DINÁMICA Y SINCRONIZACIÓN DE LAS ONDAS FOLICULARES EN VACAS DEL GENOTIPO SIBONEY DE CUBA

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1 DINÁMICA Y SINCRONIZACIÓN DE LAS ONDAS FOLICULARES EN VACAS DEL GENOTIPO SIBONEY DE CUBA R.G.Denis 1, A.D.Gil 2, D. S. Fuentes, Emilia Lliteras, M. G. Chog 1 Centro de Investigación para el Mejoramiento Animal de la Ganadería Tropical (CIMAGT). Avenida 101 No entre 100 y 62. Loma de Tierra, Cotorro, Ciudad de la Habana. Cuba. denis@cimaminag.cu RESUMEN 2 Universidad Agraria de La Habana (UNAH) Con el objetivo de caracterizar y sincronizar la dinámica del crecimiento folicular en vacas del genotipo Siboney de Cuba se analizaron 40 ciclos estrales pertenecientes a 20 vacas no lactantes de este genotipo. Las observaciones ecográficas se realizaron diariamente utilizando un equipo Aloka SSD-500 acoplado a un transductor convexo de 5 Mhz vía transvaginal. Cada 48 horas se tomaron muestras de sangre para determinar los niveles séricos de progesterona, para la sincronización de las ondas foliculares se utilizó el método físico (punción de todos los folículos a 5 mm de diámetro). Estadísticamente los datos fueron analizados utilizando el Modelo Lineal Generalizado (GLM) del paquete estadístico SAS. El 72.3 % de los ciclos estudiados presentaron tres ondas de crecimiento folicular, donde tanto las manifestaciones de celo como el período interovulatorio fueron significativamente mayores que en los animales que presentaron solo dos ondas (27,2 %). Se encontró durante todo el ciclo estral un predominio de folículos clase 1, independientemente del número de ondas y del origen de estas (natural o sincronizado). El inicio de la primera onda folicular se produjo independientemente del tipo de ciclo a los 0.5 días post ovulación y a los 1.7 días post punción en el caso de la onda sincronizada, sin que se obsevaran otras diferencias entre ambos tipos de ondas. El cuerpo lúteo pudo ser observado a partir de los tres días post ovulación, sin que se registraran diferencias significativas en los niveles máximos de progesterona entre los diferentes ciclos. Palabras clave: dinámica folicular, sincronización ABSTRACT DYNAMICS AND SYNCHRONIZATION OF THE FOLLICULAR WAVES IN CUBA SIBONEY GENOTYPE COW To characterize and synchronize the follicular growing dynamic of the Siboney de Cuba genotype forty estrus cycles of 20 non-lactating cows were analyzed. Daily ultrasound scanned observations were made using an Aloka SSD-500 equipment coupled to a 5 MHz convex transducer used transrectaly. Blood samples were taken every 48 hours to determine seric levels of progesterone. The physical method was used to synchronize the follicular waves (puncture of all the oocytes to 5 mm of diameter). Data was statistically analyzed using a generalized lineal Rmodel (GLM).of the cycle studied 72.3% had three follicular waves. Oestrus onsets as well as the interovulatory period were significantly higher than in animals that had two follicular waves (27.2%). Throughout all the oestrus cycle there was a predominance of follicles class 1, regardless the amount and origin of the wave (natural or synchronized).the beginning of the first follicular wave regardless to the kind of cycle was 0.5 days post ovulation and 1.7 days post puncture in the case of the synchronized wave. No other differences were observed between both tyhes of waves. The corpus luteum was observed from the third day post ovulation. No significant differences were registered at the maximum levels of progesterone between the different cycles. Key Words: follicular dynamic, synchronization 23

