Genscreen HIV-1 Ag Assay 192 Tests 71120

Transcripción

1 Genscreen HIV-1 Ag Assay 192 Tests TEST IMMUNOENZIMÁTICO (EIA, ENZYME IMMUNOASSAY) PARA LA DETECCIÓN DEL ANTÍGENO P24 DEL VIRUS DE LA IMMUNODEFICIENCIA ADQUIRIDA HUMANA DE TIPO 1 (VIH-1) EN EL SUERO HUMANO, EL PLASMA HUMANO Y LOS SOBRENADANTES DE CULTIVO CELULAR IVD Control de calidad del fabricante Todos los productos fabricados y comercializados por la sociedad Bio-Rad se hallan bajo un sistema de garantía de calidad desde la recepción de las materias primas hasta la comercialización de los productos finales. Cada lote de producto final se somete a un control de calidad y sólo se comercializa si está en conformidad con los criterios de aceptación. El fabricante conserva la documentación referente a la producción y al control de cada lote.

2 ÍNDICE 1 - INTERÉS CLÍNICO 2 - PRINCIPIO DEL Genscreen HIV-1 ANTIGEN ASSAY 3 - COMPOSICIÓN DEL ESTUCHE Genscreen HIV-1 ANTIGEN ASSAY 4 - MATERIAL NECESARIO, PERO NO INCLUIDO 5 - CONSIGNAS DE HIGIENE Y DE SEGURIDAD 6 - PRECAUCIONES 7 - MUESTRAS 8 - RECONSTITUCIÓN DE LOS REACTIVOS 9 - VALIDEZ CONSERVACIÓN 10 - MODO OPERATORIO 11 - CÁLCULO E INTERPRETACIÓN DE LOS RESULTADOS 12 - VERIFICACIÓN ESPECTROFOTOMÉTRICA DEL PIPETEADO DE LAS MUESTRAS Y DE LOS REACTIVOS 13 - RESULTADOS 14 - LÍMITES DEL TEST 15 - REFERENCIAS BIBLIOGÁFICAS 16

3 1 - INTERÉS CLÍNICO El agente etiológico del síndrome de immunodeficiencia adquirida (SIDA) es un retrovirus que recibió la denominación de Virus de la Immunodeficiencia Humana (VIH). El VIH ha sido aislado en pacientes afectados por el SIDA, así como en individuos sanos que forman parte de una población sometida a un riesgo de padecer el SIDA 1,2. Se sabe que la transmisión tiene lugar por vía sexual, por la utilización de agujas contaminadas, por transfusión de productos sanguíneos contaminados y también por vía placentaria, desde la madre infectada al feto o al recién nacido 1,8. Normalmente, es posible detectar anticuerpos específicos contra el virus en la sangre o en el plasma de un individuo que ha sido expuesto al virus, lo cual confirma así la exposición. En la fase que precede a la aparición de anticuerpos detectables, ya existen antígenos víricos libres que circulan en la sangre. Uno de estos antígenos víricos es el antígeno p24, que corresponde a la principal proteína de la nucleocápside. Los tests de detección del antígeno del VIH se pueden utilizar para detectar la presencia de antígenos víricos y, por lo tanto, para diagnosticar una infección por el VIH, y ello antes de que haya tenido lugar la seroconversión. El periodo de antigenemia, que precede a la aparición de los anticuerpos anti-vih, es variable y puede durar desde algunos días a varias semanas entre los individuos infectados. En el momento de la seroconversión, los anticuerpos específicos del virus forman complejos inmunes con los antígenos circulantes, de tal manera que tiene lugar una fuerte caída del índice de antígenos libres en la sangre y, eventualmente, la desaparición completa de estos antígenos 9,11. La antigenemia puede reaparecer más tarde en el curso de la progresión de la enfermedad 12. El test Genscreen HIV-1 Antigen Assay está destinado a su utilización como ayuda en el diagnóstico y el pronóstico de la infección por el VIH PRINCIPIO DEL Genscreen HIV-1 ANTIGEN ASSAY El test Genscreen HIV-1 Antigen Assay es un test inmunoenzimático para la detección in vitro del antígeno p24 de la cápside del virus de la inmunodeficiencia humana de tipo 1 (VIH-1) libre en muestras humanas de suero, de plasma y del sobrenadante del cultivo celular. El test Genscreen HIV-1 Antigen Confirmatory Assay (código 71121) se utiliza como complemento del test Genscreen HIV-1 Antigen Assay para confirmar la presencia de antígeno p24 del VIH en muestras repetidamente reactivas. El test Genscreen HIV-1 Antigen Assay se basa en la utilización de una fase sólida preparada con anticuerpos monoclónicos de ratón anti-vih-1, de un primer conjugado preparado con anticuerpos biotinilados de carnero antip24 y de un segundo conjugado preparado con avidina acoplada a la peroxidasa de Raifort. La realización del test comprende las siguientes etapas reactivas: 1. Las muestras que hay que estudiar, así como los sueros de control, se distribuyen en sus pocillos respectivos, a los cuales se les ha añadido con anterioridad el disolvente de las muestras. En el caso de que existan antígenos VIH-1 en la muestra sometida a test, éstos se fijan entonces a los anticuerpos que tapizan los pocillos, donde quedan fijos durante la siguiente etapa de lavado. El depósito de las muestras queda confirmado por un cambio de color del disolvente de muestra, que pasa del verde al azul. 2. El conjugado 1 se añade luego en cada pocillo y se somete después a incubación. Esto permite a los anticuerpos biotinilados de carnero anti-p24 presentes en el conjugado 1 que se fijen a los antígenos-anticuerpos VIH-1 fijos en los pocillos. Estos complejos antígeno-anticuerpo permanecen fijos en los pocillos en el momento de la siguiente etapa de lavado. 3. El conjugado 2 se distribuye entonces y luego se incuba. La avidina del conjugado 2 se liga de forma específica a los complejos antígeno-anticuerpo VIH-1 fijos en los pocillos. El excedente no fijo del conjugado se elimina mediante lavado. 4. Se añade la solución de trabajo TMB y se procede después a incubación. Aparece una coloración azul o verde azulada, proporcional a la cantidad de antígeno VIH-1 presente en la muestra. Se detiene la reacción colorimétrica añadiendo ácido, que modifica la coloración, desde el azul verdoso al amarillo. La densidad óptica de las muestras y de los controles se determina por espectrofotometría a una longitud de onda de 450/ nm. 17

