Análisis de secuencias biológicas

Transcripción

1 Capítulo 8 Análisis de secuencias biológicas Álvaro Sebastián 8.1. Introducción Las secuencias son a la biología como las palabras al lenguaje. Normalmente representamos complejos polímeros orgánicos como el DNA o las proteínas usando largas concatenaciones de letras que simplifican su estructura química y nos permiten visualizarlos de forma similar a como leemos este libro. Al igual que las palabras, las secuencias pueden tener una raíz común y compartir significado con otras de la misma familia. Por ello es muy importante conocer las herramientas disponibles para comparar nuevas secuencias con otras ya conocidas y encontrar similitudes que nos ayuden a comprender su función, estructura o evolución, en resumen, el significado biológico de la secuencia Homología de secuencias Dos secuencias que comparten un ancestro común se denominan secuencias homólogas. Dos proteínas homólogas provienen de dos genes homólogos y comparten la misma estructura tridimensional y la misma función biológica (salvo raras excepciones). A veces se confunde homología con similitud, pero la homología es cualitativa y sólo admite dos estados: o ser homólogo o no serlo, y la similitud en cambio es cuantificable. Sin embargo, el grado de similitud entre dos secuencias nos puede servir para inferir la existencia o no de homología entre ambas. Actualmente la comparación de secuencias es la herramienta más poderosa para entender la función biológica de una secuencia desconocida mediante la búsqueda en bases de datos de secuencias homólogas previamente caracterizadas. Para muchas proteínas se pueden encontrar homólogos que tuvieron un ancestro común hace millones de años y que siguen compartiendo características en común como su estructura tridimensional o sitios activos como por ejemplo las hemoglobinas de plantas y animales o el citocromo c de procariotas y eucariotas [14]. En la Figura 8.1A se pueden comparar las estructuras superpuestas del citocromo c humano y el citocromo c2 de la bacteria Rhodopseudomonas viridis, así como sus secuencias proteicas alineadas (Figura 8.1B) observando una clara homología. La predicción de homología se realiza extrayendo la información conservada durante la evolución de las secuencias a comparar. La forma más sencilla de realizar la comparación sería escribiendo cada secuencia en una línea y anotando los nucleótidos o aminoácidos comunes. Sin embargo, las secuencias sufren 211

2 cambios y mutaciones que impiden su comparación directa con otras secuencias homólogas. Como veremos más adelante en el capítulo, las secuencias a comparar deberán ser alineadas para posteriormente poder puntuar los residuos conservados en posiciones equivalentes. Finalmente las puntuaciones obtenidas deberán ser validadas estadísticamente para poder garantizar con una máxima fiabilidad que existe o no homología. Por qué comparar secuencias y no estructuras de proteínas? Porque la similaritud de estructuras no garantiza que exista homología. El parecido estructural puede ser debido a restricciones químicas y físicas que favorecen un determinado plegamiento proteico. Existen numerosas excepciones de proteínas con estructuras similares que no son homólogas y de hecho sus secuencias son muy diferentes [10]. Además están descritas muchas menos estructuras que secuencias en las bases de datos y la comparación de estructuras es más compleja y con mayor costo computacional como se verá en el Capítulo 10. Sin embargo, dos proteínas homólogas poseerán estructuras similares. Finalmente, añadir que otro gran indicador de homología es la función de una proteína, incluso mejor que la secuencia. Sin embargo, por qué no se usa la función para predecir homología? Porque no se conoce la función real de la mayoría de proteínas anotadas en las bases de datos. Aunque muchas proteínas tienen una función anotada, ésta ha sido predicha comparando su secuencia con otras de función conocida o también predicha, por ello no es un dato fiable. Figura 8.1: A: Estructuras tridimensionales del citocromo c humano y el citocromo c2 de la bacteria Rhodopseudomonas viridis superpuestas. B: Secuencias del citocromo c humano y el citocromo c2 de la bacteria Rhodopseudomonas viridis alineadas.

