Monolisa HBsAgULTRA 1 placa - 96 pruebas placas pruebas 72348

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1 Monolisa HBsAgULTRA 1 placa - 96 pruebas placas pruebas KIT PARA LA DETECCIÓN DEL ANTÍGENO DE SUPERFICIE DEL VIRUS DE LA HEPATITIS B POR EL MÉTODO INMUNOENZIMÁTICO EN EL SUERO O EL PLASMA HUMANO IVD Control de calidad del fabricante Todos los productos fabricados y comercializados por la sociedad Bio-Rad se hallan bajo un sistema de garantía de calidad desde la recepción de las materias primas hasta la comercialización de los productos finales. Cada lote de producto final se somete a un control de calidad y sólo se comercializa si está en conformidad con los criterios de aceptación. El fabricante conserva la documentación referente a la producción y al control de cada lote.

2 ÍNDICE DE MATERIAS 1 - OBJETIVO DE LA VALORACIÓN 2 - INTERÉS CLÍNICO 3 - PRINCIPIO DE LA PRUEBA Monolisa HBsAgULTRA 4 - COMPOSICIÓN DEL KIT Monolisa HBsAgULTRA 5 - PRECAUCIONES 6 - RECOMENDACIONES DE HIGIENE Y SEGURIDAD 7 - MATERIAL NECESARIO PERO NO SUMINISTRADO 8 - PREPARACIÓN DE LOS REACTIVOS 9 - CONSERVACIÓN - VALIDEZ 10 - MUESTRAS 11 - PROCEDIMIENTO 12 - ADAPTACIÓN 13 - CÁLCULO E INTERPRETACIÓN DE LOS RESULTADOS 14 - COMPROBACIÓN ESPECTROFOTOMÉTRICA DE LA DISTRIBUCIÓN DE LAS MUESTRAS Y DEL CONJUGADO 15 - ESPECIFICACIONES 16 - LÍMITES DE LA PRUEBA 17 - REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS 16

3 1 - OBJETIVO DE LA VALORACIÓN Monolisa HBs Ag ULTRA es una técnica inmunoenzimática de tipo "sandwich" en 1 tiempo para la detección del antígeno de superficie del virus de la Hepatitis B (Ag HBs) en el suero o el plasma humano. 2 - INTERÉS CLÍNICO La presencia del Ag HBs en el suero indica una infección por el virus de la Hepatitis B. Es el primer marcador que aparece y puede preceder de 2 a 3 semanas a los signos clínicos y biológicos de la enfermedad. Su presencia puede ser muy breve (algunos días) o muy larga (varios años). Cuando la persistencia del Ag HBs supera los 6 meses, la Hepatitis se considera "crónica". La existencia de numerosos portadores crónicos asintomáticos hace que la Hepatitis B represente un importante riesgo transfusional. La prevención de la transmisión se basa en la detección del Ag HBs en cada donación de sangre. 3 - PRINCIPIO DE LA PRUEBA Monolisa HBsAgULTRA Monolisa HBs Ag ULTRA es una técnica inmunoenzimática de tipo "sandwich" en 1 tiempo utilizando anticuerpos monoclonales y anticuerpos policlonales seleccionados por su capacidad de unirse a los diferentes subtipos del Ag HBs actualmente reconocidos por la OMS y la mayoría de las cepas variantes de la hepatitis B. La fase sólida de Monolisa HBs Ag ULTRA está sensibilizada con anticuerpos monoclonales. Los conjugados de Monolisa HBs Ag ULTRA se basan en la utilización de anticuerpos monoclonales de ratón y de anticuerpos policlonales de cabra contra el Ag HBs. Estos anticuerpos están conjugados con peroxidasa. La valoración incluye las siguientes etapas : 1) Distribución de las muestras y de los sueros control en los pocillos de la microplaca. Esta distribución puede controlarse visualmente: en efecto, se observa una clara diferencia de coloración entre un pocillo vacío y un pocillo que contenga una muestra. También puede controlarse mediante la lectura espectrofotométrica a 490/ nm (opcional). 2) Distribución del conjugado. Esta distribución también puede controlarse visualmente: en efecto, tras añadir el conjugado, de color rojo, el pocillo se colorea en rojo. Además de verificarse mediante la lectura espectrofotométrica a 490/ nm (opcional), en esta etapa de la manipulación también puede controlarse la distribución de las muestras por la lectura espectrofotométrica a 490/ nm. 3) Tras la incubación durante una hora y media a 37 C, el conjugado no unido se elimina con el lavado. 4) Distribución de la solución de revelado de la actividad enzimática. Igualmente, esta distribución puede controlarse visualmente : hay una clara diferencia de coloración entre un pocillo vacío y un pocillo que contiene el sustrato de color rosa. Así mismo, puede verificarse mediante la lectura espectrofotométrica a 490 (opcional). 5) Tras 30 minutos de incubación en presencia del sustrato, en oscuridad y a temperatura ambiente (18-30 C), la presencia del conjugado se demuestra con un cambio en el color. 6) Distribución de la solución de parada. Esta distribución puede controlarse también visualmente: la coloración del sustrato, rosada (para las muestras negativas) o azul (para las muestras positivas), desaparece de los pocillos que se vuelven incoloros (en el caso de muestras negativas) o amarillos (en el caso de las muestras positivas) tras la adición de la solución de parada. 7) Lectura de las densidades ópticas a 450/ nm e interpretación de los resultados. 17