4 3 - COMPOSICIÓN DEL ESTUCHE Genscreen HIV-1 ANTIGEN ASSAY ETIQUETADO NATURALEZA DE LOS REACTIVOS PRESENTACIÓN R1 Microplate Microplaca 12 tiras de 8 pocillos con anticuerpos murinos monoclónicos anti-p24 del VIH-1 Conservante : ProClin 300, Azida sódica (< 0,1%) 2 placas R2 Concentrated Washing Solution (20X) Solución de Lavado Concentrada (20X) Tampón Tris NaCl ph 7,4 Conservante : ProClinTM 300 (0,04%) 235 ml R3 Specimen Diluent Disolvente de las Muestras Conservante : ProClin 300 (0,5%) Colorante verde testigo de la adición de las muestras 20 ml C0 Negative Control Control Negativo Suero humano no reactivo para el antígeno VIH y AgHbs y los anticuerpos anti-vih-1, anti-vih-2, anti-vhc, anti-htlv-i, Sulfato de gentamicina al 0,005% Conservante : ProClin 300 (0,5%) 10 ml C1 Positive Control Control Positivo Antígeno VIH-1 purificado y disociado Conservante : ProClin 300 (0,5%) 7 ml R4 R5 Concentrated Conjugate 1 (100X) Concentrated Conjugate 2 (100X) Conjugado Concentrado 1 (100X) Anticuerpo de carnero biotinilado anti-p24 Sulfato de gentamicina al 0,005% Colorante amarillo - Conservante : ProClin 300 (0,5%) Conjugado Concentrado 2 (100X) Avidina acoplada a la peroxidasa de Raifort Sulfato de gentamicina al 0,005% Colorante verde - Conservante: ProClin 300 (0,5%) 1 ml 1 ml R6 Conjugate Diluent Disolvente de los Conjugados Tapón con estabilizantes de proteínas Conservante: ProClin 300 (0,5%) 100 ml R8 Substrate Buffer Tampón Substrato Solución de ácido cítrico y de acetato sódico ph 4,0 que contiene un 0,015% de agua oxigenada y un 4% de dimetilsulfóxido (DMSO) 60 ml R9 Chromogen Cromógeno Solución que contiene tetrametil benzidina (TMB) 5 ml R10 Stopping Solution Solución de Interrupción Solución de ácido sulfúrico 1N 2 frascos 2 x 28 ml 4 - MATERIAL NECESARIO, PERO NO INCLUIDO Agua destilada. Lejía (hipoclorito sódico del 5 al 8%) que se puede diluir a una concentración mínima del 10% de lejía (o hipoclorito sódico al 0,5%). Otros desinfectantes posibles: etanol al 70% o Wescodyne al 0,5% (West Chemical Products, Inc.). Pipetas de precisión para distribuir volúmenes de 10 a 200 μl, 1 ml, 5 ml y 10 ml (precisión ± el 10%). Pipeteador multicanales para distribuir 100 μl o 200 μl: facultativo. Probetas graduadas de 25 ml; 100 ml; 1000 ml. Contenedor de desechos contaminados. Baño María o incubadora* de microplacas con termostato a 37 C ± 1 C (o 40 ± 1 C). Dispositivo de lavado manual y semiautomático o aparato de lavado para placa de microvaloración. (*) Aparato de lectura para microplacas equipado con filtros 450 nm y nm. (*) 18

5 Tiras no sensibilizadas cuando las placas incompletas son sometidas a un test automático. Recipientes para reactivos EIA (facultativo). Guantes de uso único. Papel absorbente. Recipientes limpios de plástico (poliestireno o polipropireno) para la preparación de las soluciones de trabajo conjugadas y de la solución TMB. Medio de cultivo celular, por ejemplo, RPMI-1640, que contiene un 10% de suero de carnero fetal, equivalente al utilizado para el cultivo de células infectadas (en caso de test efectuado con muestras de células). (*) Sírvase el usuario consultarnos para una información precisa relativa a los aparatos validados por nuestros servicios técnicos. 5 - CONSIGNAS DE HIGIENE Y DE SEGURIDAD Todos los reactivos del estuche están destinados para uso diagnóstico in vitro. Es necesario llevar guantes de uso único en el momento de la manipulación de los reactivos y de las muestras, así como lavarse las manos cuidadosamente después de su manipulación. No se debe pipetear con la boca. El material de origen humano utilizado para la preparación del control negativo ha sido sometido a un test y encontrado negativo en cuanto al antígeno VIH1, a los anticuerpos anti-vih1 y VIH2, al antígeno HB, al anticuerpo anti-vhc y a los anticuerpos anti HTLV1/HTLV 2 El control positivo ha sido inactivado al calor en presencia de un agente disociador Dado que ningún método puede garantizar de modo absoluto la ausencia de virus VIH, de virus de la hepatitis B o C o de otros agentes infecciosos, estos reactivos, así como las muestras de pacientes, son potencialmente infecciosas y deben ser manipuladas con las precauciones habituales. Los materiales que entren en contacto directo con las muestras y los reactivos, así como las soluciones de lavado, se considerarán como productos contaminados. Se evitará cualquier salpicado de las muestras o de las soluciones que las contienen. Las superficies manchadas se limpiarán con lejía diluida al 10%. Si el líquido que contamina es un ácido, las superficies manchadas se neutralizarán previamente con bicarbonato sódico y luego se limpiarán con la ayuda de lejía y se secarán con papel absorbente. El material utilizado para la limpieza se desechará en un contenedor especial para desechos contaminados. Las muestras, los reactivos de origen humano y el material y los productos contaminados se eliminarán después de su descontaminación: - ya sea mediante remojo en lejía a la concentración final del 5% de hipoclorito sódico (1 volumen de lejía para 10 volúmenes de líquido contaminado o de agua) durante 30 minutos. - ya en el autoclave a 121 C durante 2 horas como mínimo. ATENCIÓN : NO SE DEBEN INTRODUCIR EN EL AUTOCLAVE SOLUCIONES QUE CONTENGAN HIPOCLORITO SÓDICO. La ficha de datos sobre la seguridad está disponible a petición. Se evitará cualquier contacto con la piel y las mucosas del tampón substrato, del cromógeno y de la solución de interrupción (riesgos de toxicidad, de irritación y de quemaduras). Se procurará no omitir la neutralización o el proceso de autoclave de las soluciones o los efluentes de lavado o de todo líquido que contenga muestras biológicas antes de desecharlos en el fregadero. Por otra parte, la manipulación y la eliminación de los productos químicos se llevarán a cabo de acuerdo con las buenas prácticas de laboratorio. Algunos reactivos contienen azida sódica como conservante. La azida sódica puede formar azidas de plomo o de cobre en las tuberías del laboratorio. Estas azidas son explosivas. Para evitar cualquier acumulación de azidas, se enjuagarán con abundante agua las tuberías si las soluciones que contienen azida se eliminan por el fregadero después de su inactivation. Algunos reactivos contienen ProClin 300 (0,04%, 0,1% y/o 0,5%). Xi Irritante R43 : Puede causar una sensibilización al contacto con la piel. S28-37 : Si se produce un contacto con la piel, lávese de inmediato con agua y jabónabundantes. Utilice guantes adecuados. 6 - PRECAUCIONES La calidad de los resultados depende del respeto de las buenas prácticas de laboratorio siguientes : El nombre del test, así como su número de identificación específico se indican en la caja de cada microplaca. Este número de identificación específico figura igualmente en cada tira. Genscreen HIV-1 Ag Assay : Número específico de identificación = 49 Esta identificación se tiene que verificar antes de cada uso. Las tiras que no tengan el número de test o que sea diferente al del test realizado, no se deben utilizar. 19

