ATUALIDADES DAS TÉCNICAS DE SUPEROVULAÇÃO E TRANSFERÊNCIA DE EMBRIÕES BOVINOS

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1 ATUALIDADES DAS TÉCNICAS DE SUPEROVULAÇÃO E TRANSFERÊNCIA DE EMBRIÕES BOVINOS Gabriel A. Bó 1 Instituto de Reproducción Animal Córdoba (IRAC), 2 Instituto A. P. de Ciencias Básicas y Aplicadas, Universidad Nacional de Villa María, Córdoba, Argentina.

2 Biotecnologías Reproductivas Inseminación Artificial Producción de Embriones in-vivo Producción de embriones in-vitro Clonación y Transgénicos

3 Fuente: Perry, 2014; IETS Newsletter 3 Numero de Embriones Bovinos Transferidos por Año

4 Fuente: Perry, 2014; IETS Newsletter 4 Numero de Embriones Bovinos Transferidos por Año

5 Producción de Embriones in-vivo Superovulación Necesidad de producir un número consistente de embriones transferibles 5

6 6.2 Embryos 1. Traditional superstimulation PGF 2 Estrus Detection PGF 2 FSH (12/12h) Estrus Det. + AI EC D-0 D-10 D-13 D-0 D-7 6

7 Folicular Waves in Cattle Diameter (mm) FSH (ng/ml) P4 P Days after Ovulation

8 Control del Desarrollo Folicular Aspiración de los folículos 1.5 días Estradiol 4 días (5 mg E-17β o 2 mg EB) GnRH/pLH 1.5 a 2 días

9 Tratamiento de SPO con P4 y Estradiol Inductor de ovulación (GnRH o plh) Tratamiento c/ FSH Colecta de embriones Disp. / P4 IATF D.C. e IA a las 12 y 24 h mg de P4 2 a 2,5 mg de EB PGF 9

10 Efecto del momento de la remoción del dispositivo con P4 sobre la producción de embriones Day of P4 device removal GnRH N Total Ova/embryos Fertilized Ova Grade 1 & 2 embryos No ± ± ± 0.7 YES ± ± ± 0.7 Day ± 1.1ª 6.7 ± 0.9 c 5.0 ± 0.6 Day ± 1.3 b 8.8 ± 0.9 d 5.8 ± 0.7 ab (P<0,05); cd (P<0,09) Chesta et al., 2007

11 LH o GnRH E + P4 P4 FSH PGF 2 12 o 24 h post remoción? IA IA 12 h 24 h CE D0 D4 D5 D6 D7 PM D8 D15 7 días 11

12 Nelore Intervalo remoción del dispositivo con P4 a la GnRH y producción de embriones transferibles h 24 h 12 h 24 h 6 Brangus 6 Angus h 24 h 12 h 24 h 12 h 24 h 12 h 24 h 12

13 FTAI in lactating Holstein donors Treatments* P4 removal with P4 removal with Effect (P values)** the 7 th FSH injection the last FSH LH 12 h LH 24 h LH 12 h LH 24 h P LH PxLH No. cows No. CL at embryo collection Ovulation rate (%) b b b a < Total ova/embryos b ab ab a No. transferable embryos b b b a 0.38 < Martins et al.,

14 Pero todavía hay muchas vacas que dan menos de 2 embriones por colecta. 14

15 diametro folicular (mm) LH FSH 12 Progesterona y estradiol-17 ~ 4. días Comenzar Nueva FSH Onda por 4 Folicular días Días

16 Follicle diameter (mm) FSH (ng/ml) 12 Foll type Time (h) Foll type-by-time P < 0.01 P < 0.01 P = 0.81 FSH Dominant follicle 1st sub follicle 2nd sub follicle Hours from wave emergence Jaiswal et al. Biol Reprod. 71, (2004)

17 Follicular diameter (mm) LH FSH 12 Progesterona y estradiol-17 ~ 4. días Nueva Onda Folicular IU ecg 2 días Antes de la FSH 4 Días

18 Control: 4.9 vs ecg: IU ecg PGF 2 EB + P4 FSH IA IA CE P4 D0 D2 AM D4 D5 D6 D7 D8 PM D9 AM D15 AM Caccia et al.,

19 SUPERESTIMULACION FSH CIDR Day

20 SUPERESTIMULACION FSH CIDR Day

21 Control Treatment Group Long Treatment Group Garcia Guerra et al., 2012

22 Superovulatory response in embryo donors treated with 4-day vs. 7-day protocol 4-d FSH - (FSH for 4 days following follicle ablation) 7-d FSH - (FSH for 7 days following follicle ablation) FSH Group 4-d (n=12) 7-d (n=12) Fol >9 mm CL Total ova/emb Fertilized ova Trans embryos 26.7± ±2.2 a 11.3± ± ±1.5 66%/36h 33.4± ±2.1 b 13.8± ± ±1.6 93%/36h ab P<0.05 Garcia Guerra et al., 2012

23 CONTROL DEL DESARROLLO FOLICULAR PARA LA OBTENCIÓN DE OVOCITOS POR ASPIRACIÓN GUIADA POR ULTRASONOGRAFÍA (OPU)

24 24 Numero de Embriones Transferidos por Año

25 Fuente: Perry, 2014; IETS Newsletter 25 EMBRIONES BOVINOS PRODUCIDOS IN VITRO 72.7%

26 Number of follicles Bubalus bubalis Bos taurus Bos indicus b b 29.7 n=10 n=10 n=10 a P< Figure. Mean number of follicles (2 to 3 mm) recruited per follicular wave in Bubalus bubalis (Mediterraneo), Bos taurus (Holstein) and Bos indicus (Nelore) heifers, São Paulo, 2008 Gimenes et al., 2008

27 n OVOCITOS VIABLES CLIVADOS (%) BLASTOCITOS (%) % P 30-60D ,7±0,3 7,9±0,2 (57%) 3,9±0,1 (27%) 35±1%

28 BOS INDICUS RAZA n OVOCITOS VIABLES CLIVADOS (%) BLASTOCITOS (%) % P 30-60D BRAHMAN 52 15,8±1,4 11,3±1,2 (72%) 6,8±0,9 (41%) 38±5% 3/8 INDICUS -5/8 TAURUS RAZA n OVOCITOS VIABLES CLIVADOS (%) BLASTOCITOS (%) % P 30-60D BRANGUS ,0±0,6 10,5±0,4 (56%) 5,7±0,2 (31%) 31±2% BRAFORD ,5±0,5 10,2±0,3 (59%) 5,0±0,2 (29%) 32±2% BOS TAURUS RAZA n OVOCITOS VIABLES CLIVADOS (%) BLASTOCITOS (%) % P 30-60D BONSMARA ,7±0,6 6,3±0,4 (55%) 3,2±0,2 (28%) 40±3% HOLANDO 620 8,0±0,2 4,3±0,1 (57%) 1,6±0,1 (21%) 39±2% ANGUS 55 11,5±0,8 5,8±0,6 (51%) 2,4±0,3 (22%) 35±7%

29 Como Podemos aumentar el numero de ovocitos obtenidos por OPU de las donante Bos Taurus? 29

30 Sincronización de la Onda Folicular previo a la OPU en Bos Taurus 10 vacas Angus 10 vacas Brangus Todas las vacas tratadas dos veces en un diseño cross-over. Grupo EB + P4 EB+P4 OPU 0 6 Grupo (Control) OPU 6 2,5 mg Benzoato de estradiol (Zoovet, Argentina) 50 mg Progesterona (Syntex, Argentina) Ongaratto et al., 2015

31 Effect of follicle wave synchronization on Oocyte numbers and quality in Angus y Brangus Total number of follicles Total number of Viable oocytes Group n aspirated oocytes EB+P ± 1.1 b 7.9 ± 1.3 b 5.2 ± 0.9 b Control ± 0.7 a 3.2 ± 0.5 a 2.1 ± 0.4 a Ongaratto et al 2015

32

33 Experimento 1 - Protocolo Vieira et al., Therigenology

34 Resultados prévios Vieira et al., Therigenology Lactating donors Non-lactating donors P-value 5 Control p-fsh Control p-fsh Treatment Lactation Treat*Categ No Total follicles aspirated 17.6± ± ± ± Total oocytes retrieved 13.0± ± ± ± Recovery rate, % (195/264) 59.0 (161/273) 65.6 (164/250) 61.1 (149/244) < COCs cultured 10.0± ± ± ± COCs culture rate, % (150/195) 82.6 (133/161) 78.0 (128/164) 83.9 (125/149) Cleavage rate, % 3 Blastocyst rate, % (98/150) DOADORA EM LACTAÇÃO EMBRIÕES / SESSÃO DE OPU (84/133) (93/128) (91/125) (15/150) (23/133) (40/168) (66/125) DOADORA SECA < Embryos produced per OPU 1.0± ± ± ±

35 Experimento 2 - Protocolo

36 Resultados DOADORAS NÃO LACTANTES C1: Control x (Foll MAP200 + MAP300) C2: Foll 200 x ( MAP200 + MAP300) C3: MAP200 x MAP ± 0.4

37 RAZA: HOLANDO SEMEN SEXADO Semen n OVOCITOS VIABLES CLIVADOS (%) BLASTOCITOS (%) % P 30-60D Sexado 479 7,1±0,2 3,7±0,1 (55%) 1,3±0,1 (19%) 32±2% Convencional ,7±0,5 6,1±0,4 (61%) 2,7±0,2 (27%) 29±3 % P Value <0,05 <0,05 <0,05 >0.2

38 Proportion of cows (%) Numbers of antral follicles 3mm variable between animals (Burns et al, 2005, Biol Reprod) repeatable within individuals (Burns et al, 2005, Biol Reprod) Number of follicles 3 mm Mossa et al. 2012

39 Muchos vs Pocos Folículos Comienzo de onda JLH Ireland et al, 2008

40 AMH (ng/ml 2,500 2,000 1,500 1,000 0,500 0,000-0, Número folículos Ovary Preantral Follicles (Ovarian Reserve) Thecal Cells Adapted from Rico et al., 2011 Small Antral Folllicles Large Antral Follicles Granulosa Cells (higher expresion of AMH) oocyte

41 Suitable oocytes rate (%) Embryo rate (%) Number of follicles Total oocytes Number of embryos RESULTADOS N = 59 População folicular Oócitos viáveis Embriões viáveis R=0.61 P < ,2 0,4 0,6 0,8 AMH (ng ml -1 ) R =0.69 P < ,2 0,4 0,6 0,8 AMH (ng ml -1 ) R =0.36 P < ,2 0,4 0,6 0,8 AMH (ng ml -1 ) Taxa oócitos viáveis Taxa de embriões viáveis R =0.28 P= R =0.06 P= ,2 0,4 0,6 0,8 AMH (ng ml -1 ) 0 0 0,2 0,4 0,6 0,8 AMH (ng ml -1 ) Guerreiro et al., 2014

42 DONANTES: FACTORES QUE AFECTAN LA TRANSFERENCIA DE EMBRIONES Variación en la producción de embriones viables (In vivo e In vitro) RECEPTORAS: Manejo y nutrición. Sincronización. Detección de celo

43 Transferencia de Embriones a Tiempo Fijo (TETF)

44 Simplified Protocol for FTET currently used in South America for in vivo and in vitro produced embryos BE (2,0mg ½ PGF) PGF 2 + ecg (400UI) + ECP (0,5mg) + Removal FTET P4 Device D0 D8 D17 44 Nasser et al., 2008

45 Se analizaron los datos de 4214 transferencias de embriones producidos in vitro por el laboratorio Biogen Argentina S.A. en el periodo comprendido entre Noviembre de 2012 y Diciembre de El análisis estadístico se realizó por regresión logística. La variable dependiente fue tasa de preñez y las variables independientes fueron clasificadas en 3 tipos: 1) las que dependen de la receptora y el ambiente 2) las que dependen del tratamiento de sincronización 3) las que dependen de la transferencia de los embriones

46 Factores que dependen de la receptora y el ambiente Variable tasa de concepción Valor P Porcentaje (%) Calidad del CL / , /380 0,45 37, /43 30,23 Total 1532/ ,71 Numero CL /3995 0,25 36, /178 38,76 Total 1712/ ,0 Categoría recept. Vacas 654/1834 0,21 35,65 Novillas 220/518 42,47 Total 874/ ,15 Condición Corp. 2 74/225 a 32,88 2,5 502/1434 a 35, /1467 a 0, ,85 3,5 193/532 a 36, /118 a 37,28 4,5 4/20 b 20,00 Total 1387/ ,53

47 Factores que dependen del tratamiento Variables Tasa Valor P Porcentaje (%) Concepción Momento ecg Final 84/209 0,35 40,19 Mitad 874/ ,14 Total 958/ ,32 Inductor ovulación BE 679/1888 b 35,96 CE 232/483 a 0,01 48,00 GNRH 47/129 b 36,43 Total 958/ ,32

48 Factores relacionados con la transferencia de los embriones Variables Tasa de concepción Valor P Porcentaje (%) Lugar de la transferencia Alta 649/1545 a 42,00 Media 845/2511 b 0,01 33,65 Baja 6/35 b 17,14 Total 1500/ ,66 Calificación de la transferencia Buena 1448/3849 a 37,62 Regular 52/222 b 0,01 23,42 Mala 5/31 b 16,12 Total 1505/ ,68 Día de ciclo de la receptora 7 76/192 0,36 39, / ,25 Total 876/ ,37 Estadio del embrión Mórula (4) 2/6 33,33 Blastocito inicial (5) 359/957 37,51 Blastocito (6) 613/1690 0,61 36,27 Blastocito expandido (7) 484/ ,23 Blastocito eclosionado (8) 12/32 37,50 Total 1470/ ,80

49 Día del ciclo estral de la receptora y tasa de preñez con embriones producidos in vitro DG30 Tasa de concepcion 0.40 A A A CL DIA n J. Salazar, Especialización IRAC, 2014

50 Los tratamientos que controlan el desarrollo folicular y la ovulacion permiten la ejecucion de programas de transferencia de embriones en forma simple y efectiva. Sin embargo una cuidadosa elección de las donantes van a influenciar significativamente los resultados ya que HAY UNA GRAN VARIACION entre vacas en el NUMERO DE FOLICULOS por onda folicular y estas están correlacionadas con: La respuesta superovulatoria. La producción de ovocitos para FIV. 50

51 Los tratamientos con FSH van a incrementar la producción de embriones in vitro de donantes Bos taurus. Hay que evaluar costos de producción y la posibilidad de producir embriones con semen sexado. Hoy hay varios tratamientos disponibles para realizar la Transferencia de los Embriones con éxito. La adición de ecg resulta en mayores tasas de preñez, especialmente en receptoras Bos indicus y en las Bos taurus en baja condición corporal o en el periodo posparto 51

52 SIN EMBARGO, no hay un tratamiento ideal que SIEMPRE resulte en buenos resultados, ya que dependen de muchos factores relacionados con los animales a utilizar, el personal y las características del campo en el que estamos trabajando 52

53 Ruben Mapletoft, Universidad de Saskatchewan, Canadá Stephen Leblanc, Universidad de Guelph, Canadá Jose Eduardo Santos, Universidad de Florida, USA Julio Giordano, Universidad de Cornell, USA Pietro Baruselli, Universidad de Sao Paulo, Brasil Luiz Nasser, Born Biotechnologies, Panamá Gabriel Bo, IRAC Michael Day, Universidad de Ohio, USA

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