4 4 COMPOSICIÓN DEL KIT Monolisa HBsAgULTRA Todos los reactivos están exclusivamente destinados para uso de diagnóstico in vitro. ETIQUETADO NATURALEZA DE LOS REACTIVOS PRESENTACIÓN R1 MICROPLACA : 12 tiras de 8 pocillos sensibilizados 1 microplaca 5 microplacas con anticuerpos monoclonales anti-hbs (ratón) R2 SOLUCIÓN DE LAVADO concentrada (20X) 1 frasco 1 frasco Tampón tris, NaCI, ph = 7,4 70 ml 235 ml Conservante : ProClin TM 300 (0,04%) R3 CONTROL NEGATIVO 2 frascos 2 frascos Tampón Tris HCl, que contiene SAB. 2 x 2,5 ml 2 x 2,5 ml Conservante : ProClin TM 300 (0,1%) R4 CONTROL POSITIVO (Humano) 1 frasco 1 frasco Tampón Tris HCl, que contiene SAB adicionado con una 2,5 ml 2,5 ml mezcla de Ag HBs purificados de los subtipos ad y ay, (humanos) Conservante : ProClin TM 300 (0,1 %) R6 DILUYENTE CONJUGADO Tampón Tris HCl ph frasco 2 frascos adicionado con BSA, Tween 20, inmunoglobulinas de buey y 8 ml 2 x 18 ml de ratón, y de un indicador coloreado como control de la distribución. Conservantes : Ciprofloxacina (10 μg/ml), ProClin TM 300 (0,1%) R7 CONJUGADO Anticuerpos monoclonales anti-hbs 1 frasco 2 frascos de ratón y anticuerpos policlonales anti-hbs de cabra csp 8 ml csp 2 x 18 ml conjugados con peroxidasa. Liofilizado. R8 TAMPÓN SUSTRATO DE LA PEROXIDASA 1 frasco 2 frascos Solución de ácido cítrico y acetato de sodio ph 4,0 que 60 ml 2 x 60 ml contiene 0,015% de H 2 O 2 y 4% de dimetilsulfóxido (DMSO) R9 CROMÓGENO coloreado en rosa : 1 frasco 2 frascos Solución que contiene tetrametilbenzidina (TMB) 5 ml 2 x 5 ml R10 SOLUCIÓN DE PARADA 1 frasco 3 frascos Solución de ácido sulfúrico 1 N 28 ml 3 x 28 ml 5 - PRECAUCIONES La calidad de los resultados depende del respecto de las buenas prácticas de laboratorio siguientes : Todas las microplacas llevan escrito el nombre de la prueba y el número de identificación de la prueba. Este número de identificación figura también en cada una de las tiras. MONOLISA HBs Ag ULTRA : Número de identificación = 51. Comprobar el número de identificación antes de su uso. En caso de que falte el número de identificación, o no coincida con el número antes indicado, no utilizar la tira. No utilizar reactivos después de la fecha de caducidad. No mezclar en un mismo ensayo reactivos que procedan de lotes diferentes. NOTA : se pueden utilizar otros lotes de solución de lavado (R2, identificación en la etiqueta : 20X color verde), de tampón sustrato (R8, identificado TMB buf. en azul), de cromógeno (R9, identificado TMB 11X en violeta) y de solución de parada (R10, identificado 1N en rojo), diferentes a los suministrados en el kit siempre y cuando se utilice un mismo y único lote durante todo el ensayo. Estos reactivos también pueden utilizarse con otros productos de Bio-Rad. Además, la solución de lavado (R2, identificación en la etiqueta: 20X color verde) se puede mezclar con las otras 2 soluciones de lavado incluidas en los distintos kits de reactivos de Bio-Rad (R2, identificaciones en la etiqueta : 10X color azul o 10X color naranja) cuando se reconstituyen debidamente, siempre que se use sólo una mezcla en cada tanda de pruebas. Contacte con nuestros servicios técnicos para una información más detallada. Antes de la utilización, esperar 30 minutos para que los reactivos se equilibren a temperatura ambiente (18-30 C) y una hora en el caso de la solución de lavado diluida (R2). Reconstituir cuidadosamente los reactivos evitando toda contaminación. 18

5 No realizar la prueba en presencia de reactivos que produzcan vapores (ácidos, alcalinos, aldehídos) o polvos que puedan alterar la actividad enzimática del conjugado. Utilizar preferentemente material de uso único. En su defecto, utilizar una cristalería perfectamente lavada y enjuagada con agua destilada. No dejar secar la microplaca entre el final del lavado y la distribución de los reactivos. La reacción enzimática es muy sensible a todos los metales o iones metálicos. Por tanto, ningún elemento metálico debe entrar en contacto con las diferentes soluciones que contienen el conjugado o la solución sustrato. La solución de revelado (tampón sustrato + cromógeno) debe estar coloreada en rosa. La aparición de otra coloración en los minutos siguientes a la reconstitución indica que el reactivo es inutilizable y se debe sustituir. Para esta preparación, utilizar preferentemente recipientes y material de distribución de plástico de uso único o una cristalería previamente lavada con ácido clorhídrico 1N y perfectamente enjuagada con agua destilada y secada. Conservar esta preparación protegida de la luz. Utilizar una punta de pipeta desechable para cada suero. El lavado de los pocillos es una etapa esencial de la manipulación : respetar el número de ciclos de lavado prescrito y comprobar que todos los pocillos están completamente llenos, y después completamente vacíos. Un mal lavado puede producir resultados incorrectos. No utilizar nunca el mismo recipiente para distribuir el conjugado y la solución de revelado. Comprobar la exactitud y la precisión de las pipetas, así como el correcto funcionamiento de los aparatos utilizados. No modificar el procedimiento. 6 - RECOMENDACIONES DE HIGIENE Y SEGURIDAD Todos los reactivos del kit están destinados para uso de diagnóstico "in vitro". Utilizar guantes de un solo uso durante la manipulación de los reactivos y de las muestras y lavarse cuidadosamente las manos tras su manipulación. No pipetear con la boca". El control positivo (R4) contiene Ag HBs de los subtipos ad y ay purificado a partir de plasmas humanos negativos en anticuerpos anti-vih1 y 2 y anticuerpos anti-vhc, inactivados por calor. Ningún método puede garantizar de forma absoluta la ausencia de los virus VIH, VHB, VHC u otros agentes infecciosos. Por tanto, los reactivos de origen humano, al igual que las muestras de los pacientes, deben ser considerados y manipulados como productos potencialmente infecciosos y respetando las precauciones de uso. Considerar el material directamente en contacto con las muestras, los reactivos de origen humano y las soluciones de lavado, como productos contaminados. Evitar las salpicaduras de muestras o de soluciones que las contengan. Limpiar las superficies manchadas con lejía diluida al 10%. Si el líquido contaminante es un ácido, neutralizar previamente las superficies manchadas con bicarbonato de sosa, y después limpiar con lejía y secar con papel absorbente. El material utilizado para la limpieza deberá ser desechado en un contenedor especial para residuos contaminados. Eliminar las muestras y los reactivos de origen humano, así como el material y los productos contaminados después de su descontaminación: - ya sea sumergiéndolos en lejía con una concentración final del 5% de hipoclorito de sodio (1 volumen de lejía por 10 volúmenes de líquido contaminado o de agua) durante 30 minutos, - o bien por calentamiento en autoclave a 121 C durante 2 horas como mínimo. El autoclave es el mejor método para inactivar los virus VIH y VHB. ATENCIÓN : NO INTRODUCIR EN EL AUTOCLAVE SOLUCIONES QUE CONTENGAN HIPOCLORITO DE SODIO. No olvidar neutralizar y/o esterilizar en autoclave las soluciones y residuos de lavado, y cualquier líquido que contenga muestras biológicas, antes de desechar por el desagüe. La manipulación y la eliminación de los productos químicos debe efectuarse según las buenas prácticas de laboratorio. Evitar todo contacto del tampón sustrato, del cromógeno o de la solución de parada con la piel y las mucosas (toxicidad, irritación o quemadura). Algunos reactivos contienen ProClin 300 (0,04%, 0,1% y/o 0,5%) Xi Irritante R43 : puede causar una sensibilización al contacto con la piel S28-37 : Si se produce un contacto con la piel, lávese de inmediato con agua y jabónabundantes. Utilice guantes adecuados. La ficha de datos de seguridad está disponible bajo petición. 19

6 7 - MATERIAL NECESARIO PERO NO SUMINISTRADO Agua destilada. Hipoclorito de sodio (lejía) y bicarbonato de sodio. Pipetas automáticas o semiautomáticas, regulables o fijas, para distribuir 50 μl, 100 μl, 1000 μl y 10 ml. Probetas graduadas de 100 ml y 1000 ml. Contenedor para residuos contaminados. Baño maría o incubador seco*, con termostato a 37 C ± 1 C*. Sistema de lavado automático*, semiautomático* o manual para microplacas. Aparato de lectura* para microplacas equipado con filtros de 450, 490 y nm. Papel absorbente. (*) Consúltenos para una información detallada sobre los aparatos validados por nuestros servicios técnicos. 8 - PREPARACIÓN DE LOS REACTIVOS Antes de utilizar los reactivos del kit Monolisa HBs Ag ULTRA, dejar que se equilibren a temperatura ambiente (18-30 C). 1) Reactivos listos para usar Reactivo 1 (R1) : Microplaca Cada soporte marco que contiene 12 tiras está incluido en una bolsa aluminio sellada. Abrir la bolsa con unas tijeras o un escalpelo de 0,5 a 1 cm por encima del la soldadura. Sacar el marco y volver a introducir inmediatamente en la bolsa las tiras no utilizadas. Cerrar la bolsa cuidadosamente y volver a guardarla a +2-8 C. Reactivo 3 (R3) : Control Negativo Reactivo 4 (R4) : Control Positivo Reactivo 10 (R10) : Solución de parada 2) Reactivos para reconstituir Solución de lavado (concentrada 20X) : Reactivo 2 (R2) Diluir a 1/20 la solución de lavado R2 en agua destilada. Preparar 800 ml para una microplaca de 12 tiras. Conjugado (R6 + R7) Golpear suavemente el frasco de conjugado liofilizado (R7) en la mesa para que se desprenda el producto que se haya podido quedar adherido al tapón de goma. Abrir el frasco de conjugado liofilizado (R7) y añadir el contenido de un frasco de diluyente para conjugado (R6). Volver a tapar y mantener en reposo durante 10 minutos, homogeneizando de vez en cuando para facilitar la disolución. Solución de revelado enzimático (R8 + R9) Diluir el reactivo R9 en el reactivo R8 a 1/11 (ejemplo : 1 ml de reactivo R9 en 10 ml de reactivo R8) sabiendo que para tratar 12 tiras se necesitan, y son suficientes, 10 ml. Esta solución es estable 6 horas si se conserva en oscuridad. Homogeneizar. 9 - CONSERVACIÓN - VALIDEZ Conservar el kit a C hasta su utilización. Una vez abierto, cada elemento del kit Monolisa HBs Ag ULTRA conservado a +2-8 C puede utilizarse hasta la fecha de caducidad indicada en la caja, excepto si existe una indicación específica : R1 : Una vez abierta la bolsa sellada al vacío, las tiras de micropocillos almacenadas a +2-8 C en la bolsa cuidadosamente sellada se pueden usar durante 1 mes. R2 : La solución de lavado diluida se puede conservar a temperatura ambiente (2-30 C) durante 2 semanas. La solución de lavado concentrada (R2) se puede conservar a C. R6 + R7 : Después de su reconstitución, los reactivos se pueden usar durante 1 mes si se conservan a +2-8 C y 8 horas si se almacenan a temperatura ambiente (18-30 C). R8 + R9 : Después de su reconstitución, el reactivo almacenado en la oscuridad se puede usar durante 6 horas a temperatura ambiente (18-30 C) MUESTRAS Extraer una muestra de sangre según las prácticas habituales. Las pruebas se efectúan sobre muestras no diluidas de suero o de plasma (obtenidas con anticoagulantes como EDTA, heparina, citrato, ACD). Separar el suero o el plasma del coágulo o de los glóbulos rojos lo antes posible para evitar la hemólisis. Una hemólisis muy pronunciada puede afectar a las especificaciones de la prueba. Las muestras que presenten agregados deben centrifugarse antes de realizar la prueba para obtener una muestra límpida. Las partículas o agregados de fibrina en suspensión pueden dar resultados falsos positivos. Las muestras podrán almacenarse a C cuando la detección se realice en los 7 días siguientes o pueden conservarse congeladas a -20 C durante varios meses. Evitar las congelaciones/descongelaciones repetidas. No deben utilizarse muestras que se hayan congelado y descongelado más de 3 veces. 20

7 Si las muestras deben viajar, embalarlas según la reglamentación vigente para el transporte de agentes etiológicos y transportarlas preferiblemente congeladas. NO UTILIZAR SUEROS CONTAMINADOS, HIPERLIPÉMICOS O HIPERHEMOLIZADOS. NOTA : No se ha observado ninguna interferencia en las muestras que contienen hasta 90 g/l de albúmina y 100 mg/l de bilirrubina, así como en las muestras lipémicas que contienen hasta 36 g/l de trioleína y en las muestras hemolizadas que contienen hasta 10 g/l de hemoglobina PROCEDIMIENTO Seguir estrictamente el protocolo propuesto. Utilizar los controles positivo (R4) y negativo (R3) en cada serie de determinaciones para validar los resultados de la prueba. Aplicar las buenas prácticas de laboratorio. 1) Establecer cuidadosamente el plan de distribución e identificación de las muestras. 2) Preparar la solución de lavado R2 (ver apartado 8). 3) Preparar la solución de conjugado (R6 + R7) (ver apartado 8). 4) Sacar el marco soporte y el número de tiras necesarias (R1) del embalaje protector. Guardar las tiras no utilizadas en el embalaje y cerrarlo cuidadosamente. 5) Distribuir en los pocillos manteniendo el orden siguiente (plan recomendado para la placa) : Pocillos A1, B1, C1 y D1 : 100 μl de control negativo (R3) Pocillo E1: 100 μl de control positivo (R4) Pocillo F1:100 μl de la primera muestra a ensayar si este pocillo no se utiliza como pocillo control para la validación del depósito de las muestras y del conjugado (opcional) Pocillos G1, H1,... etc: 100 μl de las muestras a ensayar. En función del sistema utilizado, se puede modificar la posición o el orden de distribución de los controles. NOTA : en esta etapa se puede comprobar la distribución de las muestras puesto que existe una clara diferencia de coloración entre un pocillo vacío y un pocillo que contiene una muestra (ver apartado 14 para la comprobación automática - COMPROBACIÓN ESPECTROFOTOMÉTRICA DE LA DISTRIBUCIÓN DE LAS MUESTRAS Y DEL CONJUGADO). 6) Agitar la solución del conjugado antes de usar. Homogeneizar. Distribuir rápidamente 50 μl de la solución reconstituida de conjugado (R6 + R7) en todos los pocillos. Homogeneizar la mezcla de reacción. NOTA : en esta etapa de la manipulación se puede comprobar visualmente la distribución de las muestras así como la distribución del conjugado: tras añadir el conjugado, los pocillos que contienen muestras se colorean en rojo (ver apartado 14 para la comprobación automática - COMPROBACIÓN ESPECTROFOTO- MÉTRICA DE LA DISTRIBUCIÓN DE LAS MUESTRAS Y DEL CONJUGADO). 7) Cuando sea posible, cubrir con una película autoadhesiva e incubar durante 1 hora y 30 ± 5 minutos a 37± 1 C. 8) Retirar la película adhesiva. Aspirar el contenido de todos los pocillos y lavar un mínimo de 5 veces. Comprobar que el volumen residual es inferior a 10 μl (si fuera necesario, secar la placa dándole la vuelta sobre una hoja de papel absorbente). 9) Distribuir rápidamente en todos los pocillos 100 μl de la solución de revelado de la actividad enzimática (R8 + R9) previamente preparada. Dejar que la reacción se desarrolle en la oscuridad durante 30 ± 5 minutos a temperatura ambiente (18 a 30 C). Durante esta incubación, no utilizar película adhesiva. NOTA : La distribución de la solución de revelado, que presenta un color rosa, puede controlarse visualmente en esta etapa de la manipulación: hay una diferencia de coloración significativa entre un pocillo vacío y un pocillo que contiene la solución de revelado rosada (ver apartado 14 para la comprobación automática - COMPROBACIÓN ESPECTROFOTOMÉTRICA DE LA DISTRIBUCIÓN DE LAS MUESTRAS Y DE LOS REACTIVOS) 10) Añadir 100 μl de solución de parada (R10) manteniendo la misma secuencia y el mismo ritmo de distribución que para la solución de revelado. Homogeneizar la mezcla de reacción. NOTA : La distribución de la solución de parada, que es incolora, puede controlarse visualmente en esta etapa de la manipulación. La coloración del sustrato, rosa (en caso de muestras negativas) o azul (en caso de muestras positivas), desaparece de los pocillos que se vuelven incoloros (si las muestras son negativas) o amarillos (si las muestras son positivas) tras la adición de la solución de parada. 11) Limpiar cuidadosamente la parte inferior de las placas. Esperar un mínimo de 4 minutos entre la distribución de la solución de parada y la lectura y en los 30 minutos siguientes a la parada de la reacción leer la densidad óptica a 450/620 nm con un lector de placas. 12) Antes de transcribir los resultados, comprobar la concordancia entre la lectura y el plan de distribución y de identificación de las placas y de las muestras. 21

8 12 - ADAPTACIÓN LAVADO : para obtener las mejores especificaciones de la prueba es indispensable respetar el procedimiento de lavado. En ciertos lavadores, puede ser necesario optimizar el proceso de lavado (aumento del número de ciclos de lavado y/o del volumen de tampón de lavado en cada ciclo, tiempo de remojo) para obtener un nivel aceptable de ruidos de fondo (DO) en las muestras negativas. Consulte con nosotros sobre los procedimientos específicos y las adaptaciones CÁLCULO E INTERPRETACIÓN DE LOS RESULTADOS 1) Cálculo de la densidad óptica media del control negativo : DO R3 Ejemplo Control negativo R3 DO 1 0, , , ,027 Total DO R3 = 0,120 Total DO R3 /4 = 0,030 = media DO R3 2) Cálculo del valor de corte Para cada placa, el valor umbral es igual a : DO R3 + 0,050 Ejemplo DO R3 = 0,030 Valor umbral (VS) = 0, ,050 = 0,080 3) Condiciones de validación de la prueba Todos los valores del control negativo deben ser inferiores o iguales a unidades de densidad óptica. El control positivo (DO R4) debe ser superior o igual a 1,00. Si el valor del control negativo no respeta la norma o es superior en controles negativos (DO R3), eliminar ese valor y repetir el cálculo de 3 valores. Sólo se puede eliminar un valor. Si el ruido de fondo es muy débil para el control negativo R3 (media de los valores negativos R3 inferior a 0,010) no utilice el criterio de rechazo para el control negativo R3. Se repetirá toda la prueba si todos los controles se encuentran fuera del intervalo de los valores mencionados anteriormente. 4) Cálculo de las relaciones Para cada muestra, calcular la relación : DO muestra Relación = VS 5) Interpretación de los resultados Las muestras cuya relación sea inferior a 1 se considerarán negativas según la prueba Monolisa HBs Ag ULTRA. Las muestras cuya relación se encuentre entre 0,9 y 1 deben interpretarse con prudencia. Se recomienda repetir el ensayo con las muestras correspondientes por duplicado cuando los sistemas utilizados y los procedimientos del laboratorio lo permitan. Las muestras cuya relación es igual o superior a 1 se consideran como inicialmente positivas y deben volver a ensayarse por duplicado antes de la interpretación final. Si tras repetir el ensayo, en una muestra la relación de los dos duplicados es inferior a 1, el resultado inicial es no reproducible y la muestra se considera negativa según el ensayo Monolisa HBs Ag ULTRA. Para las muestras iniciales reactivas o dudosas (0.9<índice<1), si tras repetir el ensayo, al menos una relación de los 2 duplicados es igual o superior a 1, el resultado inicial es reproducible y la muestra se considera positiva según el ensayo Monolisa HBs Ag ULTRA, teniendo en cuenta los límites del ensayo descritos a continuación. Las muestras en las que se ha repetido la prueba por duplicado y que han resultado negativas según el ensayo Monolisa HBs Ag ULTRA, pero en las que uno de los valores es cercano al valor umbral (relación entre 0,9 y 1) deberían considerarse con prudencia. Se recomienda volver a estudiar a estos pacientes utilizando otro método o repetir la extracción de sangre. Cuando existe una densidad óptica muy débil para las muestras testadas (DO negativa) y la presencia tanto de las muestras como de los reactivos está bajo control, los resultados pueden interpretarse como negativos. Para comprobar la especificidad de la reacción, todas las muestras positivas según los criterios de interpretación del ensayo Monolisa HBs Ag ULTRA deberán confirmarse con una técnica de neutralización del Ag HBs. 22

9 Las reacciones no repetibles normalmente se deben a : Lavado incorrecto de las microplacas. Contaminación de las muestras negativas de suero o de plasma con una alta concentración de Ag HBs,... Contaminación de la solución de revelado por agentes químicos oxidantes (lejía, iones metálicos, etc). Contaminación de la solución de parada COMPROBACIÓN ESPECTROFOTOMÉTRICA DE LA DISTRIBUCIÓN DE LAS MUESTRAS Y DEL CONJUGADO Comprobación de la distribución de las muestras y del conjugado 1)Comprobación de la distribución de las muestras Antes de la distribución del conjugado, la presencia de las muestras en los pocillos puede verificarse mediante la lectura espectrofotométrica a 490/ nm : un pocillo que contiene una muestra presenta una DO comprendida entre 0,050 y 0,900. ADVERTENCIA : existe una clara diferencia de coloración entre un pocillo vacío transparente y un pocillo que contiene una muestra. 2)Comprobación de la distribución del conjugado Cuando la presencia de las muestras se ha comprobado espectrofotométricamente como se ha descrito anteriormente, la adición de conjugado puede controlarse mediante una lectura espectrofotométrica a /700 nm : un pocillo que contiene conjugado presenta entonces una DO superior a 1,100. ADVERTENCIA : Los pocillos que contienen las muestras son amarillentos y viran a rojo cuando se añade el conjugado coloreado. 3)Comprobación de la distribución de las muestras y del conjugado simultáneamente (técnica únicamente espectrofotométrica). Cuando la presencia de las muestras no se ha comprobado con la lectura automática tal y como se ha indicado anteriormente, la presencia simultánea de las muestras y del conjugado en los pocillos puede confirmarse con la lectura automática a 490/ nm con la condición de que exista un pocillo sólo con el conjugado. El delta de sus DO debe ser superior a 0,35 tal y como se expresa a continuación : [DO (muestra + conjugado) DO conjugado sólo] 0,35 Comprobación de la distribución de la solución de revelado Se puede comprobar la presencia de la solución de revelado rosada mediante la lectura automática a 490 nm : un pocillo que contiene la solución de revelado debe tener una densidad óptica superior a 0,100 (una DO más baja indica una distribución incorrecta de la solución de revelado) ESPECIFICACIONES Las especificaciones de Monolisa HBs Ag ULTRA se han determinado a partir de ensayos realizados en muestras de donantes de sangre no seleccionados, en muestras de pacientes hospitalarios que presentan hepatitis B aguda o hepatitis B crónica, en muestras de pacientes que presentan diferentes patologías sin relación con el virus de la hepatitis B, y en muestras comerciales así como en paneles de seroconversión. El umbral de sensibilidad se ha evaluado a partir del panel francés de la SFTS y del patrón de la OMS. Especificidad La especificidad en 9894 donantes de sangre no seleccionados procedentes de 3 centros diferentes se ha estimado en un 99.94% (9887/9893). Una reacción repetida de una muestra se ha confirmado como positiva para el Ag HBs. El estudio de la especificidad clínica se ha realizado en un laboratorio hospitalario (Centro de Hepatología). De 200 muestras hospitalarias ensayadas, 2 muestras han resultado reactivas repetibles (una resultó dudosa en un primer ensayo (relación = 0,97) y positiva con 1,87 tras la repetición, y la segunda con relaciones 2,29 y 1,99). 289 pacientes que mostraban patologías o estados clínicos sin relación alguna con la hepatitis B (mujer embarazada, factor reumatoide, inmunoglobulinas antinucleares, ratones Ig u otras infecciones víricas o bacterianas) fueron sometidos a prueba con el Monolisa HBs Ag ULTRA. 11 muestras positivas y repetibles fueron controladas con una prueba inmunoenzimática comercial e igualmente con la ayuda de una prueba de neutralización. 10 de las 11 muestras positivas retetibles con Monolisa HBs Ag ULTRA dieron positivo con la prueba Ag HBs EIA comercial. Una muestra fue considerada no interpretable con la prueba de neutralización y fue retirada del cálculo final; 2 muestras no fueron neutralizadas; la una provenía de una muestra positiva IgG HSV, la otra de una muestra de mieloma igualmente positiva con la prueba inmunoenzimática comercial utilizada en la comparación, lo que condujo a una especificidad del 99,28% (276/278). Las otras 9 muestras positivas IgG HSV y las 9 muestras de mieloma dieron negativo con Monolisa HBs Ag ULTRA. Sensibilidad analítica El umbral de sensibilidad del ensayo se ha estimado inferior a 0,06 ng/ml de Ag HBs a partir del panel francés SFTS 2001 e inferior a 0,050 IU/ml para el patrón de la OMS. Todos los siguientes subtipos del panel SFTS 2001: adw2, adw4, adr, ayw1, ayw2, ayw3, ayw4, ayw5 y ayr se han encontrado positivos con una relación superior a 5 con el ensayo Monolisa HBs Ag ULTRA. 23

10 Sensibilidad Los estudios de sensibilidad se han efectuado en 428 muestras positivas procedentes del seguimiento de pacientes que presentan hepatitis B crónica o hepatitis B aguda, han demostrado una sensibilidad de 100%. Con Monolisa HBs Ag ULTRA se ha ensayado y se ha detectado totalmente un panel de 15 proteínas recombinantes reproduciendo las más importantes mutaciones en las secuencias de aminoácidos del Ag HBs. Se ha ensayado un total de 60 paneles de seroconversiones comerciales de hepatitis B (293 muestras) y se ha comparado con las pruebas inmunoenzimáticas disponibles en el mercado. Monolisa HBs Ag ULTRA ha mostrado resultados equivalentes a Monolisa HBs Ag Plus en 29 seroconversiones. Monolisa HBs Ag ULTRA ha detectado las seroconversiones con 1 muestra de adelanto en 28 seroconversiones, con 2 muestras de adelanto en 2 seroconversiones y con 5 muestras de adelanto en 1 seroconversión. Precisión La precisión del ensayo Monolisa HBs Ag ULTRA se ha determinado con el análisis de 4 muestras : 1 muestra negativa, 2 muestras positivas en Ag HBs (m. 2 y 3) y una muestra muy positiva en Ag HBs. La repetibilidad (intra-ensayo) se ha evaluado con el análisis de estas 4 muestras que se han ensayado 30 veces durante una misma manipulación. La reproducibilidad (inter-ensayo) se ha evaluado con el análisis de estas 4 mismas muestras, que se han ensayado por duplicado durante 20 días a razón de 2 ensayos independientes cada día. Los resultados se reagrupan en las siguientes tablas : Tabla 1 : Repetibilidad intra - ensayo n = 30 m 1 m 2 m 3 m 4 Media de las relaciones Desviación estándar (SD) CV (%) relaciones % 3.83 % 3.77 % 6.19 % Tabla 2 : Reproducibilidad inter - ensayo n = 40 m 1 m 2 m 3 m 4 Media de las relaciones Desviación estándar (SD) CV (%) relaciones 18.1 % 8.2 % 9.36 % % 16 - LÍMITES DE LA PRUEBA Un resultado negativo significa que la muestra ensayada no contiene Ag HBs detectable con la prueba Monolisa HBs Ag ULTRA. No obstante, en la medida en la que no pueden detectarse valores muy bajos de Ag HBs, ese resultado negativo no excluye la posibilidad de una infección por el virus de la hepatitis B. Además, varios autores han comunicado en la literatura casos de hepatitis vírica B (aguda o crónica) en los que es detectable DNA virico en ausencia del antígeno de superficie (pacientes HBs Ag negativos). Estos perfiles anormales, si bien son raros, son consecuencia de una posible mutación genética, bien a nivel del gen S y pre-s (impidiendo el reconocimiento del Ag por algunos reactivos inmunológicos) o, normalmente, a nivel del gen X y pol, induciendo una replicación vírica débil. Se recomienda ensayar marcadores adicionales (anticuerpos específicos del HBs Ag, o si es posible, DNA vírico amplificado) para establecer el diagnóstico final de la infección en estos casos muy particulares. Para comprobar la especificidad de la reacción, toda muestra que resulte positiva (según los criterios de interpretación del ensayo Monolisa HBs Ag ULTRA) debería confirmarse mediante una técnica de neutralización de los Ag HBs eventualmente presentes en la muestra (prueba Monolisa HBs Ag confirmación, referencia 72208). El método colorimétrico de comprobación de la distribución de las muestras y/o de los conjugados y/o de la solución de revelado no permite comprobar la exactitud de los volúmenes dispensados: únicamente señala la presencia de muestras y/o de conjugado. El grado de respuestas erróneas obtenidas con este método está relacionado con la precisión del sistema utilizado (los CV acumulados de pipeteo y de lectura superiores al 10% pueden rebajar significativamente la calidad de esta comprobación). En el caso de un lavado incorrecto tras la etapa de incubación del conjugado, la comprobación automática de la distribución de la solución de revelado (mediante la lectura a 490 nm de las densidades ópticas de los pocillos) puede dar resultados erróneos con densidades ópticas superiores a 0,100 en ausencia de solución de revelado. Sin embargo, este fenómeno no se ha observado durante las evaluaciones realizadas en 939 muestras ensayadas. 24

11 17 - REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS 1. COUROUCE A.M., LEE H., DROUET J., CANAVAGGIO M. and SOULIER J.P. (1983) Monoclonal antibodies to HBs Ag : a study of their specificities for eight different HBs subtypes. Developments in Biological Standardization, 54, COUROUCE A.M., PLANCON A. and SOULIER J.P. (1983) Distribution of HBs Ag subtypes in the world. Vox Sang. 44, DAVID G.S., PRESENT W., MARTINIS J., WANG R., BATHOLOMEW R., DESMOND W. and SEVIER E.D., (1981) Monoclonal antibodies in the detection of hepatitis infection. Medical Laboratory Sciences, 38, DROUET J., COUROUCE A.M., KALIL J., LEE H., and FELLOUS M. (1981) Monoclonal antibodies to HBs Ag produced by murine hybridomas. In viral hepatitis, edited by Szmuness W. Alter H.J., Maynard J.E. The Franklin Institute Press, FIELDS H.A., DAVID C.L., BRADLEY D.W. and MAYNARD J.E. (1983) Experimental conditions affecting the sensitivity of enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) for detection of hepatitis B surface antigen (HBs Ag) - Bulletin of the World Health Organization, 61, 1, LEE H.H., COUROUCE A.M., PERE M., CANAVAGGIO M., DROUET J. and SOULIER J.P. (1983) Monoclonal antibodies to HBs Ag; a study of their specificities against HBs Ag subtypes and their utilization in ELISA. International Association of Biological Standardization. International Symposium on Monoclonal Antibodies : Paris, France. 7. SOULIER J.P., COUROUCE A.M., LEE H. DROUET J., MULLER A. and CANAVAGGIO M. (1983) Monoclonal antibodies against HBs antigen. Bulletin Biotest (vol. 4, ). 8. WANDS J.P., CARLSON R.L., SCHOEMAKER H., ISSELBACHER K.J. and ZURAWSKI V.R. (1981) Immunodiagnosis of hepatitis B with high-affinity IgM monoclonal antibodies. Proc. Nat. Acad. Sci., 78, 2, M. CANAVAGGIO, A.M. COUROUCE, M. PERE, H. LEE Spécificité d'anticorps monoclonaux dirigés contre le déterminant a de l'ag HBs (1985). Nouvelle Revue Française d'immunohématologie (Springer International), 27, 2, J. DROUET, G. CHARRIER, A.M. COUROUCE, M. PERE, J.F. DELAGNEAU, J. ROISIN (1985) Nouveaux réactifs de dépistage de l'ag HBs et de dosage de l'anticorps anti-hbs. Nouvelle Revue Française d'immunohématologie (Springer International), 27, 2,

12 IVD (GB) - CE marking (European directive 98/79/CE on in vitro diagnostic medical devices) (FR) - Marquage CE (Directive européenne 98/79/CE relative aux dispositifs médicaux de diagnostic in vitro) (ES) - Marcado CE (Directiva europea 98/79/CE sobre productos sanitarios para diagnóstico in vitro) (IT) - Marchiatura CE (Direttiva europea 98/79/CE relativa ai dispositivi medico-diagnostici in vitro) (DE) - CE Konformitätskennzeichnung (Europäische Richtlinie 98/79/EG über In-vitro-Diagnostika) (PT) - Marcação CE (Directiva europeia 98/79/CE relativa aos dispositivos médicos de diagnóstico in vitro) (SE) - CE-märkning (Europeiskt direktiv 98/79/EG om medicintekniska produkter för in vitro-diagnostik) (DK) - CE-mærkningen (Europa direktiv 98/79/EF om medicinsk udstyr til in vitro-diagnostik) (GR) - CE ( 98/79/CE in vitro ) (PL) - CE oznaczenie (Dyrektywa unijna 98/79/CE dotycząca produktów medycznych do badań in vitro) (LT) - CE ženklas (Europos sąjungos direktyva 98/79/CE dėl in vitro diagnostikos medicinos prietaisų) (HU) - CE jelzés (98/79/CE Európai Irányelv az in vitro orvosi diagnosztikai eszközökről) (EE) - CE märgistus (Euroopa direktiiv 98/79/CE in vitro diagnostikameditsiiniseadmete kohta) (SK) - CE označenie o zhode (Európska direktíva 98/79/CE pre in vitro diagnostické zdravotnícke postupy) (CZ) - CE značka (Evropská direktiva 98/79/CE o diagnostických zdravotnických prostředcích in vitro) (NO) - CE-merking (EU-direktiv 98/79/CE om medisinsk utstyr til in vitro-diagnostikk) (RO) - Marca CE (Directiva europeana 98/79/CE pentru dispozitive medicale de diagnostic in vitro) (BG) - СЕ маркировка (Европейска директива 98/79/CE за ин витро диагностичните медицински изделия) (GB) - For in vitro diagnostic use (GB) - Catalogue number (FR) - Pour diagnostic in vitro (FR) - Référence catalogue (ES) - Para diagnóstico in vitro (ES) - Número de catálogo (IT) - Per uso diagnostico in vitro (IT) - Numero di catalogo (DE) - In-vitro-Diagnostikum (DE) - Bestellnummer (PT) - Para uso em diagnóstico in vitro (PT) - Número de catálogo (SE) - In vitro-diagnostik (SE) - Katalognummer (DK) - In vitro diagnose (DK) - Katalognummer (GR) - in vitro (GR) - (PL) - Do stosowania in vitro (PL) - Numer katalogu (LT) - in vitro diagnostikai (LT) - Katalogo numeris (HU) - Csak in vitro diagnosztikai alkalmazásra (HU) - Cikkszám (EE) - In vitro diagnostiliseks kasutamiseks (EE) - Katalooginumber (SK) - Na diagnostiku in vitro (SK) - Katalógové číslo (CZ) - Pro diagnostiku in vitro (CZ) - Katalogové číslo (NO) - Til in vitro-diagnostikk (NO) - Katalognummer (RO) - Pentru diagnostic in vitro (RO) - Număr de catalog (BG) - За ин витро диагностика (BG) - Каталожен номер (GB) - Manufacturer (GB) - Authorised Representative (FR) - Fabricant (FR) - Représentant agréé (ES) - Fabricante (ES) - Representante autorizado (IT) - Produttore (IT) - Distributore autorizzato (DE) - Hersteller (DE) - Bevollmächtigter (PT) - Fabricante (PT) - Representante Autorizado (SE) - Tillverkad av (SE) - Auktoriserad representant (DK) - Fremstillet af (DK) - Autoriseret repræsentant (GR) - (GR) - (PL) - Producent (PL) - Upoważniony Przedstawiciel (LT) - Gamintojas (LT) - Įgaliotasis atstovas (HU) - Gyártó (HU) - Meghatalmazott Képviselő (EE) - Tootja (EE) - Volitatud esindaja (SK) - Výrobca (SK) - Autorizovaný zástupca (CZ) - Výrobce (CZ) - Zplnomocněný zástupce (NO) - Produsent (NO) - Autorisert representant (RO) - Producător (RO) - Reprezentant autorizat (BG) - Производител (BG) - Упълномощен представител (GB) - Batch code (GB) - Expiry date YYYY/MM/DD (FR) - Code du lot (FR) - Date de peremption AAAA/MM/JJ (ES) - Código de lote (ES) - Estable hasta AAAA/MM/DD (IT) - Codice del lotto (IT) - Da utilizzare prima del AAAA/MM/GG (DE) - Chargen-Bezeichnung (DE) - Verwendbar bis JJJJ/MM/TT (PT) - Código do lote (PT) - Data de expiração AAAA/MM/DD (SE) - Batchnr (SE) - Utgångsdatum ÅÅÅÅ/MM/DD (DK) - Batchkoden (DK) - Anvendes før ÅÅÅÅ/MM/DD (GR) - (GR) - YYYY/MM/DD (PL) - Numer serii (PL) - Data ważności YYYY/MM/DD (LT) - Serijos numeris (LT) - Galioja iki YYYY/MM/DD (HU) - Gyártási szám (HU) - Szavatossági idő ÉÉÉÉ/HH/NN (EE) - Partii kood (EE) - Aegumistähtaeg AAAA/KK/PP (SK) - Číslo šarže (SK) - Použiteľné do RRRR/MM/DD (CZ) - Číslo šarže (CZ) - Datum exspirace RRRR/MM/DD (NO) - Partikode (NO) - Utløpsdato ÅÅÅÅ/MM/DD (RO) - Număr de lot (RO) - Data expirarii AAAA/LL/ZZ (BG) - Партиден номер (BG) - Срок на годност година/месец/ден

13 (GB) - Storage temperature limitation (FR) - Limites de températures de stockage (ES) - Temperatura límite (IT) - Limiti di temperatura di conservazione (DE) - Lagertemperatur (PT) - Limites de temperatura de armazenamento (SE) - Temperaturbegränsning (DK) - Temperaturbegrænsning (GR) - (PL) - Temperatura przechowywania (LT) - Saugojimo temperatūriniai apribojimai (HU) - Tárolási hőmérsékleti határok (EE) - Piirangud säilitustemperatuurile (SK) - Skladovacia teplota od do (CZ) - Teplotní rozmezí od do (NO) - Oppbevaringstemperatur (RO) - Limitele de temperatură la stocare (BG) - Температурни граници на съхранение (GB) - Consult Instruction for use (FR) - Consulter le mode d'emploi (ES) - Consulte las instrucciones de uso (IT) - Consultare le istruzioni per uso (DE) - Siehe Gebrauchsanweisung (PT) - Consulte o folheto informativo (SE) - Se bruksanvisningen (DK) - Se instruktion før brug (GR) - (PL) - Sprawdź instrukcję (LT) - Ieškokite informacijos vartojimo instrukcijoje (HU) - Olvassa el a használati utasítást (EE) - Kasutamisel vaata instruktsiooni (SK) - Katalógové číslo (CZ) - Viz návod k použití (NO) - Se bruksanvisninger (RO) - Consultati prospectul de utilizare (BG) - Виж инструкцията за употреба

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