3 Diferencias entre el alineamiento de DNA y de proteínas La mayoría de algoritmos y técnicas de alineamiento pueden aplicarse tanto a proteínas como DNA o RNA. Sin embargo las comparaciones de secuencias de nucleótidos suelen ser menos precisas e informativas. Veamos como ejemplo el resultado de alinear las secuencias de proteína (NP ) y de mrna (NM ) de la tripsina humana con el programa BLAST contra las bases de datos de referencia del NCBI con los parámetros por defecto y buscando únicamente secuencias humanas. En la Figura 8.2A se observa como la búsqueda de secuencias de proteínas homólogas devuelve 108 resultados, todos ellos de calidad buena o muy buena (colores rosa y rojo respectivamente), por contra la búsqueda de la secuencia de cdna obtiene tan sólo 15 resultados, de los cuáles sólo 7 son de una calidad aceptable como para considerar su homología. La explicación a este fenómeno la podemos encontrar en la degeneración del código genético que permite la sustitución de nucleótidos en el DNA sin cambiar el aminoácido que codifican, lo cual hace que si no se conoce el marco de lectura, no se consigan encontrar secuencias estadísticamente significativas en las búsquedas. Por otro lado, las sustituciones de aminoácidos en las proteínas suelen ser por otros con similares propiedades físicoquímicas. La probabilidad de dichas sustituciones está tabulada, lo que permite asignar puntuaciones a los alineamientos y con ello una mayor precisión (ver Subsección 8.3.2). En general se puede decir que la búsqueda de secuencias de nucleótidos es únicamente válida para buscar secuencias homólogas muy conservadas, que divergieron hace menos de años. La búsqueda de homólogos proteicos es mucho más sensible, pudiendo encontrar proteínas con ancestros comunes de más de 1000 millones de años [13]. Una posible solución a este problema es traducir las secuencias de DNA o RNA a secuencias peptídicas siempre que se conozca el marco de lectura, tal como se explicó en la Sección 7.4. Sin embargo, la búsqueda de secuencias de nucleótidos sigue siendo válida en muchas otras ocasiones como ensamblajes de secuencias, búsquedas de polimorfismos, diagnósticos genéticos o búsquedas de sitios de unión de factores de transcripción. Figura 8.2: Resultados estadísticamente significativos tras alinear las secuencias de proteína (A) y de mrna (B) de la tripsina humana con el programa BLAST contra las bases de datos de referencia del NCBI.

4 8.2. Obtención de secuencias y formatos Elegir la base de datos adecuada donde buscar una secuencia problema es tan importante como escoger una óptima técnica de alineamiento. Por ejemplo, si queremos buscar proteínas homólogas a una humana en ratón, será inútil que consultemos una base de datos de secuencias de plantas. Por ello, aunque ya se han presentado las bases de datos de secuencias más importantes en el Capítulo 1, volveremos a recordarlas brevemente Bases de datos de secuencias de DNA y proteínas Cuando se trata de buscar secuencias de proteínas, la base de datos mejor anotada actualmente es UniProt 1 [3]. Esta base de datos recoge actualizaciones de proteínas de la antigua base de datos anotada manualmente llamada Swiss-Prot y también anotaciones automáticas (TrEMBL). A su vez permite descargarse proteomas completos de diversos organismos, así como buscar secuencias de proteínas automáticamente desde su interfaz web. Las anotaciones de las proteínas revisadas suelen ser muy precisas, incluyendo datos como nomenclatura, función, dominios proteicos, sitios catalíticos, variantes proteicas, bibliografía, secuencia, así como enlaces a otras bases de datos con el gen que las codifica, el mrna o la estructura tridimensional. En el caso de buscar secuencias de nucleótidos, quizás la más completa es GenBank 2 [2] mantenida por el organismo americano NCBI. Su mayor problema es su gran tamaño, en enero de 2011 contenía más de 135 millones de secuencias sin incluir secuencias de proyectos de secuenciación incompletos. Al igual que UniProt permite descargar archivos con secuencias e integra la herramienta BLAST para realizar búsquedas. Si nos interesa una mejor anotación y menor número de secuencias deberíamos usar RefSeqGene 3, donde podemos encontrar información anotada sobre los genes, sus variantes de mrna y las proteínas que codifican, además de su posición en el genoma, fenotipos, función, interacciones, etc. La característica más interesante de RefSeqGene es que permite obtener las secuencias tanto de nucleótidos como de péptidos de las diferentes variantes de splicing de un gen (ver Sección 7.2). Sin embargo, en RefSeqGene existen muchas menos secuencias anotadas que en GenBank Formatos de archivos de secuencias El formato más usado en el campo del análisis de secuencias es el formato FASTA 4. Consiste en archivos de texto donde la primera línea antes de cada secuencia, también llamada cabecera, comienza por el carácter > seguido del identificador de la secuencia. Tras dicha línea siguen otras con la secuencia escrita con código de una letra por cada nucleótido o aminoácido (Ver Sección 7.3 y Sección 7.6) usándose guiones - para representar huecos en la secuencia. La longitud de cada línea de secuencia se recomienda que no sea superior a 80 caracteres para facilitar su lectura. En la Figura 8.3A se puede ver un ejemplo de secuencia en formato FASTA. Otro formato con una anotación más completa es el formato GenBank 5. En este formato el tipo de contenido almacenado en cada línea está indicado por una palabra identificadora en letras mayúsculas colocada al inicio de la línea y seguida de un número fijo de espacios hasta el comienzo de la información. Los campos de cabecera son: LOCUS, DEFINITION, ACCESSION, VERSION, GI, KEYWORDS, 1 UniProt. 2 GenBank. 3 RefSeqGene. 4 Descripción del formato FASTA. format 5 Descripción del formato GenBank.

5 SOURCE y REFERENCE, a su vez cada uno de ellos puede tener contenidos otros, por ej. AUTHORS, TITLE y JOURNAL dentro del campo REFERENCE. El campo FEATURES y sus subcampos source, genes y CDS contienen la información sobre el organismo, la localización cromosómica, así como del inicio y final de las regiones génicas y codificantes, incluyendo en su caso el nombre, identificadores y otros datos del gen o de la proteína y la secuencia codificada. Finalmente el campo ORIGIN incluye la secuencia a la que pertenecen las anotaciones anteriores, escrita en código de una letra y numerada. En la Figura 8.3B se puede ver un ejemplo de secuencia en formato GenBank. Figura 8.3: Secuencia del mrna del gen de la insulina. A: Formato FASTA. B: Formato GenBank.

6 Ejemplo de código en Perl para leer un archivo FASTA Para finalizar el apartado, explicaré un pequeño ejemplo escrito en Perl para leer secuencias en formato FASTA y almacenarlas en una tabla hash para poder acceder a ellas fácilmente más tarde en el programa. El código comienza definiendo la variable $identificador donde se almacenará la cabecera de la secuencia que se esté leyendo en cada momento y la tabla hash %secuencias que almacenará las secuencias con el identificador como índice. Al leer el archivo FASTA línea por línea, se identificarán las cabeceras con una sencilla expresión regular />(.*)/ y se almacenará en la variable $identificador el contenido que sigue al símbolo >. Posteriormente se leerá la secuencia que se irá almacenando en la tabla hash %secuencias según se vaya leyendo. Tras leer todo el archivo, se podrá acceder a las secuencias invocando a la tabla con un identificador como índice $secuencias{ Identificador }. Código 8.1: Ejemplo de lectura de un archivo FASTA con Perl. 1 # Código para leer secuencias FASTA y almacenarlas en una tabla hash 2 3 my ( %secuencias, $identificador); 4 5 # Abrir el archivo FASTA de secuencias 6 open(fastafile,"archivo.fasta"); 7 8 # Leer línea por línea el archivo 9 while(<fasta>){ # Detectar las cabeceras y guardar las secuencias en la tabla hash 12 if(/ˆ>(.*)/){ 13 $identificador = $1; 14 } else { 15 $secuencias{$identificador}.= $_; 16 } 17 } # Cerrar el archivo FASTA 20 close(infile); # Imprimir en pantalla una secuencia almacenada en la tabla hash 23 print $secuencias{"identificador"}; 8.3. Alineamiento de secuencias Los grandes avances en las tecnologías de secuenciación de DNA, la disponibilidad de grandes bases de datos de secuencias, junto con el desarrollo de eficientes algoritmos de comparación de secuencias han motivado un cambio sustancial en la biología molecular y celular modernas. Actualmente cuando se descubre un nuevo gen no se va directamente al laboratorio a realizar experimentos para conocer su función celular, simplemente se introduce su secuencia en un ordenador esperando encontrar genes homólogos de otros organismos ya estudiados. Tal y como se ha ido explicando a lo largo del capítulo, la forma de encontrar secuencias homólogas en una base de datos es alineando nuestra secuencia problema con las otras secuencias y evaluando el parecido entre ellas. Este proceso no es tan sencillo como poner una secuencia encima de otra, las secuencias tienen diferentes longitudes, inserciones, deleciones, sustituciones... Si volvemos al ejemplo del citocromo c humano y el citocromo c2 de la bacteria Rhodopseudomonas viridis (Figura 8.1), probablemente no seamos capaces de alinear manualmente sus secuencias, a pesar de su clara homología. De ahí la importancia de conocer los entresijos de los

7 algoritmos de alineamiento que nos permiten realizar la tarea de comparación de secuencias de una forma rápida y fiable, siempre que se sepan elegir los parámetros adecuados Definición de similitud e identidad Dos definiciones muy importantes a la hora de evaluar la calidad de un alineamiento son la similitud y la identidad. La identidad es la suma de residuos idénticos en posiciones equivalentes en dos secuencias alineadas. La similitud es la suma de puntuaciones correspondientes a residuos en posiciones equivalentes en dos secuencias alineadas, dichas puntuaciones suelen estar tabuladas e incluir penalizaciones para las inserciones y deleciones (también llamados gaps, porque insertan huecos en el alineamiento). Las tablas de puntuaciones de sustitución de un residuo por otro se denominan Matrices de sustitución. En la Figura 8.4 podemos ver un ejemplo de alineamiento de 2 secuencias de DNA con sus correspondientes valores de identidad y similitud. Figura 8.4: Ejemplo de valores de identidad y similitud para un alineamiento de 10 nucleótidos. Las puntuaciones de cada sustitución para calcular la similitud se muestran a la derecha Matrices de sustitución La historia de las matrices de sustitución se remonta a los años 70, cuando la investigadora Margaret Oakley Dayhoff se afanaba en recopilar todas las secuencias de proteína existentes en su libro Atlas of Protein Sequence and Structure [4]. Dayhoff y colaboradores estudiaron el modelo evolutivo de los cambios en los aminoácidos de las proteínas, para ello estudiaron 1572 cambios en 71 grupos de proteínas, dentro de cada grupo las secuencias compartían más del 85 % de identidad. De esta forma anotaron el número de cambios para todas las combinaciones posibles de 2 aminoácidos, observando que 35 de las posibles mutaciones nunca ocurrían, estas se correspondían con aminoácidos poco frecuentes. También observaron que las mutaciones más frecuentes se daban entre aminoácidos con similares propiedades físico-químicas, como por ej. Asp y Glu. Muchos de los cambios de aminoácido esperados por modificación de un sólo nucleótido en los codones codificantes no se daban o eran infrecuentes, lo que demostró una mayor presión evolutiva a nivel de secuencia proteica que a nivel de DNA. El cambio de un aminoácido por otro se denominó mutación puntual aceptada (PAM). Normalizando los datos de las PAMs de acuerdo a la probabilidad de mutación de cada aminoácido en los datos estudiados (mutabilidad) se obtuvo la famosa matriz PAM1 en la que cada elemento de la matriz M ij cuantifica la probabilidad de que un aminoácido i sea remplazado por otro aminoácido j en el intervalo evolutivo de 1 PAM. 1 PAM se define como el intervalo evolutivo en que cambia un 1 % de los aminoácidos en el alineamiento de 2 secuencias (1 cambio o PAM por cada 100 aminoácidos).

8 La matriz PAM1 sirve para simular cambios evolutivos en secuencias de proteínas. Para ello basta tomar un número aleatorio (entre 0 y 1) para cada aminoácido de una secuencia dada y asignarle un cambio si la probabilidad es menor que la anotada en la matriz para conservar el aminoácido. El proceso se puede repetir múltiples veces hasta alcanzar la distancia PAM deseada. Las matrices PAM también tienen unas propiedades my interesantes: i) la matriz PAM0 sólo posee unos en la diagonal y el resto son ceros; ii) la matriz se puede multiplicar por sí misma para calcular matrices de N PAMs; iii) si la matriz se multiplica infinitas veces por sí misma obtendremos la frecuencia del aminoácido j para todas las columnas de i. Los intervalos evolutivos medidos en PAMs los podemos relacionar con porcentajes de residuos conservados idénticos por medio de la fórmula: Identidad( %) = 100 f i M ii (8.1) Siendo f i la frecuencia normalizada de aparición de un aminoácido y M ii el valor en la diagonal de la matriz PAM. Algunas equivalencias calculadas entre identidad y PAMs se pueden consultar en la Tabla 8.1. PAMs Identidad ( %) Tabla 8.1: Tabla de equivalencias entre PAMs y porcentaje de identidad entre secuencias proteicas. Toda la anterior explicación teórica de las matrices PAM está muy bien, pero volviendo al tema de alinear y comparar secuencias, para qué nos sirven las matrices PAM? Las matrices PAM no nos son útiles directamente, pero sí el odd-ratio (R ij ) calculado dividiendo un elemento de la matriz M ij entre la frecuencia normalizada de j (f j ): R ij = M ij f j (8.2) M ij nos da la probabilidad de que un aminoácido i sea sustituido por otro j en una distancia evolutiva definida por la matriz PAM y f j es la probabilidad de encontrar el aminoácido j en una posición de la secuencia por casualidad. El odd-ratio R ij cuantifica la probabilidad de que una sustitución se de en una posición dada. Un odd-ratio de valor 10 significaría que la sustitución es 10 veces más frecuente que la probabilidad de encontrar alineados ambos aminoácidos. Por el contrario, un odd-ratio de valor 0,5 significaría que la probabilidad de encontrar alineados ambos aminoácidos es el doble de probable que la mutación. Podríamos puntuar un alineamiento de dos secuencias multiplicando los odd-ratios calculados para cada posición. Sin embargo, en informática las multiplicaciones son costosas y se prefieren las sumas, así que se calcula el log-odd multiplicado por 10 de R ij, estos números son más intuitivos y sencillos de sumar y serán la base de las puntuaciones de los Alineamientos: S ij = 10 log 10 M ij f j = 10 log 10 R ij (8.3) Las matrices de log-odds calculados con la Ecuación 8.3 son las que habitualmente denominamos PAM y usamos para calcular valores de similitud en alineamiento de secuencias (puntuaciones). En la Tabla 8.2 se puede consultar la matriz PAM250, una de las más usadas para puntuar alineamientos.

