martin, G., Brandizzi, D., Cabrini, R.L., 2011b. 10 B concentration evaluation in autoradiography images by optical density measurements. Appl. Radiat. Isot. 69: