Monolisa HBe Ag-Ab PLUS tests HBe Ag - 96 tests HBe Ab

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1 Monolisa HBe Ag-Ab PLUS tests HBe Ag - 96 tests HBe Ab KIT DE DETECCIÓN DE LOS ANTÍGENOS HBe Y DE LOS ANTICUERPOS HBe POR EL MÉTODO INMUNOENZIMÁTICO IVD Control de calidad del fabricante Todos los reactivos fabricados y comercializados están sujetos a un completo sistema de calidad que se inicia al recibir las materias primas y se extiende hasta la comercialización final del producto. Cada lote se somete a un control de calidad y únicamente se aprueba su introducción en el mercado cuando cumple los criterios de aceptación. La empresa posee los registros relativos a la producción y el control de cada uno de los lotes.

2 ÍNDICE 1. OBJETIVO DE LA PRUEBA 2. INTERÉS CLÍNICO 3. PRINCIPIO DE LA PRUEBA 4. COMPOSICIÓN DEL KIT 5. MATERIAL NECESARIO, PERO NO SUMINISTRADO 6. PRECAUCIONES 7. RECOMENDACIONES DE HIGIENE Y SEGURIDAD 8. RECONSTITUCIÓN DE LOS REACTIVOS 9. CONSERVACIÓN - VALIDEZ 10. MUESTRAS 11. PROCEDIMIENTO 12. CÁLCULO E INTERPRETACIÓN DE LOS RESULTADOS 13. VERIFICACIÓN ESPECTROFOTOMÉTRICA DE LAS MUESTRAS Y DEL PIPETEO DE LOS REACTIVOS 14. ESPECIFICACIONES 15. BIBLIOGRAFÍA 18

3 1 - OBJETIVO DE LA PRUEBA Monolisa HBe Ag-Ab PLUS permite la determinación cualitativa, mediante la técnica inmunoenzimática, del antígeno e del virus de la hepatitis B (Ag Hbe ) y/o de los anticuerpos dirigidos contra el antígeno e de la hepatitis B (Anti-HBe) eventualmente presentes en el suero o en el plasma humano. 2 - INTERÉS CLÍNICO La presencia del antígeno HBe generalmente indica una multiplicación viral activa y la infecciosidad de una muestra de suero. El antígeno HBe aparece precozmente durante una hepatitis viral de tipo B, y si persiste (más de un mes) existe un riesgo de empeoramiento de la hepatopatía. La aparición de los anticuerpos contra el antígeno HBe indica una disminución de la replicación viral y, generalmente, representa un pronóstico clínico favorable. 3 - PRINCIPIO DE LA PRUEBA a) Detección del antígeno HBe La detección del Ag Hbe se basa en una técnica inmunoenzimática de tipo sándwich en dos tiempos usando un anticuerpo Anti-HBe humano y un par de anticuerpos monoclonales Anti-HBe marcados (Acm1 y Acm2) de origen múrido que reconocen epítopos diferentes. La fase sólida está compuesta por tiras de 8 pocillos de poliestireno sensibilizados con el anticuerpo Anti-HBe humano. La prueba incluye las siguientes etapas : 1. Incubación de las muestras y de los controles en presencia del anticuerpo Anti-HBe fijado sobre la fase sólida. 2. Lavado y posterior incubación de los complejos insolubilizados con los anticuerpos monoclonales marcados con peroxidasa. 3. Eliminación, por lavado, del conjugado que permanece libre, y posterior revelado de la actividad enzimática unida a la fase sólida por adición de sustrato. 4. Parada del revelado, lectura de las densidades ópticas a 450/620 nm e interpretación de los resultados. b) Detección de anticuerpos anti-hbe Para la detección de los anticuerpos anti-hbe, el kit utiliza la misma fase sólida que para el Ag HBe. La prueba se basa en el principio de competición entre el anticuerpo insolubilizado y el anticuerpo presente e la muestra frente a una cantidad limitada de antígeno HBe utilizado como reactivo de neutralización. Posteriormente, el revelado se realiza con otra mezcla de anticuerpos monoclonales (Acm1 y Acm2) marcados con peroxidasa. La prueba incluye las siguientes etapas : 1. Incubación de las muestras y de los controles en presencia del anticuerpo Anti-HBe fijado sobre la fase sólida. 2. Lavado y posterior incubación de los complejos insolubilizados con los anticuerpos monoclonales marcados con peroxidasa. 3. Eliminación, por lavado, del conjugado que permanece libre, y posterior revelado de la actividad enzimática unida a la fase sólida por adición de sustrato. 4. Parada del revelado, lectura de las densidades ópticas a 450/620 nm e interpretación de los resultados. 4 - COMPOSICIÓN DEL KIT Todos los reactivos del kit están destinados para uso de diagnóstico in vitro. Los reactivos se suministran en cantidad suficiente para realizar 96 determinaciones en 1 a 12 manipulaciones independientes y según las siguientes combinaciones : bien 96 determinaciones de Ag HBe bien 48 determinaciones de Ag HBe y 48 determinaciones de Anti-HBe simultáneamente. 19

4 ETIQUETADO NATURALEZA DE LOS REACTIVOS PRESENTACIÓN R1 MICROPLACA : 12 tiras de 8 pocillos sensibilizados con anticuerpos 2 placas Anti-HBe humanos procedentes de plasma positivo en Ag HBs, inactivado R2 SOLUCIÓN DE LAVADO CONCENTRADA (20X) 1 frasco Tampón Tris-NaCI, ph 7,4 235 ml Conservante : ProClin TM 300 (0,04 %) R3 CONTROL NEGATIVO común a las pruebas Ag Hbe/ Anti-HBe 1 frasco Suero humano negativo en anticuerpos anti-hiv1 y anti-hiv2 8 ml y en anticuerpos anti-hcv Conservante : Ázida sódica al 0,1%1 frasco R4 CONTROL POSITIVO PRUEBA Anti-HBe 1 frasco Plasma humano desfibrinado positivo en anticuerpos anti-hbe 1,5 ml y potencialmente positivo en Ag HBs, negativo en anticuerpos anti-hv1 y anti-hiv2 y en anticuerpo anti-hcv, inactivado Conservante : Azida sódica al 0,1% R5 CONTROL POSITIVO PRUEBA Ag HBe 1 frasco Plasma humano desfibrinado positivo en Ag HBe y en Ag HBs, 1,5 ml negativo en anticuerpos anti-hv1 y anti-hiv2 y en anticuerpo anti-hcv, inactivado Conservante : Azida sódica al 0,1% R6 ANTÍGENO DE NEUTRALIZACIÓN 1 frasco Plasma humano desfibrinado positivo en Ag HBe y en Ag HBs, 8 ml negativo en anticuerpos anti-hv1 y anti-hiv2 y en anticuerpo anti-hcv, inactivado Conservante : Azida sódica al 0,1% R7a CONJUGADO PRUEBA ANTI-HBe, CONCENTRADO 5X 1 frasco 2 anticuerpos monoclonales múridos (Acm1 y Acm2)* Anti-HBe 3 ml marcados con peroxidasa. R7b CONJUGADO PRUEBA Ag HBe, CONCENTRADO 5X 1 frasco 2 anticuerpos monoclonales múridos (Acm1 y Acm2)* Anti-HBe 3 ml marcados con peroxidasa. R8 TAMPÓN SUSTRATO DE LA PEROXIDASA 1 frasco Ácido cítrico y solución de acetato sódico ph 4,0 60 ml que contiene 0,015% de H 2 O 2 y 4% de DMSO. R9 CROMÓGENO 1 frasco Solución que contiene tetrametilbenzidina (TMB) 5 ml R10 REACTIVO DE PARADA 1 frasco Solución de ácido sulfúrico 1N 28 ml FRASCO VACÍO PARA DILUCIÓN 1 frasco 25 ml * La relación Acm1/Acm2 es diferente para los conjugados R7a y R7b. No intercambiar los dos conjugados. 5 - MATERIAL NECESARIO, PERO NO SUMINISTRADO Agua destilada o completamente desmineralizada Hipoclorito de sodio (lejía doméstica) y bicarbonato de sodio Papel absorbente. Guantes de un solo uso. Tubos de poliestireno (12 x 75 mm) de un solo uso. 20

5 Pipetas manuales o semiautomáticas, regulables o fijas, para distribuir 50 µl, 100 µl, 200 µl y 1 ml. Probetas graduadas de 10 ml, 50 ml, 100 ml, 1000 ml. Agitador tipo vortex. Contenedor para residuos contaminados Sistema de lavado manual, semiautomático o automático para microplacas*. Baño maría con termostato a 40 ± 1ºC, o incubador calentador de placas*. Aparato de lectura para microplacas, equipado con filtros 450 y 620 nm*. (*) Consulte a nuestro Departamento Técnico para una información precisa relativa a los equipos recomendados. 6 - PRECAUCIONES La fiabilidad de los resultados depende del respeto de las buenas prácticas de laboratorio siguientes : No se mezclarán los reactivos de lotes diferentes dentro de un test. OBSERVACIÓN : Para la solución de lavado (R2, identificación en la etiqueta : 20X color verde), tampón sustrato de peroxidasa (R8, etiqueta de identificación : tampón TMB buf., color azul), chromogen (R9, etiqueta la identificación : TMB 11X color púrpura) y la solución de detención (R10, etiqueta de identificación : 1N color rojo), es posible usar otros lotes distintos de los del estuche, a condición de que dentro de un mismo test se use el mismo lote. Estos reactivos se pueden usar con otros productos Bio-Rad. Además, la solución de lavado (R2, identificación en la etiqueta: 20X color verde) se puede mezclar con las otras 2 soluciones de lavado incluidas en los distintos kits de reactivos de Bio-Rad (R2, identificaciones en la etiqueta: 10X color azul o 10X color naranja) cuando se reconstituyen debidamente, siempre que se use sólo una mezcla en cada tanda de pruebas. Póngase en contacto con nuestro servicio técnico para una información detallada. Todas las microplacas llevan escrito el nombre de la prueba y el número de identificación de la prueba. Este número de identificación figura también en cada una de las tiras. Monolisa HBe Ag-Ab PLUS : Número de identificación = 56. Comprobar el número de identificación antes de su uso. En caso de que falte el número de identificación, o no coincida con el número antes indicado, no utilizar la tira. No utilizar reactivos después de la fecha de caducidad. Antes de la utilización, esperar 30 minutos para que los reactivos se equilibren a temperatura ambiente (18-30ºC) y una hora para la solución de lavado diluida (R2). Reconstituir cuidadosamente los reactivos evitando toda contaminación. No realizar la prueba en presencia de reactivos que produzcan vapores (ácidos, alcalinos, aldehídos) o polvos que puedan alterar la actividad enzimática de los conjugados. Utilizar preferentemente material de un solo uso. En su defecto, utilizar una cristalería perfectamente lavada y enjuagada con agua destilada. No dejar secar la microplaca entre el final del lavado y la distribución de los reactivos. Utilizar una punta de pipeta nueva para cada muestra. El lavado de los pocillos es una etapa esencial de la manipulación : respetar el número de ciclos de lavado prescrito y comprobar que todos los pocillos están completamente llenos, y después completamente vacíos. Un mal lavado puede producir resultados incorrectos Comprobar la exactitud y la precisión de las pipetas, así como el correcto funcionamiento de los aparatos utilizados. No modificar el procedimiento. La solución de revelado (tampón del sustrato + cromógeno) debe ser de color rosa. La modificación de este color rosa unos minutos después de la reconstitución indica la imposibilidad de utilizar el reactivo y su correspondiente sustitución. Puede procederse a la preparación de la solución de revelado en una bandeja de plástico de un solo uso o en un recipiente de cristal previamente lavado con HCI de 1N y aclarado cuidadosamente con agua destilada y posteriormente secado. Este reactivo debe almacenarse en un lugar oscuro. 21

6 7 - RECOMENDACIONES DE HIGIENE Y SEGURIDAD Todos los reactivos del kit están destinados para uso de diagnóstico in vitro. Utilizar guantes de un solo uso durante la manipulación de los reactivos y de las muestras y lavarse cuidadosamente las manos tras su manipulación. No pipetear con la boca. El material de origen humano utilizado en la preparación del reactivo R3 (control negativo) se ha analizado y encontrado no reactivo en antígeno de superficie del virus de la hepatitis B (Ag HBs), y en anticuerpos dirigidos contra los virus de la inmunodeficiencia humana (anti-hiv-1 y anti-hiv-2). El material de origen humano utilizado para la preparación del reactivo R1 (con microplaca sensibilizada) ha sido controlado, resultando no reactivo en anticuerpos producidos contra los virus de inmunodeficiencia humana (anti-vih-1 y anti-vih-2) y en anticuerpos producidos contra el virus de la hepatitis C. Es reactivo en antígeno de superficie del virus de la hepatitis B (Ag HBs) y en anticuerpo anti-hcv. Se ha inactivado fotoquímicamente. El material de origen humano utilizado en la preparación de los reactivos R4 (control positivo prueba Anti-HBe), R5 (control positivo prueba Ag HBe) y R6 (antígeno de neutralización) se ha analizado y encontrado no reactivo en anticuerpos dirigidos contra los virus de la inmunodeficiencia humana (anti-hiv-1 y anti-hiv-2) y en anticuerpos anti-hcv. Los reactivos R5 y R6 son positivos en antígeno de superficie del virus de la hepatitis B (Ag HBs), el reactivo R4 es potencialmente positivo en antígeno de superficie del virus de la hepatitis B (Ag HBs). Se han inactivado fotoquímicamente. Ningún método puede garantizar de forma absoluta la ausencia de agentes infecciosos. Por tanto, los reactivos, al igual que las muestras de los pacientes, deben ser considerados y manipulados como productos potencialmente infecciosos. Considerar el material directamente en contacto con las muestras, los reactivos de origen humano y las soluciones de lavado, como productos contaminados y tratarlo como tal. Evitar las salpicaduras de muestras o de soluciones que las contengan. Limpiar las superficies manchadas con lejía diluida al 10%. Si el líquido contaminante es un ácido, neutralizar previamente las superficies manchadas con bicarbonato de sosa, y después secar con papel absorbente. El material utilizado para la limpieza deberá ser desechado en un contenedor especial para residuos contaminados. Eliminar las muestras y los reactivos de origen humano, así como el material y los productos contaminados después de su descontaminación : - ya sea sumergiéndolos en lejía con una concentración final del 5% de hipoclorito de sodio (1 volumen de lejía por 10 volúmenes de líquido contaminado o de agua) durante 30 minutos, - o bien por calentamiento en autoclave a 121 C durante 2 horas como mínimo. El autoclave es el mejor método para inactivar los virus VIH y VHB. NO INTRODUCIR EN EL AUTOCLAVE SOLUCIONES QUE CONTENGAN HIPOCLORITO DE SODIO. No olvidar neutralizar y/o esterilizar en autoclave las soluciones y residuos de lavado, y cualquier líquido que contenga muestras biológicas, antes de desechar por el desagüe. La ficha de datos de seguridad está disponible bajo petición. La manipulación y la eliminación de los productos químicos debe efectuarse según las buenas prácticas de laboratorio. Evitar todo contacto del tampón sustrato, del cromógeno o de la solución de parada con la piel y las mucosas (toxicidad, irritación o quemadura). Ciertos reactivos contienen azida sódica. Este compuesto puede reaccionar con las tuberías de cobre o plomo para formar azoturos metálicos altamente explosivos. Para evitar las acumulaciones de estos azoturos en las cañerías, enjuagar las tuberías con abundante agua mientras se eliminan estos reactivos por el desagüe. Algunos reactivos contienen ProClin 300 (0.04%, 0.1 % y/o 0,5%). Xi Irritante R43 : puede causar una sensibilización al contacto con la piel S28-37 : Si se produce un contacto con la piel, lávese de inmediato con agua y jabónabundantes. Utilice guantes adecuados. 22

7 8 - RECONSTITUCIÓN DE LOS REACTIVOS Nota : antes de su utilización, esperar que los reactivos se equilibren a temperatura ambiente (18-30 C) Microplaca (R1) Cada soporte marco que contiene 12 tiras está incluido en una bolsa aluminio sellada. Abrir la bolsa con unas tijeras o un escalpelo de 0,5 a 1 cm por encima del la soldadura. Sacar el marco y volver a introducir inmediatamente en la bolsa las tiras no utilizadas. Cerrar la bolsa cuidadosamente y volver a guardarla a +2-8 C. Solución de lavado concentrada (20X) : R2 Diluya al 1:20 en agua destilada para obtener una solución de lavado lista para su uso. Para una tira se necesitan 75 ml de solución lista para usar. Homogeneizar. Conjugado prueba Anti-HBe (R7a) Diluir a 1/5 la solución R7a en la solución R2 previamente diluida, sabiendo que según el número de tiras utilizadas se necesitarán : Número de tiras utilizadas Volumen de solución R7a (ml) Completar con solución R2 preparada hasta (ml) 1 0, , , , , , , , , ,4 12 Homogeneizar. Conjugado prueba Ag HBe (R7b) Utilizar el mismo protocolo que para el conjugado R7a. Solución de revelado enzimático (R8 + R9) Disolver 1 comprimido de OPD para 10 ml de tampón sustrato R8. 10 ml son necesarios y suficientes para 1 a 10 tiras. Homogeneizar. 9 - CONSERVACIÓN - VALIDEZ El estuche se debe conservar a C. Cuando se conserva a esta temperatura, cada reactivoincluido en el estuche se puede usar hasta la fecha de caducidad mencionada en el envase (excepto en el caso de instrucciones específicas). R1 : Una vez abierta la bolsa sellada al vacío, las tiras de micropocillos almacenadas a +2-8 C en la bolsa cuidadosamente sellada se pueden usar durante 1 mes. R2 : La solución de lavado diluida se puede conservar a temperatura ambiente (2-30 C) durante 2 semanas. La solución de lavado concentrada (R2) se puede conservar a C. R7a : El conjugado prueba Anti-HBe diluido se puede conservar durante 8 horas a temperatura ambiente (18-30 C). El conjugado prueba debe protegerse de la luz, a temperatura ambiente (18-30 C). R7b : El conjugado prueba Ag HBe diluido se puede conservar durante 8 horas a temperatura ambiente (18-30 C). El conjugado prueba debe protegerse de la luz, a temperatura ambiente (18-30 C). R8 + R9 : Después de su reconstitución, el reactivo almacenado en la oscuridad se puede usar durante 6 horas a temperatura ambiente (18-30 C) MUESTRAS Extraer una muestra de sangre según las prácticas habituales. 23

8 Las pruebas se efectúan sobre muestras no diluidas de suero o de plasma (obtenidas con anticoagulantes como EDTA, citrato, ACD, anticoagulantes base). Separar el suero o el plasma del coágulo o de los glóbulos rojos lo antes posible para evitar la hemólisis. Las muestras que presenten agregados deben centrifugarse antes de realizar la prueba para obtener una muestra límpida. Las partículas o agregados de fibrina en suspensión pueden dar resultados falsos positivos. Las muestras podrán almacenarse a +2-8 C cuando la detección se realice en los 7 días siguientes o pueden conservarse congeladas a -20 C. Evitar las congelaciones / descongelaciones repetidas. Si las muestras deben viajar, embalarlas según la reglamentación vigente para el transporte de agentes etiológicos y transportarlas preferentemente congeladas. NO UTILIZAR SUEROS CONTAMINADOS, HIPERLIPÉMICOS O HIPERHEMOLIZADOS. NOTA : No se ha observado ninguna interferencia en las muestras que contienen hasta 100 mg/l de bilirrubina, así como en las muestras lipémicas que contienen hasta 36 g/l de trioleína y en las muestras hemolizadas que contienen hasta 2,5 g/l de hemoglobina. Se ha observado un desengrasado en las muestras negativas que contienen 45 mg/ml de albúmina PROCEDIMIENTO Las pruebas Ag HBe y Anti-HBe se pueden realizar en la misma placa. En este caso recomendamos: Prueba Anti-HBe : líneas de la 1 a la 6 Prueba Ag HBe : líneas de la 7 a la 12 a) Protocolo de la prueba Anti-HBe 1. Preparar la solución de lavado. 2. Sacar del envase protector el marco soporte y el número de tiras necesarias. Guardar las tiras no utilizadas en el embalaje y cerrarlo cuidadosamente. 3. Distribuir en los pocillos sucesivamente : A1, B1, C1 : 100µl de control negativo (R3) D1 : 100 µl de control positivo (R4) E1, F1, G1 : 100 µl de muestra. En función del sistema utilizado, se puede modificar la posición o el orden de distribución de los controles. NOTA : Hay una diferencia evidente de coloración entre los pocillos vacíos y los pocillos que contienen muestras (amarillos). Comprobar la presencia de muestra en los pocillos con la ayuda de la lectura espectrofotométrica a 490 nm (longitud de onda única). Consultar apartado Añadir rápidamente 50 µl de antígeno neutralizante (R6) por pocillo. Homogeneizar. Cubrir con una película adhesiva e incubar 3 horas ± 10 minutos a 37ºC ± 1ºC. NOTA : En esta etapa de la manipulación puede controlarse visualmente la distribución del antígeno de neutralización (R6), de color rosa. Puede comprobarse la presencia de antígeno de neutralización en los pozos mediante la lectura espectrofotométrica a 490 nm (longitud de onda única). Consultar el apartado 13 : COMPROBACIÓN ESPECTROFOTOMÉTRICA DE LAS MUESTRAS Y DEL PIPETEO DE LOS REACTIVOS. 5. Preparar la solución de conjugado R7a antes de que finalice la etapa Retirar la película adhesiva y aspirar el contenido de todos los pocillos en un contenedor para residuos contaminados. Lavar cuatro veces como en la etapa Distribuir rápidamente 100 µl de la solución diluida de conjugado (R7a) (Consultar apartado 8 : RECONSTITUCIÓN DE LOS REACTIVOS) en cada pocillo o utilizar el conjugado R7a tal como es siguiendo el procedimiento propuesto : distribuir 80 µl de solución diluida de lavado (R2) en cada pocillo, y a continuación 20 µl de conjugado Anti-BHe R7a, concentrado 5 veces. Homogeneizar. Cubrir con una película adhesiva e incubar 30 minutos a 37ºC ± 1 C (mínimo de 25 minutos, máximo de 40 minutos). Retirar la película adhesiva, aspirar el contenido de todos los pocillos en un contenedor para residuos contaminados y lavar cinco veces. NOTA : En esta etapa de la manipulación puede controlarse visualmente la distribución del conjugado prueba R7a diluido, de color violeta. Puede comprobarse la presencia del conjugado prueba R7a diluido en los pozos mediante la lectura espectrofotométrica a 620 nm (longitud de onda única). Consultar el apartado 13 : COMPROBACIÓN ESPECTOFOTOMÉTRICA DE LAS MUESTRAS Y DEL PIPETEO DE LOS REACTIVOS. 24

9 8. Preparar extemporáneamente la solución de revelado de color (R8 + R9). Consultar el apartado 8 : RECONSTITUCIÓN DE LOS REACTIVOS. 9. Distribuir rápidamente 80 µl de la solución de revelado a color por pocillo y mantener la placa 30 minutos ± 5 minutos en oscuridad y a temperatura ambiente ( C). NOTA : En esta etapa de la manipulación puede controlarse visualmente la distribución de la solución de revelado, de color rosa. Existe una diferencia evidente de coloración entre los pozos vacíos y los pozos que contienen la solución de color rosa. Consultar el apartado 13 : COMPROBACIÓN ESPECTOFOTOMÉTRICA DE LAS MUESTRAS Y DEL PIPETEO DE LOS REACTIVOS. 10.Añadir rápidamente 100 µl de la solución de parada (R10) en cada pocillo. NOTA : En esta etapa de la manipulación puede controlarse visualmente la distribución de la solución de parada, totalmente incolora. Tras la adición de la solución de parada, el sustrato de color rosa se transforma en incoloro en las muestras negativas, y en las muestras positivas el sustrato de color azul se transforma en amarillo. 11.Limpiar cuidadosamente la parte inferior de las placas. Leer la densidad óptica a 450/620 nm con la ayuda de un lector de placas durante al menos 4 minutos tras la adición de la solución de parada y en los 30 minutos siguientes a la parada de la reacción. b) Protocolo de la prueba Ag HBe 1. Preparar la solución de lavado. 2. Sacar del envase protector el marco soporte y el número de tiras necesarias. Guardar las tiras no utilizadas en el embalaje y cerrarlo cuidadosamente. 3. Distribuir en los pocillos sucesivamente: A1, B1, C1 : 100µl de control negativo (R3) D1 : 100 µl de control positivo (R5) E1, F1, G1 : 100 µl de muestra. En función del sistema utilizado, se puede modificar la posición o el orden de distribución de los controles. NOTA : Hay una diferencia evidente de coloración entre los pocillos vacíos y los pocillos que contienen muestras (amarillos). Comprobar la presencia de muestra en los pocillos con la ayuda de la lectura espectrofotométrica a 490 nm (longitud de onda única). Consultar apartado 13 : VERIFICACIÓN ESPECTROFOTOMÉTRICA DE LAS MUESTRAS Y DEL PIPETEO DE LOS REACTIVOS 4. Cubrir con una película adhesiva e incubar 3 horas ± 10 minutos a 37ºC ± 1ºC. 5. Preparar la solución de conjugado R7b antes de que finalice la etapa Retirar la película adhesiva y aspirar el contenido de todos los pocillos en un contenedor para residuos contaminados. Lavar cuatro veces. 7. Distribuir rápidamente 100 µl de la solución diluida de conjugado (R7b) en cada pocillo o utilizar el conjugado R7b tal como es siguiendo el procedimiento propuesto: distribuir 80 µl de solución diluida de lavado (R2) en cada pocillo, y a continuación 20 µl de conjugado Anti-BHe R7a, concentrado 5 veces. Homogeneizar. Cubrir con una película adhesiva e incubar 30 minutos a 37ºC ± 1 C (mínimo de 25 minutos, máximo de 40 minutos). Retirar la película adhesiva, aspirar el contenido de todos los pocillos en un contenedor para residuos contaminados y lavar cinco veces. NOTA : En esta etapa de la manipulación puede controlarse visualmente la distribución del conjugado prueba R7b diluido, de color turquesa. Puede comprobarse la presencia del conjugado prueba R7a diluido en los pozos mediante la lectura espectrofotométrica a 620 nm (longitud de onda única). Consultar el apartado 13: COMPROBACIÓN ESPECTOFOTOMÉTRICA DE LAS MUESTRAS Y DEL PIPETEO DE LOS REACTIVOS. 8. Preparar extemporáneamente la solución de revelado de color (R8 + R9). 9. Distribuir rápidamente 80 µl de la solución de revelado a color (R8 + R9) por pocillo y mantener la placa 30 minutos ± 5 minutos en oscuridad y a temperatura ambiente ( C). NOTA : En esta etapa de la manipulación puede controlarse visualmente la distribución de la solución de revelado, de color rosa. Existe una diferencia evidente de coloración entre los pozos vacíos y los pozos que contienen la solución de color rosa. Consultar el apartado 13: COMPROBACIÓN ESPECTROFOTOMÉTRICA DE LAS MUESTRAS Y DEL PIPETEO DE LOS REACTIVOS. 25

10 10. Añadir rápidamente 100 µl de la solución de parada (R10) en cada pocillo. NOTA : En esta etapa de la manipulación puede controlarse visualmente la distribución de la solución de parada, totalmente incolora. Tras la adición de la solución de parada, el sustrato de color rosa se transforma en incoloro en las muestras negativas, y en las muestras positivas el sustrato de color azul se transforma en amarillo. 11.Limpiar cuidadosamente la parte inferior de las placas. Leer la densidad óptica a 450/620 nm con la ayuda de un lector de placas durante al menos 4 minutos tras la adición de la solución de parada y en los 30 minutos siguientes a la parada de la reacción. c) Protocolo de las pruebas Anti-HBe y Ag HBe en la misma placa Los protocolos son idénticos a los descritos anteriormente. Sólo se modifica la disposición en la placa, que queda como sigue : Prueba Anti-HBe : líneas de la 1 a la 6 Prueba Ag HBe : líneas de la 7 a la CÁLCULO E INTERPRETACIÓN DE LOS RESULTADOS a) Prueba Anti-HBe 1. Calcular la densidad óptica media de los controles negativos : DO R3 Ejemplo : Control Negativo R3 DO 1 1, , ,291 Total DO = 4,569 Total DO/3 = 4,569/3 = 1,523 = DO R3 No se puede eliminar más de un valor de la media del control negativo R3 cuando su DO se desvía en más de un 25% de la media. Repetir el cálculo de la media con los otros dos valores. 2. Cálculo del valor umbral Para cada placa, el valor umbral es igual a : Valor umbral = VS = DO R3 x 0,4 Ejemplo : DO R3 = 1,523 VS = 1,523 x 0,4 = 0, Validación de la prueba Anti-HBe DO R3 > 0,900 DO R4 < 0, Cálculo de las relaciones Para cada muestra, calcular la relación: Relación = DO muestra / Valor umbral 5. Interpretación de los resultados Todas las muestras se considerarán : positivas si la relación es inferior o igual a 0,9 (relación 0,9) negativas si la relación es superior a 1,1 (relación > 1,1) No obstante, cuando se observe un resultado comprendido entre 0,9 y 1,1, se recomienda repetir la búsqueda de anti-hbe en otras muestras. Se recomienda repetir la prueba en todas las muestras positivas por duplicado. Si tras repetir el ensayo, al menos un valor de los dos duplicados es positivo, la muestra se considera positiva. b) Prueba Ag HBe 1. Calcular la densidad óptica media de los controles negativos : DO R3 Ejemplo : Control Negativo R3 DO 1 0, , ,026 Total DO = 0,071 Total DO/3 = 0,071/3 = 0,024 = DO R3 26

11 No se puede eliminar más de un valor de la media del control negativo R3 cuando su DO se desvía en más de un 25% de la media. Repetir el cálculo de la media con los otros dos valores. 2. Cálculo del valor umbral Para cada placa, el valor umbral es igual a : Valor umbral = VS = DO R3 + 0,025 Ejemplo : DO R3 = 0,024 VS = 0, ,025 = 0, Validación de la prueba Ag HBe DO R3 < 0,060 DO R5 > 0, Cálculo de las relaciones Para cada muestra, calcular la relación: Relación = DO muestra / Valor umbral 5. Interpretación de los resultados Todas las muestras se considerarán : positivas si la relación es superior o igual a 1 (relación 1) negativas si la relación es inferior a 1 (relación < 1) Se recomienda repetir la prueba en todas las muestras positivas por duplicado. Si tras repetir el ensayo, al menos un valor de los dos duplicados es positivo, la muestra se considera positiva VERIFICACIÓN ESPECTROFOTOMÉTRICA DE LAS MUESTRAS Y DEL PIPETEO DE LOS REACTIVOS 1 - PRUEBA Anti-HBe Presencia de muestras y controles La presencia de muestras y controles en los pocillos puede verificarse mediante lectura automática a 490 nm. Los pocillos que contengan controles de muestras deberán tener una DO superior a 0,050. Presencia del antígeno de neutralización HBe (R6) La presencia del antígeno de neutralización HBe en los pocillos puede verificarse mediante lectura automática a 490 nm con un cálculo delta de la DO. Delta DO = (muestra (o control) DO490 con R6) (solo muestra (o control) DO490) El delta DO debe ser superior a 0,150. Presencia del conjugado concentrado prueba Anti-Hbe (R7a) La presencia del conjugado diluido R7a en el pocillo puede verificarse mediante lectura automática a 620 nm. El valor DO de todos los pocillos deberá ser superior o igual a 0,070 e inferior o igual a 0,200. Presencia de la solución de revelado (R8 + R9) La presencia de la solución de revelado en los pocillos puede verificarse mediante lectura automática a 490 nm. El valor DO de los pocillos deberá ser superior a 0, PRUEBA Ag HBe Presencia de muestras y controles La presencia de muestras y controles en los pocillos puede verificarse mediante lectura automática a 490 nm. Los pocillos que contengan controles de muestras deberán tener una DO superior a 0,100. Presencia del conjugado concentrado prueba Ag Hbe (R7b) La presencia del conjugado diluido R7b en el pocillo puede verificarse mediante lectura automática a 620 nm. El valor DO de todos los pocillos deberá ser superior a 0,210. Presencia de la solución de revelado (R8 + R9) La presencia de la solución de revelado en los pocillos puede verificarse mediante lectura automática a 490 nm. El valor DO de los pocillos deberá ser superior a 0,

12 14 - ESPECIFICACIONES Las especificaciones asociadas a la prueba Monolisa HBe Ag-Ab PLUS, resumidas a continuación, han sido valoradas en 2 sitios utilizando muestras de donantes de sangre, de pacientes y de paneles de seroconversiones. 1 - Prueba Ag HBe Especificidad La especificidad en 200 donantes de sangre no seleccionados se ha estimado en un 100% [98,51 100%], (IC95). Asimismo, la especificidad en muestras de pacientes se estimó en un 100% [99,28 100%] (IC95, 416/416 muestras). El análisis de 195 pacientes que presentan diversas patologías o estados sin relación con el virus de la Hepatitis B (mujeres embarazadas, factor reumatoide, anticuerpos anti-nuclear, anti Ig del ratón u otras infecciones víricas o bacterianas) ha demostrado una especificidad del 99,49% [97,18 99,99%] (IC 95, muestras halladas negativas 194/195). Sensibilidad analítica El umbral de sensibilidad de la prueba se ha estimado en 0,64 U/ml [0,49 0,84] (IC 95) a partir de la estándar PEI. Sensibilidad La sensibilidad en 203 muestras positivas procedentes del seguimiento de pacientes que presentan infección crónica por el virus de la Hepatitis B y en paneles comerciales de seroconversiones. La sensibilidad en estas muestras se ha estimado del 99,51% [97,29 99,99%] (IC 95, muestras 202/203). Precisión La precisión de la prueba Monolisa HBe Ag Ab (Ag HBe) se ha determinado mediante el análisis de 4 muestras : 1 muestra negativa, 1 muestra escasamente positiva en Ag HBe, 1 una muestra fuertemente positiva en Ag HBe y 1 muestra medianamente positiva en Ag HBe. La repetibilidad (intra-ensayo) se ha evaluado mediante el análisis de estas 4 muestras que se han ensayado 30 veces durante una misma manipulación. La reproducibilidad (inter-ensayo) se ha evaluado mediante el análisis de estas 4 mismas muestras que se han ensayado por duplicado durante 20 días a razón de 2 ensayos independientes cada día. Los resultados se resumen en las siguientes tablas : Tabla 1 : Repetibilidad intra-ensayo n = 30 muestra 1 muestra 2 muestra 3 muestra 4 media de las relaciones 3,56 5,29 27,24 45,56 desviación estándar (SD) 0,05 0,35 0,63 2,88 CV (%) relaciones 14,20 6,53 2,31 6,33 Tabla 2 : Reproducibilidad inter.ensayo n = 80 muestra 1 muestra 2 muestra 3 muestra 4 media de relaciones 0,51 8,19 27,33 46,35 desviación estándar (SD) 0,12 1,17 3,26 4,98 CV (%) 23,86 14,27 11,92 10, Prueba Anti-HBe Especificidad La especificidad en 200 donantes de sangre no seleccionados se ha estimado en un 100% [98,51 100%], (IC95). Asimismo, la especificidad en 206 muestras de pacientes se estimó en un 98,54% [95,80 99,70%] (IC95, 203/206 muestras). Se han analizado 198 pacientes que presentan diversas patologías o estados sin relación con el virus de la Hepatitis B (mujeres embarazadas, factor reumatoide, anticuerpos anti-nuclear, anti Ig del ratón u otras infecciones víricas o bacterianas), y se hallaron 3 muestras positivas (2 muestras del virus de la Hepatitis B y 1 muestra con factor reumatoride). En esta población se ha demostrado una especificidad del 98,48% [95,64 99,69%] (IC 95, muestras halladas negativas 195/198). Estas muestras han sido sometidas a nuevas pruebas; la muestra con el factor reumatoide fue 28

13 hallada nuevamente reactiva. Las dos muestras con el virus de la Hepatitis B fueron halladas negativas o dudosas. Sensibilidad La sensibilidad en 220 muestras positivas procedentes del seguimiento de pacientes que presentan infección crónica por el virus de la Hepatitis B y en paneles comerciales de seroconversiones. La sensibilidad en estas muestras se ha estimado del 98,64% [96,07 99,72%] (IC 95, 217/220 muestras). Precisión La precisión de la prueba Monolisa HBe Ag Ab PLUS (Anti-HBe) se ha determinado mediante el análisis de 4 muestras : 1 muestra negativa, 1 muestra escasamente positiva en Anti-HBe, 1 una muestra fuertemente positiva en Anti-HBe y 1 muestra medianamente positiva en Anti-HBe. La repetibilidad (intra-ensayo) se ha evaluado mediante el análisis de estas 4 muestras que se han ensayado 30 veces durante una misma manipulación. La reproducibilidad (inter-ensayo) se ha evaluado mediante el análisis de estas 4 mismas muestras que se han ensayado por duplicado durante 20 días a razón de 2 ensayos independientes cada día. Los resultados se resumen en las siguientes tablas : Tabla 1 : Repetibilidad intra-ensayo n = 30 muestra 1 muestra 2 muestra 3 muestra 4 media de las relaciones 3,15 0,69 0,42 0,03 desviación estándar (SD) 0,05 0,04 0,04 0,00 CV (%) relaciones 1,7 5,7 10,5 6,6 Tabla 2 : Reproducibilidad inter.ensayo n = 80 muestra 1 muestra 2 muestra 3 muestra 4 media de relaciones 2,39 0,81 0,59 0,3 desviación estándar (SD) 0,23 0,077 0,09 0,01 CV (%) 9,6 9,5 14,5 39, BIBLIOGRAFÍA 1-MIYAKAWA Y.; MAYUMI M.; (1985) Hepatitis Be antigen and antibody (HBe Ag/Anti-HBe) in Hepatitis B. Academic Press., chap. 4: KANNO A.; OHORI H., MATSUDA K.; NAKAYAMA H.; MIYAZAKI Y.; ISHIIM.; SUZUKI H.; OHTSUKI M.; GOTO Y. (1987) Virological significance of HBe Ag subtypes (HBe Ag/1 and HBe Ag/2) in patients with type B hepatitis. Hepatology; 7 (1) BRECHOT C.; (1987) Les marqueurs et la prévention des infections par le virus de l hépatite B en Encyclopédie Médicochirurgicale; Instantanés Médicaux, 4; THIERS V.; BOUCHARDEAU F.; COUROUCE A.M.; TIOLLAIS P.; BRECHOT C., (1986) L ADN du virus de l hépatite B comme marqueur de multiplication virale: comparaison avec l antigène HBe et l anticorps anti Hbe. La Presse Médicale: 15: LAROUZE B., PENALBA C., DAZZA M.C. (1983) Signification des marqueurs sériques du virus de l hépatite B. Biologiste et praticien; 56; ALDERSHVILE J., FROSNER G.G.; NIELSEN J.O.; HARDT F. DEINHARTD F.; SKINHOJ P., (1980) Hepatitis Be antigen and antibody measured by radioimmuno-assay in acute hepatitis B surface antigen positive hepatitis. J. Infect. dis.: 141 (3), TAKAHASHI K.; IMAI M., TSUDA F., TAKAHASHI T., MIYAKAWA Y. MAYUMI M. (1976) Association of Dane particles with e antigen in the serum of asymptomatic carriers of hepatitis B surface antigen. J. of Immunol. 117 (1);

14 IVD (GB) - CE marking (European directive 98/79/CE on in vitro diagnostic medical devices) (FR) - Marquage CE (Directive européenne 98/79/CE relative aux dispositifs médicaux de diagnostic in vitro) (ES) - Marcado CE (Directiva europea 98/79/CE sobre productos sanitarios para diagnóstico in vitro) (IT) - Marchiatura CE (Direttiva europea 98/79/CE relativa ai dispositivi medico-diagnostici in vitro) (DE) - CE Konformitätskennzeichnung (Europäische Richtlinie 98/79/EG über In-vitro-Diagnostika) (PT) - Marcação CE (Directiva europeia 98/79/CE relativa aos dispositivos médicos de diagnóstico in vitro) (SE) - CE-märkning (Europeiskt direktiv 98/79/EG om medicintekniska produkter för in vitro-diagnostik) (DK) - CE-mærkningen (Europa direktiv 98/79/EF om medicinsk udstyr til in vitro-diagnostik) (GR) - CE ( 98/79/CE in vitro ) (PL) - CE oznaczenie (Dyrektywa unijna 98/79/CE dotycząca produktów medycznych do badań in vitro) (LT) - CE ženklas (Europos sąjungos direktyva 98/79/CE dėl in vitro diagnostikos medicinos prietaisų) (HU) - CE jelzés (98/79/CE Európai Irányelv az in vitro orvosi diagnosztikai eszközökről) (EE) - CE märgistus (Euroopa direktiiv 98/79/CE in vitro diagnostikameditsiiniseadmete kohta) (SK) - CE označenie o zhode (Európska direktíva 98/79/CE pre in vitro diagnostické zdravotnícke postupy) (CZ) - CE značka (Evropská direktiva 98/79/CE o diagnostických zdravotnických prostředcích in vitro) (NO) - CE-merking (EU-direktiv 98/79/CE om medisinsk utstyr til in vitro-diagnostikk) (RO) - Marca CE (Directiva europeana 98/79/CE pentru dispozitive medicale de diagnostic in vitro) (BG) - СЕ маркировка (Европейска директива 98/79/CE за ин витро диагностичните медицински изделия) (GB) - For in vitro diagnostic use (GB) - Catalogue number (FR) - Pour diagnostic in vitro (FR) - Référence catalogue (ES) - Para diagnóstico in vitro (ES) - Número de catálogo (IT) - Per uso diagnostico in vitro (IT) - Numero di catalogo (DE) - In-vitro-Diagnostikum (DE) - Bestellnummer (PT) - Para uso em diagnóstico in vitro (PT) - Número de catálogo (SE) - In vitro-diagnostik (SE) - Katalognummer (DK) - In vitro diagnose (DK) - Katalognummer (GR) - in vitro (GR) - (PL) - Do stosowania in vitro (PL) - Numer katalogu (LT) - in vitro diagnostikai (LT) - Katalogo numeris (HU) - Csak in vitro diagnosztikai alkalmazásra (HU) - Cikkszám (EE) - In vitro diagnostiliseks kasutamiseks (EE) - Katalooginumber (SK) - Na diagnostiku in vitro (SK) - Katalógové číslo (CZ) - Pro diagnostiku in vitro (CZ) - Katalogové číslo (NO) - Til in vitro-diagnostikk (NO) - Katalognummer (RO) - Pentru diagnostic in vitro (RO) - Număr de catalog (BG) - За ин витро диагностика (BG) - Каталожен номер (GB) - Manufacturer (GB) - Authorised Representative (FR) - Fabricant (FR) - Représentant agréé (ES) - Fabricante (ES) - Representante autorizado (IT) - Produttore (IT) - Distributore autorizzato (DE) - Hersteller (DE) - Bevollmächtigter (PT) - Fabricante (PT) - Representante Autorizado (SE) - Tillverkad av (SE) - Auktoriserad representant (DK) - Fremstillet af (DK) - Autoriseret repræsentant (GR) - (GR) - (PL) - Producent (PL) - Upoważniony Przedstawiciel (LT) - Gamintojas (LT) - Įgaliotasis atstovas (HU) - Gyártó (HU) - Meghatalmazott Képviselő (EE) - Tootja (EE) - Volitatud esindaja (SK) - Výrobca (SK) - Autorizovaný zástupca (CZ) - Výrobce (CZ) - Zplnomocněný zástupce (NO) - Produsent (NO) - Autorisert representant (RO) - Producător (RO) - Reprezentant autorizat (BG) - Производител (BG) - Упълномощен представител (GB) - Batch code (GB) - Expiry date YYYY/MM/DD (FR) - Code du lot (FR) - Date de peremption AAAA/MM/JJ (ES) - Código de lote (ES) - Estable hasta AAAA/MM/DD (IT) - Codice del lotto (IT) - Da utilizzare prima del AAAA/MM/GG (DE) - Chargen-Bezeichnung (DE) - Verwendbar bis JJJJ/MM/TT (PT) - Código do lote (PT) - Data de expiração AAAA/MM/DD (SE) - Batchnr (SE) - Utgångsdatum ÅÅÅÅ/MM/DD (DK) - Batchkoden (DK) - Anvendes før ÅÅÅÅ/MM/DD (GR) - (GR) - YYYY/MM/DD (PL) - Numer serii (PL) - Data ważności YYYY/MM/DD (LT) - Serijos numeris (LT) - Galioja iki YYYY/MM/DD (HU) - Gyártási szám (HU) - Szavatossági idő ÉÉÉÉ/HH/NN (EE) - Partii kood (EE) - Aegumistähtaeg AAAA/KK/PP (SK) - Číslo šarže (SK) - Použiteľné do RRRR/MM/DD (CZ) - Číslo šarže (CZ) - Datum exspirace RRRR/MM/DD (NO) - Partikode (NO) - Utløpsdato ÅÅÅÅ/MM/DD (RO) - Număr de lot (RO) - Data expirarii AAAA/LL/ZZ (BG) - Партиден номер (BG) - Срок на годност година/месец/ден

15 (GB) - Storage temperature limitation (FR) - Limites de températures de stockage (ES) - Temperatura límite (IT) - Limiti di temperatura di conservazione (DE) - Lagertemperatur (PT) - Limites de temperatura de armazenamento (SE) - Temperaturbegränsning (DK) - Temperaturbegrænsning (GR) - (PL) - Temperatura przechowywania (LT) - Saugojimo temperatūriniai apribojimai (HU) - Tárolási hőmérsékleti határok (EE) - Piirangud säilitustemperatuurile (SK) - Skladovacia teplota od do (CZ) - Teplotní rozmezí od do (NO) - Oppbevaringstemperatur (RO) - Limitele de temperatură la stocare (BG) - Температурни граници на съхранение (GB) - Consult Instruction for use (FR) - Consulter le mode d'emploi (ES) - Consulte las instrucciones de uso (IT) - Consultare le istruzioni per uso (DE) - Siehe Gebrauchsanweisung (PT) - Consulte o folheto informativo (SE) - Se bruksanvisningen (DK) - Se instruktion før brug (GR) - (PL) - Sprawdź instrukcję (LT) - Ieškokite informacijos vartojimo instrukcijoje (HU) - Olvassa el a használati utasítást (EE) - Kasutamisel vaata instruktsiooni (SK) - Katalógové číslo (CZ) - Viz návod k použití (NO) - Se bruksanvisninger (RO) - Consultati prospectul de utilizare (BG) - Виж инструкцията за употреба

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