2 INTRODUCCIÓN Desde el punto de vista conceptual la dinámica folicular no es más que el proceso continuo de crecimiento y regresión de los folículos antrales que conduce al desarrollo de un folículo preovulatorio (Lucy et al. 1992). Antiguamente los estudios relacionados con esta temática se realizaron mediante la observación de ovarios provenientes de vacas sacrificadas, ovariectomizadas, palpación transrectal o mediante el marcaje de las estructuras con tinta India (Pierson y Ginther 1987a). La variación en el tamaño de la población de los folículos antrales sugirió la ocurrencia de procesos dinámicos durante el ciclo estral bovino (Marion et al. 1968) citados por Murphy y Pescador (1996). Este fenómeno se confirmó a través de la ultrasonografía (Pierson y Ginther 1984, Sirois y Fortune 1988) demostrándose la ocurrencia de 1 a 4 ondas de desarrollo folicular durante el ciclo estral bovino (Ginther et al. 1996) y se definieron los patrones de crecimiento de los folículos mayores de 2 mm de diámetro (Savio et al. 1988, Taylor y Rajamahendran 1991). Los resultados de la dinámica folicular contribuyeron a mejorar la fertilidad, sincronizar el estro con mayor precisión, incrementar la respuesta superovulatoria y la cantidad de ovocitos recolectados en las sesiones de OPU, entre otros aspectos (Bridges y Fortune 2003, Patterson et al. 2003, Wiltbank et al. 2003). De ahí el interés de usar métodos (físicos u hormonales) para sincronizar las ondas de crecimiento folicular, la mayoría orientados a eliminar el efecto del folículo dominante, para iniciar el surgimiento de una nueva onda folicular en un período de tiempo conocido (Bo et al. 1994). La aplicación de estos conocimientos en el Siboney de Cuba puede contribuir a mejorar la eficiencia de otras biotecnologías reproductivas, por lo que el objetivo de este experimento es precisamente: Caracterizar y sincronizar la dinámica del crecimiento folicular en vacas de este genotipo. MATERIALES Y MÉTODOS Se analizaron 40 ciclos estrales pertenecientes a 20 vacas no lactantes del genotipo Siboney de Cuba (5/8 H 3/8 C) con una edad promedio de 8,3 años (±2.5 años) y condición corporal promedio 3.1 (escala de 0 a 5 puntos, según Álvarez (1996), mantenidas en condiciones de semiestabulación en áreas del Instituto de Ganadería Tropical (IGAT) alimentadas a base de pastos, forrajes, suplemento concentrado y libre acceso al agua de bebida. El estudio se realizó entre los meses de enero - abril. Las observaciones ecográficas se realizaron diariamente utilizándo un transductor convexo de 5 Mhz vía transvaginal (Broguiatti 1996) y la toma de muestras de sangre (venopunción yugular) para determinar los niveles séricos de progesterona cada 48 horas. Se utilizó el método físico (punción de todos los folículos a 5 mm de diámetro) para la sincronización de las ondas de crecimiento folicular y se mantuvieron las observaciones diariamente durante los siguientes 15 días. Para el análisis estadístico de los resultados se realizó un análisis de varianza utilizando el procedimiento de modelos lineales Generalizados (GLM) y las comparaciones múltiples de medias automáticas del paquete estadístico SAS (1996). RESULTADOS Y DISCUSIÓN 24