6 No se utilizarán los reactivos después de la fecha de caducidad. No se modificará el modo operatorio. Se reconstituirán con sumo cuidado los reactivos y se evitará cualquier contaminación. No mezclar en un mismo ensayo reactivos que procedan de lotes diferentes. NOTA : se pueden utilizar otros lotes de solución de lavado (R2, identificación en la etiqueta : 20X color verde), de tampón sustrato (R8, identificado TMB buf. en azul), de cromógeno (R9, identificado TMB 11X. en violeta) y de solución de parada (R10, identificado 1N en rojo), diferentes a los suministrados en el kit siempre y cuando se utilice un mismo y único lote durante todo el ensayo. Estos reactivos también pueden utilizarse con otros productos de nuestro laboratorio. Además, la solución de lavado (R2, identificación en la etiqueta : 20X color verde) se puede mezclar con las otras 2 soluciones de lavado incluidas en los distintos kits de reactivos de Bio- Rad (R2, identificaciones en la etiqueta: 10X color azul o 10X color naranja) cuando se reconstituyen debidamente, siempre que se use sólo una mezcla en cada tanda de pruebas. Contacte con nuestros servicios técnicos para una información más detallada. Antes de la utilización, se esperarán 30 minutos para que los reactivos se equilibren a la temperatura del laboratorio (18-30 C). No se llevará a cabo el test en presencia de vapores reactivos (ácidos, alcalinos, aldehídos) o de polvos que pudieran alterar la actividad enzimática de los conjugados. Se utilizarán frascos de vidrio perfectamente lavados y enjuagados con agua destilada o, con preferencia, material de uso único. No se dejará secar la microplaca entre el final del lavado y el principio de la distribución de los reactivos. Se verificará la exactitud y la precisión de las pipetas y el buen funcionamiento de los aparatos utilizados. Lavado : es indispensable respetar escrupulosamente los procedimientos de lavado con el fin de obtener los resultados máximos del test. No se utilizará jamás el mismo recipiente para distribuir el conjugado y la solución de revelado. La reacción enzimática es muy sensible a todo metal o iones metálicos. En consecuencia, ningún elemento metálico deberá entrar en contacto con las diferentes soluciones que contienen los conjugados o el substrato. La solución de revelado (tampón sustrato + cromógeno) debe estar coloreada en rosa. La aparición de otra coloración en los minutos siguientes a la reconstitución indica que el reactivo es inutilizable y se debe sustituir. Para esta preparación, utilizar preferentemente recipientes y material de distribución de plástico de uso único o una cristalería previamente lavada con ácido clorhídrico 1N y perfectamente aclarada con agua destilada y secada. Conservar esta preparación protegida de la luz. 7 - MUESTRAS Se obtendrá una muestra de sangre según las prácticas habituales. Las muestras que se pueden utilizar son: suero, plasma o las muestras de cultivo celular. Los anticoagulantes EDTA, heparina, citrato sódico, CPDA-1 y ACD han sido evaluados y están considerados como utilizables. La cantidad de las muestras obtenidas con la ayuda de tubos anticoagulantes deberá llegar hasta la altura del nivel indicado, con el fin de evitar una mala dilución. Se extraerá cuanto antes el suero o el plasma del coágulo o de los glóbulos rojos para evitar cualquier hemólisis. Una hemólisis muy pronunciada puede afectar los resultados del test. Las muestras que tengan agregados han de ser clarificadas mediante centrifugación antes del test. Las partículas o los agregados de fibrina en suspensión pueden dar resultados falsamente positivos. Las muestras de cultivo de células que necesitan una dilución antes de su utilización pueden diluirse con un medio de cultivo celular equivalente al medio utilizado para el cultivo. NO SE UTILIZARÁN MUESTRAS INACTIVADAS POR EL CALOR. Las muestras se conservarán a C si la detección se lleva a cabo durante los 7 días posteriores a su obtención, o bien se pueden conservar congeladas a -20 C. Los plasmas se someterán a un descongelado rápido por calentamiento durante varios minutos a 40 C (para limitar la precipitación de fibrina). Debido a la inestabilidad del Ag VIH al calor, no se podrán utilizar temperaturas superiores a 40 C. Las muestras que han sido congeladas y descongeladas más de 3 veces no se deberán utilizar. Si las muestras deben ser transportadas, habrá que embalarlas según los reglamentos existentes para el transporte de agentes etiológicos. Se extraerá cuanto antes el suero o el plasma del coágulo o de los glóbulos rojos para evitar cualquier hemólisis. NO SE UTILIZARÁN SUEROS O PLASMAS CONTAMINADOS, HYPERLIPÉMICOS O HIPERHEMOLIZADOS. Observación: no se ha observado interferencia alguna en las muestras que contenían 80 mg/l de bilirrubina, 36 mg/l de inmunoglobulina M o G, así como en las muestras lipémicas que contenían hasta 5 g/l de lípidos y en las muestras hemolizadas que contenían hasta 5 g/l de hemoglobina. 8 - RECONSTITUCIÓN DE LOS REACTIVOS Todos los reactivos deben estar a temperatura ambiente (18 a 30 C) antes de su utilización, con excepción de los conjugados concentrados 1 y 2 (R4 y R5). 20

7 Reactivos listos para su empleo: Reactivo R1 : Microplaca Cada soporte marco que contiene 12 tiras está incluido en una bolsa aluminio sellada. Abrir la bolsa con unas tijeras o un escalpelo de 0,5 a 1 cm por encima del la soldadura. Sacar el marco y volver a introducir inmediatamente en la bolsa las tiras no utilizadas. Cerrar la bolsa cuidadosamente y volver a guardarla a +2-8 C. Reactivo R3 : Disolvente para Muestras Reactivo C0 : Control Negativo Reactivo C1 : Control Positivo Reactivo R10 : Solución de Interrupción Reactivos para reconstituir: Solución de Lavado Concentrada 20X (R2) Diluya al 1:20 en agua destilada para obtener una solución de lavado lista para su uso. Prepare 800 ml para una placa de 12 tiras. Solución de Trabajo Conjugado 1 (R4 + R6) y Solución de Trabajo Conjugado 2 (R5 + R6) Los conjugados 1 (R4) y 2 (R5) son unas soluciones concentradas (100X). Se prepara por separado la solución de trabajo conjugado 1 y la solución de trabajo conjugado 2 diluyendo cada una de ellas al 1:101 en el disolvente de conjugado (R6). Se lleva a cabo la preparación en recipientes limpios de plástico. Se inscribe sobre el recipiente el número de lote, la fecha y la hora de preparación, y la fecha de los conjugados concentrados (1 o 2), así como la hora límite de utilización (24 horas después de la preparación). Se mezclan despacio las soluciones de trabajo antes de su utilización. Una vez mezcladas, la solución de trabajo conjugado 1 es amarilla y la solución de trabajo conjugado 2 es verde. Preparación de la solución de trabajo conjugado 1 o 2 por tira Número de tiras necesarias * 24** Cantidad de conjugado concentrado (μl) Cantidad de disolvente de conjugado (ml) *una placa entera; ** dos placas enteras Solución de Revelado Enzimático (R8 + R9) Se diluye R9 en R8 al 1/11 (ejemplo : 1 ml de reactivo R9 en 10 ml de reactivo R8) a sabiendas de que 10 ml son necesarios y suficientes para tratar 12 tiras. Se homogeneiza. 9 - VALIDEZ CONSERVACIÓN El estuche debe conservarse a C. Cada elemento del estuche Genscreen HIV-1 Antigen Assay conservado a C se puede utilizar después de una primera abertura hasta la fecha de caducidad indicada sobre el estuche, salvo indicación específica: R1 : Una vez abierta la bolsa sellada al vacío, las tiras de micropocillos almacenadas a +2-8 C en la bolsa cuidadosamente sellada se pueden usar durante 1 mes. R2 : La solución de lavado diluida se puede conservar a temperatura ambiente (2-30 C) durante 2 semanas. La solución de lavado concentrada (R2) se puede conservar a C. R8 + R9 : Después de su reconstitución, el reactivo almacenado en la oscuridad se puede usar durante 6 horas a temperatura ambiente (18-30 C). R4 - R5 : Después de su reconstitución, los reactivos se pueden usar durante 24 horas a temperatura ambiente (18-30 C) MODO OPERATORIO A continuación se presentan dos procedimientos para la detección del antígeno p24 del VIH-1 en el suero o en el plasma humanos o en muestras de cultivo celular : 21

8 Procedimiento Incubación Conjugado 1 Incubación 37 ± 1 C, calor seco, 30 ± 5 min. 40 ± 1 C, calor seco, 30 ± 5 min. Conjugado 2 Incubación 37 ± 1 C, calor seco, 30 ± 5 min. 40 ± 1 C, calor seco, 30 ± 5 min. Revelado colorimétrico 18 to 30 C, in the dark, 30 ± 5 min. 18 to 30 C, en la oscuridad, 30 ± 5 min. Incubación 37 C Incubación 40 C 37 ± 1 C, calor seco, 60 ± 5 min. 40 ± 1 C, calor seco, 60 ± 5 min. Para las muestras sometidas a un test en un principio a 37 o 40 C, todo nuevo test o toda confirmación deberán efectuarse de acuerdo con el mismo procedimiento. La duración indicativa de este test es de cerca de 3h30-4h00 a partir del inicio de la primera etapa de incubación. Cada ciclo del procedimiento de utilización del test debe efectuarse íntegramente y sin interrupción una vez comenzado. Sobre cada placa se deben realizar dos controles positivos y tres controles negativos. En caso de que el test sea efectuado con muestras de células, son necesarios tres controles negativos de medio de cultivo celular, en lugar del control negativo del estuche (C0). El umbral de reactividad para las muestras de pacientes se determina con arreglo a las señales obtenidas con los controles de cada placa individual. Se evitará la exposición a la luz de las placas durante la última etapa de incubación (después de añadir la solución de trabajo TMB). Se ha de seguir estrictamente el protocolo propuesto y aplicar las buenas prácticas de laboratorio: 1. Establecimiento cuidadoso del plan de distribución y de identificación de las muestras 2. Preparación de la solución diluida de lavado 3. Extracción del marco soporte y las tiras (R1) del embalaje protector 4. Disposición directa, sin lavado previo de la placa y sucesivamente (sugerencia de plan de distribución de la placa) : μl de disolvente de muestra en cada pocillo μl de control negativo (C0) en A1-B1-C μl de control positivo (C1) en D1-E μl de muestra en G1, etc. En función del sistema utilizado, se puede modificar la posición o el orden de distribución de los controles. En caso de que el test se lleve a cabo con muestras de células, son necesarios tres controles negativos de medio de cultivo celular en lugar del control negativo del estuche (C0). Es preciso asegurarse de que el disolvente de muestra está bien mezclado con la muestra (o con el control). NB : la distribución de las muestras y del disolvente de muestras se puede controlar visualmente en este estadio de la manipulación: el disolvente de muestra cambia del verde al azul para señalar que la muestra o el control han sido añadidos en el pozo. Cuando las soluciones contenidas en cada pozo están bien mezcladas, tienen un color uniforme. Puede que las muestras de cultivo celular no cambien de color con arreglo al medio de cultivo utilizado.(para la comprobación automática es preciso referirse al capítulo 12 - VERIFICACIÓN ESPECTROFOTOMÉTRICA DEL PIPETEADO DE LAS MUESTRAS). 5. Cuando sea posible, se cubrirá con una película autoadhesiva, procurando apretar bien toda la superficie para asegurar la impermeabilidad. 6. Se incuba la placa durante 60 ± 5 minutos a 37 ± 1 C o a 40 ± 1 C con una incubadora estática de calor seco. 7. Se retira la película adhesiva. Se aspira el contenido de todos las pocillos en un contenedor para desechos contaminados (que contenga hipoclorito sódico) y se añade inmediatamente en cada una de ellas un mínimo de 0,370 ml de solución de lavado. Se respeta un tiempo de remojo (tiempo de espera) de 20 a 60 segundos. Se aspira de nuevo. Se repite el lavado 4 veces (un mínimo de 5 lavados). El volumen residual debe ser inferior a 10 μl (si es necesario, se ha de secar la placa dándole la vuelta sobre una hoja de papel absorbente). Si se dispone de un lavador automático, se ha de respetar el mismo ciclo operatorio 8. Se distribuyen rápidamente 100 μl de la solución de trabajo conjugado 1 en todos las pocillos. El conjugado se ha de agitar antes de su empleo. N.B : La distribución de la solución de trabajo del conjugado 1 que está coloreada de color amarillo se puede verificar visualmente en este estadio de la manipulación. 9. Si es posible, se recubre la microplaca con una nueva película. Se incuba 30 ± 5 minutos a 37 ± 1 C o a 40 ± 1 C en una incubadora estática de calor seco. 10. Se retira la película adhesiva. Se aspira el contenido de todos las pocillos en un contenedor para desechos contaminados (que contenga hipoclorito sódico) y se añade inmediatamente en cada una de ellas un mínimo de 0,370 ml de solución de lavado. Se respeta un tiempo de remojo (tiempo de espera) de 20 a 60 segundos. Se aspira de nuevo. Se repite el lavado 4 veces (un mínimo de 5 lavados). El volumen residual debe ser inferior a 10 μl (si es necesario, se secará la placa dándole la vuelta sobre una hoja de papel absorbente). 22

9 11. Se distribuyen rápidamente 100 μl de la solución de trabajo conjugado 2 en todos los pocillos. El conjugado se debe agitar antes de su empleo. N.B : La distribución de la solución de trabajo del conjugado 2 que está coloreada de verde se puede verificar visualmente en este estadio de la manipulación. 12. Si es posible, se recubre la microplaca con una nueva película. Se incuba 30 ± 5 minutos a 37 ± 1 C o a 40 ± 1 C en una incubadora estática de calor seco. 13. Se retira la película adhesiva, se vacían todos los pocillos por aspiración y se lavan por lo menos 5 veces, como anteriormente. El volumen residual debe ser inferior a 10 μl (si es necesario, se secan las tiras dándoles la vuelta sobre una hoja de papel absorbente). 14. Distribuir rápidamente en todos los pocillos 100 μl de la solución de revelado de la actividad enzimática (R8 + R9) previamente preparada. Dejar que la reacción se desarrolle en la oscuridad durante 30 ± 5 minutos a temperatura ambiente (18 a 30 C). Durante esta incubación, no utilizar película adhesiva. N.B : La distribución de la solución de revelado, que presenta un color rosa, puede controlarse visualmente en esta etapa de la manipulación: hay una diferencia de coloración significativa entre un pocillo vacío y un pocillo que contiene la solución de revelado rosada (ver apartado 12 para la comprobación automática COMPROBACIÓN ESPECTROFOTOMÉTRICA DE LA DISTRIBUCIÓN DE LAS MUESTRAS Y DE LOS REACTIVOS). 15. Añadir 100 μl de solución de parada (R10) manteniendo la misma secuencia y el mismo ritmo de distribución que para la solución de revelado. Homogeneizar la mezcla de reacción. N.B : La distribución de la solución de parada, que es incolora, puede controlarse visualmente en esta etapa de la manipulación. La coloración del sustrato, rosa (en caso de muestras negativas) o azul (en caso de muestras positivas), desaparece de los pocillos que se vuelven incoloros (si las muestras son negativas) o amarillos (si las muestras son positivas) tras la adición de la solución de parada. 16. Limpiar cuidadosamente la parte inferior de las placas. Esperar un mínimo de 4 minutos tras la distribución de la solución de parada y, en los 30 minutos siguientes a la parada de la reacción, leer la densidad óptica a 450/ nm con un lector de placas. 17. Antes de la transcripción de los resultados es preciso asegurarse de la concordancia entre la lectura y el plan de distribución y de identificación de las placas y de las muestras CÁLCULO E INTERPRETACIÓN DE LOS RESULTADOS 1 - Validación del ensayo Un test es válido si se cumplen los criterios siguientes: Los valores de absorbancia individuales de los controles negativos (o controles de medio de cultivo de células, si llega el caso) deben ser superiores a 0,000 UA e inferiores o iguales a 0,100 UA. Uno de los valores de absorbancia de uno pocillo del control negativo se puede eliminar si está situado fuera de estas normas. La media de los controles negativos se puede calcular en este caso a partir de ambos valores restantes de absorbancia. Si dos controles negativos o más no respetan estos criterios, la dosificación se debe efectuar de nuevo. Las absorbancias medias de los controles positivos deben ser superiores o iguales a 0,500 UA y el valor de absorbancia de cada control positivo debe estar situado en el ámbito de reproducibilidad de 0,65 a 1,35 veces la media de los controles positivos. Todos los valores de absorbancia de los controles positivos se deben tomar en consideración. 2 - Cálculo de la media de las absorbancias A partir de los controles validados, se determinan las absorbancias medias de los controles negativos y positivos dividiendo la suma de sus valores de absorbancia por el número de controles utilizados. 3 - Cálculo del valor umbral El valor umbral se calcula sumando un factor constante (0,070) al valor de absorbancia media de los controles negativos (CNX). Valor umbral = 0,070 + CNX Ejemplo : CNX = 0,033 - Valor umbral = 0, ,033 = 0, Interpretación de los resultados La presencia o la ausencia del antígeno VIH-1 se determinan comparando para cada muestra la absorbancia registrada con la del valor umbral calculado. Las muestras cuyos valores de absorbancia sean inferiores a 0,000 se deben someter a un nuevo test. Las muestras cuyos valores de absorbancia sean superiores a los límites de linealidad del lector están consideradas como reactivas. Las muestras cuyos valores de absorbancia sean inferiores al valor umbral están consideradas como no reactivas al test Genscreen HIV-1 Antigen Assay y pueden ser consideradas como negativas para el antígeno VIH-1. En este caso, no es necesario efectuar otro test. 23

10 Las muestras cuyos valores de absorbancia sean superiores o iguales al valor umbral están consideradas como inicialmente reactivas al test Genscreen HIV-1 Antigen Assay. Las muestras inicialmente reactivas se deben someter a un nuevo test dos veces, con el fin de validar los resultados del test inicial. Si después de estos nuevos tests los dos nuevos valores de absorbancia obtenidos son inferiores al valor umbral, el resultado inicial no es reproducible y la muestra de origen se considera negativa para el antígeno VIH-1 según el test Genscreen HIV-1 Antigen. El origen de las reacciones no reproducibles está a menudo relacionado con las causas siguientes: lavado insuficiente de las microplacas, contaminación cruzada de muestras no reactivas por una muestra con fuerte valoración de antígeno VIH-1. contaminación puntual de la solución de revelado por agentes químicos oxidantes (lejía, iones metálicos, etc.). contaminación puntual de la solución de interrupción. Si después de repetir el ensayo, el valor de absorbancia medido sobre uno de ambos dobletes es superior o igual al valor umbral, el resultado inicial es reproducible y la muestra se considera reactiva según el test Genscreen HIV-1 Antigen, conforme a los límites descritos a continuación. Las muestras cuya reactividad ha sido repetida con el test Genscreen HIV-1 Antigen Assay se deben confirmar con el test Genscreen HIV-1 Antigen Confirmatory Assay (código : 71121). La muestra se puede considerar como positiva para el antígeno VIH-1 solamente si el antígeno VIH-1 queda neutralizado en el momento del procedimiento de confirmación VERIFICACIÓN ESPECTROFOTOMÉTRICA DEL PIPETEADO DE LAS MUESTRAS Y DE LOS REACTIVOS Verificatión espectrofotométrica del pipeteado de las muestras Después de la distribución sucesiva del disolvente de las muestras (R3) y luego de las muestras, es posible verificar la presencia de las muestras que hay que someter a un test en los pocillos mediante una lectura espectrofotométrica de 620 nm: la densidad óptica de una pocillo que contiene una muestra deberá ser superior a 0,250 (una DO inferior indica una mala distribución de ésta). Observación : las muestras de cultivo celular pueden no cambiar color con arreglo al medio utilizado de cultivo. En este caso, no se aplica esta comprobación automática. Verificatión espectrofotométrica de la distribución de la solución de revelado Se puede comprobar la presencia de la solución de revelado rosada mediante la lectura automática a 490 nm: un pocillo que contiene la solución de revelado debe tener una densidad óptica superior a 0,100 (una DO más baja indica una distribución incorrecta de la solución de revelado). Existe una diferencia de coloración significativa entre un pocillo vacío y un pocillo que contiene la solución de revelado rosada RESULTADOS Sensibilidad diagnóstica 138 muestras de pacientes infectados por el VIH en diferentes estadios de la infección (AIDS, ARC, otros) fueron sometidas a un test y dieron positivo con el test Genscreen HIV-1 Antigen Assay. Se han estudiado 20 grupos de seroconversión bien documentados. Los resultados obtenidos son comparables a los resultados obtenidos con otros tests de dosificación del antígeno HIV. Como minimo 64 muestras con seroconversion temprana se analizaron con el Genscreen HIV-1 Antigen Assay. 55 sobrenadantes de cultivos celulares de VIH1 (entre ellos 53 del grupo M y 2 del grupo O), así como el grupo de dilución Ag VIH SFTS 96, dieron positivo con el test Genscreen HIV-1 Antigen Assay, a excepción de 2 diluciones de un sobrenadante de cultivo celular de grupo O. - Los 53 sobrenadantes de cultivos celulares de VIH1 de grupo M estaban compuestos por los siguientes genotipos: 10 del genotipo A, 10 de B, 9 de C, 5 de D, 11 de E, 2 de F, 2 de G, 1 de H, 2 de J y 1 de N. - El grupo de dilución Ag VIH SFTS 96 comprende los genotipos siguientes: A, B, C, D, E, F, G, H del grupo M y 1 genotipo de grupo O. Sensibilidad analítica El limite de detección del primer panel internacional del WHO NIBSC código 90/636 ha sido valorado inferior a 2 IU/ml y calculado a 0.36 UI/ml con un intervalo de confianza de 95% [ IU/ml] con 3 lotes durante un estudio interno. El umbral de sensibilidad del test ha sido evaluado con una serie de diluciones preparadas según el estándar nacional francés (lisado vírico purificado de genotipo B diluido en plasma citrado negativo), así como el grupo BBI (PRA 801). En el momento de estos ensayos, el umbral de detección tenía un valor de 8 pg/ml de antígeno HIV, sea cual sea el protocolo utilizado. La gama de amplitud obtenida con el estándar HIV-1 Ag Standard (código 72217) de Bio-Rad es lineal de 0 a 5 IU/ml (o 0 a 100 pg/ml). 24

11 Especificidad diagnóstica La especificidad diagnóstica del test, determinada a partir de una población de 4038 donantes de sangre, se estima en un 99,95%. En 209 pacientes clínicos se estimó al 100%. Se sometió a un test un grupo de 105 muestras de pacientes. Comprendía muestras : Que contenían anticuerpos dirigidos contra HAV, HCV, HTLV, HSV, EBV, Rubeola, Toxoplasma Gondii, Treponema pallidum, CMV. Que contenían autoanticuerpos, índices elevados de IgG, de IgM de factor reumatoideo Provenientes de mujeres embarazadas, de enfermos con cirrosis, de pacientes que habían recibido muchas transfusiones y de pacientes cons lupus eritematoso generalizado. Sólo se encontró una muestra reactiva con el test Genscreen HIV-1 Antigen Assay, proveniente de un pacientes con lupus eritematoso generalizado, pero no fue confirmada con el test de confirmación. Precisión Se estudió la reproducibilidad dentro del mismo ensayo sometiendo a test 3 muestras positivas y 1 negativa, 30 veces cada una, durante el mismo ensayo. Se estudió la reproducibilidad entre ensayos diferentes sometiendo a test 3 muestras positivas y 1 negativa por triplicado durante 5 días, por dos técnicos diferentes. Los coeficientes de variación obtenidos con las muestras positivas sometidas a un test fueron inferiores al 10% LÍMITES DEL TEST El procedimiento del test Genscreen HIV-1 Antigen Assay y el modo de interpretación de los resultados se deben utilizar para la búsqueda del antígeno VIH-1 en muestras de suero, de plasma o de cultivos celulares. Se recomienda a los usuarios de este estuche que lean con atención la presente nota de utilización antes de llevar a cabo el test. Es importante respetar los procedimientos del test, en particular en lo relativo al pipeteado de las muestras y de los reactivos, al lavado de las placas y a la duración de las etapas de incubación. No se debe considerar que una muestra es como reactiva al el antígeno VIH-1 a partir de un solo resultado reactivo. Con el fin de establecer la especificidad de la reactividad de cada muestra según este test, es necesario efectuar nuevas dosificaciones, por ejemplo, un test de confirmación. Todo test inmunoenzimático altamente sensible puede estar sujeto a reacciones no específicas que pueden dar lugar a resultados falsamente positivos. La proporción de las muestras reactivas falsamente reactivas depende de la sensibilidad y de la especificidad del estuche utilizado. Se pueden obtener resultados negativos con muestras cuyo índice de antígeno VIH es demasiado bajo en comparación con los límites de detección del test y, asimismo, se pueden observar resultados negativos si el marcador buscado no está presente en el estadio de la enfermedad en que se obtuvo la muestra. La variabilidad del virus VIH no permite excluir la posibilidad de reacciones falsamente negativas. Ningún método conocido puede ofrecer la seguridad de que el virus VIH está ausente. Si la adición de muestra o de reactivo no se ha llevado a cabo conforme a las instrucciones, es posible obtener un resultado falsamente negativo. En caso de sospecha clínica de infección o de error en el curso del procedimiento se debe prever el efectuar una nueva dosificación. Un valor de absorbancia inferior a 0,000 UA señala un error en el curso del procedimiento o un problema vinculado al material. Se debe someter a un nuevo test la muestra concernida. Los factores que pueden afectar la validez de los resultados son los siguientes : depósito deficiente de la muestra en el pozo, mal lavado de los pocillos de las microplacas, incumplimiento de los tiempos y de las temperaturas de incubación indicados, errores en los depósitos de los reactivos, presencia de metales o de lejía en los pocillos. Las realizaciones de este test no han sido evaluados con muestras post mortem o con otros fluidos biológicos aparte de suero o plasma o muestras de cultivo celular. La sensibilidad analítica, considerada como 8 pg/ml en el momento de las evaluaciones del test, puede variar con arreglo a las condiciones operatorias y a la variabilidad entre los lotes. En consecuencia, Bio-Rad sólo puede garantizar una sensibilidad analítica inferior a 15 pg/ml. La coloración del disolvente de las muestras puede no modificarse en presencia de muestras de cultivo celular, en función del medio de cultivo utilizado. El método colorimétrico de comprobación de la distribución de las muestras y/o de los conjugados y/o de la solución de revelado no permite comprobar la exactitud de los volúmenes dispensados: únicamente indica la presencia de muestras y/o de conjugados y/o de la solución de revelado. El grado de respuestas erróneas obtenidas con este método está en relación con la precisión del sistema utilizado (los CV acumulados de pipeteo y de lectura superiores al 10% pueden rebajar significativamente la calidad de esta comprobación). En el caso de un lavado incorrecto tras la etapa de incubación del conjugado, la comprobación automática de la distribución de la solución de revelado (mediante la lectura a 490 nm de las densidades ópticas de los pocillos) puede dar resultados erróneos con densidades ópticas superiores a 0,100 en ausencia de solución de revelado. Sin embargo, este fenómeno no se ha observado durante las evaluaciones realizadas en 939 muestras ensayadas. 25

12 15 - REFERENCIAS BIBLIOGÁFICAS 1. Barre-Sinoussi F, Chermann JC, Rey F, et al: Isolation of T-lymphotropic retrovirus from a patient at risk for acquired immune deficiency syndrome(aids). Science 220: , Gallo RC, Salahuddin SZ, Popovic M, et al: Frequent detection and isolation of cytopathic retroviruses (HTLVlll) from patients with AIDS and at risk for AIDS. Science 224: , Coffin J, Haase A, Levy JA, et al: What to call the AIDS virus? Nature 321:10, Van der Graff M, Diepersloot R: Transmission of human immunodeficiency virus (HIV/ HTLV-III/ LAV): a review, Infection 14: , Weis R: Retrovirus and human disease. J Clin Pathol 40: , Tovo P, Gabiano C, Riva C, et al: Specific antibody and virus antigen expression in congenital HIV infection, Lancet 1:1201, Tegtmeier G: Current tests for serologic detection of HlV-1 infection. J Clin lmmunoassay 11: , Schumacher R, Garrett P, Tegtmeier G, et al: Comparative detection of anti-hiv in early HIV seroconversion. J Clin lmmunoassay 11: , Casey JM, Kim Y, Andersen PR, et al: Human T-cell lymphotropic virus type III: immunologic characterization and primary structure analysis of the major internal protein, p24. J Virology 55: , Ritter J, Escaich S, Trepo C, et al: HIV antigen detection in antibody negative sera. Abstract 1627, IV International Conference on AIDS, Veronese FD, Sarngadharan MG, Rahman R, et al: Monoclonal antibodies specific for p24, the major core protein of human T-cell Leukemia virus type III. Natl Acad Sci USA, 82: , Schaeffler B, Flesher A, Shriver K, Tam MR: Monoclonal antibody detection of p25 HIV antigen in the serum and CSF of patients within the AIDS spectrum. Abstract 7759, IV International Conference on AIDS, Bos ES, van der Doelen AA, van Rooy N, Schurs AHWM: 3,3',5,5' - Tetramethylbenzidine as an Ames test negative chromogen for horseradish peroxidase in enzyme immunoassay. J lmmunoassay 2: , Garner RC, Walpole AL, Rose FL: Testing of some benzidine analogues for microsomal activation to bacterial mutagens. Cancer Letters 1:39-42, Resnick L, Veren K, Salahuddin SZ, et al: Stability and inactivation of HTLV-III/LAV under clinical laboratory environments. JAMA 255: , Sarngadharan MG, Markham PD: The role of human T-Lymphotropic retroviruses in leukemia and AIDS, in Wormser GP (ed.): AIDS and Other Manifestations of HlV Infection. New Jersey, Noyes Publications 1987, pp Bond WW, Favero MS, Petersen NJ, et al: Inactivation of Hepatitis B virus by intermediate-to-high level disinfectant chemicals. J Clin Micro 18: ,