3 En todos los ciclos analizados se produjeron ondas de crecimiento folicular, y un predominio de ciclos (Tabla y Figura 1). con tres ondas (72.3 %), respecto a los de dos (27,2 %). Resultados similares fueron reportados por Savio et al. (1988), en razas de carne Friesan x Hereford (81 vs 15 %), Sirois y Fortune (1988), en novillas Holstein (70 vs 20 %), Bo (1995), Rhodes et al. (1995) en novillas y Brahman y Loayza. (1999), en vacas Siboney de Cuba, lo cual ha sido corroborado en nuestro trabajo. Tabla 1. Medidas relacionadas con la dinámica del crecimiento folicular en el genotipo Siboney de Cuba No. de ondas foliculares Medidas Dos (X ± SEM) Tres (X ± SEM) Porcentaje de ciclos (%) Intervalo 17.34±0.55 a 19.81±0.25 b ovulación celo (días) Intervalo 18.38±0.67 a 20.85±0.31 b interovulatorio (días) Día de la emergencia Onda ±0.41 a 0.5±0.62 a Onda 2 9.8±0.52 a 8.1±0.29 b Onda ±0.26 a,b Valores con superíndices diferentes dentro de una misma fila indican diferencias significativas (P<0.05) mm Figura.1 1(FD) 2 (FD) (FO) 1(FS) 2(FS) 3 (FS) Días del ciclo estral A Diámetro (mm) Figura 1. Media del diámetro de los folículos dominantes (FD), ovulatorios (FO) y subordinados (FS) en ciclos de tres (A) y dos (B) ondas de crecimiento folicular en el genotipo Siboney de Cuba Diás del ciclo estral B Onda 1 (FD) Onda2 (FO) Onda 1 (FS) Onda 2 (FS) Otros autores por el contrario reportan un predominio de ciclos con dos ondas de crecimiento folicular, Ginther et al en novillas Holstein (81.81 vs %), Figueredo et al. 1997en novillas Neffe (58.82 vs %) y Ahmad et al. (1997), en vacas y novillas Angus; así como en los cruzamientos de esta raza con Simmental y Hereford (86 vs 14 %) y Denis et al. (2001) en vacas del genotipo Criollo cubano. Aún no están totalmente claras las causas que inciden en la variabilidad 25

4 informada en cuanto al número de ondas foliculares (Bo. et al. 1996). Entre los factores que se han tratado de asociar a este fenómeno se encuentran: El estado productivo (Lucy et al. 1992), factores climáticos, de alimentación, genéticos y otros. (Badinga et al y Rhodes et al. 1995), la baja condición corporal se asocia con la ocurrencia de ciclos de tres oleadas (Burke et al. 1998). Otros por su parte consideran que los niveles de progesterona (P 4 ) desempeñan un papel decisivo (Savio et al y Sirois y Fortune 1990). Sin embargo, a pesar de ser esta teoría de las más aceptadas existen contradicciones, ya que existen trabajos que no encuentran relación entre los niveles de esta hormona y la ocurrencia de ciclos con dos o tres ondas (Ahmad et al. 1997, Figueredo et al. 1997). El día de la emergencia de la primera onda (0.5 días postovulación) no mostró diferencias significativas con el número de ondas foliculares, lo cual coincide con los reportes de otros investigadores (Figueredo et al. 1997, Loayza et al y Denis 2001). Esta característica, según Ko et al. (1991) se acerca a los reportes hallados en el Bos taurus, donde el inicio de la misma es muy cercano al día de la ovulación, mientras que para el Bos indicus se ha indicado su inicio después del primer día postovulación (Figueredo et al. 1997). En el inicio de la segunda onda (Tabla 2) se hallaron diferencias significativas (P< 0.05) entre los ciclos de dos o tres ondas, iniciándose esta más tardíamente (1.7 días) en ciclos de dos oleadas (9.8 vs 8.1 días).esto coincide con los datos de Ko et al. (1991) y Loayza (1999), quienes señalan el inicio de esta onda en animales Bos taurus entre los días 9 y 11. Rhodes et al. (1995) y Figueredo et al. (1997), por su parte hallaron el inicio de la segunda onda más tardíamente (alrededor del día 12), en animales Bos indicus. Tabla 2. Comportamiento de las ondas foliculares en los ciclos de dos y tres ondas de crecimiento folicular en el genotipo Siboney de Cuba. Observaciones Diámetro máximo FD (mm) Día del diámetro máximo Tasa crecimiento (mm/día) Clase I Onda 1 Folículo dominante Ciclo de Ciclo de dos tres ondas ondas (X±SEM) (X±EM) Onda 2 Folículo dominante Ciclo de tres ondas (X±SEM) Folículo ovulatorio Ciclo de Ciclo de dos ondas tres ondas (X±SEM) (X±SEM) 14.72± ± ±0.39 c 14.36± ±0.39 a 3 a 8 b 7 a 7.2±0.63 a 6.4±0.34 a 14.12±0.35 c 17.8±0.63 b 20.0±0.35 d 1.37±0.30 a 1.27±0.13 a 1.24±0.14 a 1.32±0.27 a 1.66±0.14 b Medias de folículos subordinados 10.8±5.2 10± ± ± ±3.9 Clase II 1.7± ± ±0.4 a,b,c,d Valores con superíndices diferentes dentro de una misma fila indican diferencias significativas(p<0.05). 26

5 Las diferencias significativas del día de emergencia de la segunda onda entre ciclos de una y dos ondas coincide plenamente con los hallazgos de Ginther et al. (1989) y Figueredo et al. (1997). Esto pudiera guardar relación con los niveles más bajos de P 4 encontrados en los ciclos de dos ondas, lo cual permitiría una mayor frecuencia en los pulsos de LH y por consiguiente mayor permanencia del folículo dominante. El inicio de la tercera onda ocurrió el día Estos resultados son menores a los señalados por Figueredo et al. (1997) quienes encontraron valores de 16.1 y 15.1 días respectivamente y coincidentes con los datos de Loayza (1999) para este genotipo (14.4 días). Las causas de las variaciones en el día de la emergencia de las ondas foliculares aún no son claras, sin embargo la presencia de factores genéticos y ambientales pudieran ejercer su influencia (Bo et al. 1995). En el caso de los animales que presentaron dos ondas de crecimiento folicular tanto las manifestaciones de celo, como el período interovulatorio, fue significativamente menor (P<0.05) que los que presentaron tres, resultados similares fueron obtenidos por Loayza (1999). Respecto al intervalo interovulatorio nuestros resultados (19.5 días) son ligeramente inferiores a los hallados por Ahmad et al. (1997) quienes reportaron para ciclos de dos ondas intervalos interovulatorios entre 20 y 23 días. El tamaño máximo de los folículos ovulatorios (Tabla 2), resultó similar en los ciclos de dos o tres ondas foliculares (14.36 y mm), lo que coincide con los datos de Loayza (1999), pero resultaron más pequeños que los indicados por Savio et al. (1988) para el Bos taurus (20.25 mm). No obstante coincidimos con estos autores respecto a que el tamaño del folículo ovolatorio es significativamente mayor (P<0.05) que los precedentes. Otros autores como Figueredo et al. (1997) obtuvieron mediciones del folículo dominante inferiores a las nuestras. El día de emergencia del folículo ovulatorio difirió significativamente para ambos tipos de ciclos (P<0.001). El período de tiempo (días) entre el surgimiento de una onda y la siguiente fue significativamente menor (P<0.05) en los ciclos de tres ondas, respecto a los de dos. Esto coincide con los hallazgos de Sirois y Fortune (1988), y Loayza (1999). Se encontró un efecto altamente significativo de la vaca (P<0.001) para los folículos de las diferentes clases en ambos tipos de ciclo, con un predominio de folículos clase I a lo largo de todo el ciclo, siendo mayor al inicio de cada onda folicular, para disminuir paulatinamente a medida que aumentan los de clase dos (fase media de la onda). Se observa una disminución de estos últimos al final de la onda donde la presencia de uno o dos folículos clase III fue el aspecto característico que llama la atención. Resultados similares fueron señalados por Loayza, (1999), Denis (2001). El tamaño máximo de los folículos ovulatorios (Tabla. 2) en ambos tipos de ciclo, coinciden con lo encontrado por Savio et al. (1988), pero difieren de otros autores quienes hallaron diferencias significativas tanto para el tamaño como para la tasa de crecimiento de los folículos ovulatorios (Ginther et al y Figueredo et al. 1997). En este caso solo encontramos diferencias significativas en cuanto a la tasa de crecimiento de folículo ovulatorio de la tercera onda folicular. La explicación fisiológica acerca de la disminución de la población folicular clases II y III antes de la emergencia del segundo folículo dominante en ambos tipos de ciclos puede basarse en el efecto que ejerce este folículo en dicha 27