13 (GB) - CE marking (European directive 98/79/CE on in vitro diagnostic medical devices) (FR) - Marquage CE (Directive européenne 98/79/CE relative aux dispositifs médicaux de diagnostic in vitro) (ES) - Marcado CE (Directiva europea 98/79/CE sobre productos sanitarios para diagnóstico in vitro) (IT) - Marchiatura CE (Direttiva europea 98/79/CE relativa ai dispositivi medico-diagnostici in vitro) (DE) - CE Konformitätskennzeichnung (Europäische Richtlinie 98/79/EG über In-vitro-Diagnostika) (PT) - Marcação CE (Directiva europeia 98/79/CE relativa aos dispositivos médicos de diagnóstico in vitro) (SE) - CE-märkning (Europeiskt direktiv 98/79/EG om medicintekniska produkter för in vitro-diagnostik) (DK) - CE-mærkningen (Europa direktiv 98/79/EF om medicinsk udstyr til in vitro-diagnostik) (GR) - CE ( 98/79/CE in vitro ) (PL) - CE oznaczenie (Dyrektywa unijna 98/79/CE dotycząca produktów medycznych do badań in vitro) (LT) - CE ženklas (Europos sąjungos direktyva 98/79/CE dėl in vitro diagnostikos medicinos prietaisų) (HU) - CE jelzés (98/79/CE Európai Irányelv az in vitro orvosi diagnosztikai eszközökről) (EE) - CE märgistus (Euroopa direktiiv 98/79/CE in vitro diagnostikameditsiiniseadmete kohta) (SK) - CE označenie o zhode (Európska direktíva 98/79/CE pre in vitro diagnostické zdravotnícke postupy) (CZ) - CE značka (Evropská direktiva 98/79/CE o diagnostických zdravotnických prostředcích in vitro) (NO) - CE-merking (EU-direktiv 98/79/CE om medisinsk utstyr til in vitro-diagnostikk) (RO) - Marca CE (Directiva europeana 98/79/CE pentru dispozitive medicale de diagnostic in vitro) (BG) - СЕ маркировка (Европейска директива 98/79/CE за ин витро диагностичните медицински изделия) (GB) - For in vitro diagnostic use (GB) - Catalogue number (FR) - Pour diagnostic in vitro (FR) - Référence catalogue (ES) - Para diagnóstico in vitro (ES) - Número de catálogo (IT) - Per uso diagnostico in vitro (IT) - Numero di catalogo (DE) - In-vitro-Diagnostikum (DE) - Bestellnummer (PT) - Para uso em diagnóstico in vitro (PT) - Número de catálogo (SE) - In vitro-diagnostik (SE) - Katalognummer (DK) - In vitro diagnose (DK) - Katalognummer (GR) - in vitro (GR) - (PL) - Do stosowania in vitro (PL) - Numer katalogu (LT) - in vitro diagnostikai (LT) - Katalogo numeris (HU) - Csak in vitro diagnosztikai alkalmazásra (HU) - Cikkszám (EE) - In vitro diagnostiliseks kasutamiseks (EE) - Katalooginumber (SK) - Na diagnostiku in vitro (SK) - Katalógové číslo (CZ) - Pro diagnostiku in vitro (CZ) - Katalogové číslo (NO) - Til in vitro-diagnostikk (NO) - Katalognummer (RO) - Pentru diagnostic in vitro (RO) - Număr de catalog (BG) - За ин витро диагностика (BG) - Каталожен номер (GB) - Manufacturer (GB) - Authorised Representative (FR) - Fabricant (FR) - Représentant agréé (ES) - Fabricante (ES) - Representante autorizado (IT) - Produttore (IT) - Distributore autorizzato (DE) - Hersteller (DE) - Bevollmächtigter (PT) - Fabricante (PT) - Representante Autorizado (SE) - Tillverkad av (SE) - Auktoriserad representant (DK) - Fremstillet af (DK) - Autoriseret repræsentant (GR) - (GR) - (PL) - Producent (PL) - Upoważniony Przedstawiciel (LT) - Gamintojas (LT) - Įgaliotasis atstovas (HU) - Gyártó (HU) - Meghatalmazott Képviselő (EE) - Tootja (EE) - Volitatud esindaja (SK) - Výrobca (SK) - Autorizovaný zástupca (CZ) - Výrobce (CZ) - Zplnomocněný zástupce (NO) - Produsent (NO) - Autorisert representant (RO) - Producător (RO) - Reprezentant autorizat (BG) - Производител (BG) - Упълномощен представител (GB) - Batch code (GB) - Expiry date YYYY/MM/DD (FR) - Code du lot (FR) - Date de peremption AAAA/MM/JJ (ES) - Código de lote (ES) - Estable hasta AAAA/MM/DD (IT) - Codice del lotto (IT) - Da utilizzare prima del AAAA/MM/GG (DE) - Chargen-Bezeichnung (DE) - Verwendbar bis JJJJ/MM/TT (PT) - Código do lote (PT) - Data de expiração AAAA/MM/DD (SE) - Batchnr (SE) - Utgångsdatum ÅÅÅÅ/MM/DD (DK) - Batchkoden (DK) - Anvendes før ÅÅÅÅ/MM/DD (GR) - (GR) - YYYY/MM/DD (PL) - Numer serii (PL) - Data ważności YYYY/MM/DD (LT) - Serijos numeris (LT) - Galioja iki YYYY/MM/DD (HU) - Gyártási szám (HU) - Szavatossági idő ÉÉÉÉ/HH/NN (EE) - Partii kood (EE) - Aegumistähtaeg AAAA/KK/PP (SK) - Číslo šarže (SK) - Použiteľné do RRRR/MM/DD (CZ) - Číslo šarže (CZ) - Datum exspirace RRRR/MM/DD (NO) - Partikode (NO) - Utløpsdato ÅÅÅÅ/MM/DD (RO) - Număr de lot (RO) - Data expirarii AAAA/LL/ZZ (BG) - Партиден номер (BG) - Срок на годност година/месец/ден

14 (GB) - Storage temperature limitation (FR) - Limites de températures de stockage (ES) - Temperatura límite (IT) - Limiti di temperatura di conservazione (DE) - Lagertemperatur (PT) - Limites de temperatura de armazenamento (SE) - Temperaturbegränsning (DK) - Temperaturbegrænsning (GR) - (PL) - Temperatura przechowywania (LT) - Saugojimo temperatūriniai apribojimai (HU) - Tárolási hőmérsékleti határok (EE) - Piirangud säilitustemperatuurile (SK) - Skladovacia teplota od do (CZ) - Teplotní rozmezí od do (NO) - Oppbevaringstemperatur (RO) - Limitele de temperatură la stocare (BG) - Температурни граници на съхранение (GB) - Consult Instruction for use (FR) - Consulter le mode d'emploi (ES) - Consulte las instrucciones de uso (IT) - Consultare le istruzioni per uso (DE) - Siehe Gebrauchsanweisung (PT) - Consulte o folheto informativo (SE) - Se bruksanvisningen (DK) - Se instruktion før brug (GR) - (PL) - Sprawdź instrukcję (LT) - Ieškokite informacijos vartojimo instrukcijoje (HU) - Olvassa el a használati utasítást (EE) - Kasutamisel vaata instruktsiooni (SK) - Katalógové číslo (CZ) - Viz návod k použití (NO) - Se bruksanvisninger (RO) - Consultati prospectul de utilizare (BG) - Виж инструкцията за употреба

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