6 población folicular. A este efecto Ireland y Roche (1987), lo han denominado período de dominancia folicular, donde según Findlay (1993), existen factores intraováricos como la inhibina, la actibina y la foliculoestatina implicados en este proceso así como en la atresia de los folículos subordinados. Independientemente del tipo de ciclo la observación del cuerpo lúteo (CL) fue posible alrededor del tercer día del ciclo (Tabla. 3). Esto coincide con las observaciones de Pierson et al. (1994), Figueredo et al. (1997), Loayza (1999) y Denis (2001). Tampoco se encontraron diferencias en cuanto el tamaño máximo del CL en ambos tipos de ciclo (22.4 y 22.9 mm para ciclos de dos y tres ondas respectivamente). Sin embargo, en los ciclos de tres ondas el tamaño máximo del cuerpo lúteo se alcanzó aproximadamente tres días más tarde que en los ciclos de dos ondas. Grygar et al. (1997) no encontraron relación entre la concentraciones de P 4 en sangre periférica y el tamaño del CL. Sin embargo, el menor tamaño encontrado en el folículo dominante de la segunda onda en los ciclos de tres oleadas pudiera guardar relación con los elevados niveles de progesterona encontrados en esta etapa del ciclo, similares resultados fueron reportados por Denis, (2001). Tabla 3. Características del cuerpo lúteo en los ciclos de dos o tres ondas de crecimiento folicular en hembras del genotipo Siboney de Cuba. Medidas Dos ondas (x ± SEM) No. de ondas foliculares Tres ondas (x ± SEM) Día de la detección 3.0 ± 0.48 a 3.0 ± 0.25 a Diámetro máximo (mm) 23.0 ± 0.80 a ± 0.48 a Día del diámetro máximo 9.0 ± 0.99 a ± 0.53 b Día de inicio de la regresión ± 0.71 a ± 0.31 b Intervalo regresiónovulación (días) ± 0.85 a 3.51 ± 0.36 a a y b Valores con superíndices diferentes dentro de una misma fila indican diferencias significativas (P<0.05). El día del inicio de la regresión luteal difiere significativamente entre ambos tipos de ciclos (P<0.05).El animal y el tipo de ciclo un efecto significativo (P<0.05) y se produjo antes (± 2.5 días) en los ciclos de dos ondas respecto a los de tres. Por otra parte el intervalo entre la regresión luteal y la ovulación fue similar entre ambos tipos de ciclo al igual que con Ginther et al. (1989). Los niveles máximos de progesterona no mostraron diferencias significativas en ambos tipos de ciclo. Sin embargo en los ciclos de dos ondas éstos se incrementaron más rápidamente. De modo general, los máximos valores de esta hormona se encontraron los días y 16 del ciclo estral (8.880, , y nmol/l respectivamente). El inicio de la onda folicular sincronizada se produjo 1.7 días post aspiración (Tabla No. 4 y Figura No. 2), resultados muy similares (1.5 días) a los observados por Bergfelt et al. (1994), y Denis (2001). 28

7 Tabla 4. Características del desarrollo folicular en la nueva onda sincronizada comparada con la normal. Medidas Ondas foliculares Sincronizada Normal Día de la emergencia 1.7 ± 0.21 a 0.7 ± 0.41 b Diámetro máximo FD (mm) ± 0.3 a ± 0.5 a Día del diámetro máximo 7.2 ± 0.41 a 7.5 ± 0.53 a Tasa de crecimiento (mm) 1.25 ± 0.02 a 1.27 ± 0.09 a Día de la detección del cuerpo lúteo 3.0 ± 0.25 a 3.0 ± 0.36 a No. promedio de folículos subordinados clases I y II 7.05 ± 3.65 a 6.68 ± 2.45 a ayb Valores con superíndices diferentes dentro de una misma fila indican diferencias significativas (P<0.05). No se encontraron diferencias significativas en cuanto al diámetro del folículo dominante, su tasa de crecimiento y día en que alcanzó su diámetro máximo entre la onda normal y sincronizada. Esto coincide con los hallazgos de Puelker et al. (1999), García (2000), y Denis (2001). García et al. (2000) después de comparar varios métodos para sincronizar las ondas de crecimiento folicular (2.5 mg de 17 ß estradiol y 1 y 2 mg de Benzoato de Estradiol) obtuvieron los mejores resultados con los métodos de punción folicular y 17 ß estradiol. En nuestro país, Denis, (2001) demostró la eficiencia de la punción folicular para sincronizar las ondas de crecimiento folicular en vacas del genotipo Criollo. Ondas Sincronizadas mm Días del Intervalo Interovulatorio Onda 1 (FD) 1(FS) Onda2 (FO) Figura 2. Media del diámetro de los folículos dominantes (FD) y subordinados (FS) en la onda sincronizada por punción folicular en el genotipo Siboney de Cuba 29

8 La aplicación de métodos efectivos para la sincronización de las ondas de crecimiento folicular resultan de gran utilidad para lograr una mayor eficiencia en los tratamientos de inducción y sincronización de celos, ovulaciones o superovulaciones ya que se ha demostrado que el éxito de los mismos está relacionados con el momento del ciclo estral en que estos son aplicados (Pivato et al. 1999; Mapletoft et al. 2003, Patterson et al y Takaaki et al. 2003) CONCLUSIONES 1. El 72,3 % de los ciclos estudiados del Genotipo Siboney de Cuba presentaron tres ondas de crecimiento folicular, donde las manifestaciones de celo y el período interovulatorio fueron significativamente mayores que en los animales que presentaron solo dos ondas (27,2 %). 2. Durante todo el ciclo estral existe un predominio de folículos clase I, independientemente del número de ondas y del origen de estas (natural o sincronizado). 3. El inicio de la primera onda folicular se produjo independientemente del tipo de ciclo a los 0.5 días post ovulación y a los 1.7 días post punción en el caso de la onda sincronizada, sin que otras diferencias fueran observadas entre ambos tipos de ondas. 4. El cuerpo lúteo puede observarse a partir de los tres días post ovulación, independientemente del tipo de ciclo y del origen de la onda, sin que se registren diferencias significativas en los niveles máximos de progesterona. REFERENCIAS Ahmad, N., Townsend, E.C., Dailey, R.A. Inskeep E.K.. Relationships of hormonal patterns and fertility to occurrence of two or three waves of ovarian follicles, before and after breeding, in beef cows and heifers. Anim. Reprod. Sci. 49: 13, Álvarez J.L. La condición corporal en la hembra bovina. Dpto. Reproducción. La Habana: Publicaciones CENSA, Badinga, L., Thatcher, W.W., Wilcox, C J., Morris G., Entwistle K. Wolfenson, D. Effects of season on follicular dynamic and plasma concentrations of estradiol-17β, progesterone and luteinizing hormone in lactating Holstein cows. Theriogenology 42: 1263, Bergfelt, D.R., Lightfoot, K.C. and Adams, G.P. Ovarian synchronization following ultrasoun-guided transvaginal follicle ablation in heifers. Theriogenology 42:895, Bo, G.A., Adams G.P., Pierson, R.A, Mapletoft, R.J.Exogenous control of follicular wave emergence in cattle. Theriogenology 43:31, Bo, G.A., Bergfelt, D.R,. Mapletoft, R.J. Manipulación de la dinámica folicular en el ganado bovino: su aplicación en programas de transferencia de embriones, En: II Simposio Internacional de Reproducción Animal. Cordova, Argentina, p. 53, Bo, G.A., Hockley, D.K., Nasser, L.F., Mapletoft, R.J. Superrovulatory responseto a single subcutaneous injection of a porcine pituitary extract in beef cattle. Theriogenology 42:963, Bridges, P.J., J.E. Fortune. Characteristics of developing 30

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