9 Si queremos encontrar un significado probabilístico de los valores log-odd de una matriz, bastaría con volver a calcular el odd-ratio (R ij ): R ij = 10 S ij 10 (8.4) C 12 S 0 2 T P A G N D E Q H R K M I L V F W Y C S T P A G N D E Q H R K M I L V F W Y Tabla 8.2: Matriz de log-odds PAM250. Otras nuevas versiones de las matrices PAM han sido calculadas con un número mayor de grupos de secuencias homólogas alineadas, sin embargo no han conseguido mejorar sustancialmente las matrices originales de Dayhoff [5, 7]. Otro tipo de matrices de sustitución que sí han conseguido mejorar a las PAM son las matrices BLOSUM (BLOcks of Amino Acid SUbstitution Matrix), creadas por Henikoff [6]. Las matrices BLOSUM fueron creadas a partir de datos de más de 500 grupos de alineamientos de secuencias de proteínas y con el objetivo de mejorar los alineamientos de secuencias divergentes donde las matrices PAM fallaban. Para definir diferentes matrices BLOSUM se marcaron diferentes umbrales de identidad de secuencias, de forma que las secuencias con mayor o igual identidad que el umbral se agruparon para disminuir su contribución en la matriz. Por ejemplo, para calcular la matriz BLOSUM62 se agruparon las proteínas con identidad mayor o igual que 62 %. Con los bloques de secuencias alineadas se calcula una tabla de frecuencias de cada pareja de aminoácidos alineados, obteniendo 210 parejas posibles con sus respectivas frecuencias de aparición que permitirán calcular los odd-ratios(r ij ) entre las frecuencias observadas (q ij ) y las frecuencias esperadas por casualidad (e ij ) (Ecuación 8.5). Henikoff decidió calcular los log-odds (R ij ) de una manera ligeramente diferente a Dayhoff, usando logaritmos en base 2 (Ecuación 8.6). En la Tabla 8.3 se representa la matriz BLOSUM62, ésta es la matriz preferida para usar por defecto por algoritmos tan famosos como BLASTP. R ij = q ij e ij (8.5)

10 S ij = log 2 q ij e ij (8.6) A 4 R -1 5 N D C Q E G H I L K M F P S T W Y V A R N D C Q E G H I L K M F P S T W Y V Tabla 8.3: Matriz de log-odds BLOSUM62. Las matrices BLOSUM demostraron ser más sensibles a la hora de identificar alineamientos de proteínas homólogas [6]. Las principales diferencias entre ambos tipos de matrices es que las PAM son generadas por extrapolación de datos de alineamientos de secuencias muy conservadas y las BLOSUM, por contra, son derivadas de datos reales de alineamientos de secuencias menos conservadas. En la Tabla 8.4 se muestra la equivalencia entre diferentes matrices PAM y BLOSUM, a menor distancia evolutiva PAM, mayor porcentaje de identidad BLOSUM y al contrario. Como norma general se prefiere el uso de matrices BLOSUM, sin embargo, cuando se realizan comparaciones de secuencias muy conservadas, las matrices PAM pueden conseguir mejores resultados. PAM120 BLOSUM80 PAM160 BLOSUM62 PAM250 BLOSUM45 Tabla 8.4: Equivalencia de matrices PAM y BLOSUM. Todo lo explicado hasta ahora sobre matrices de sustitución ha sido en el contexto de alineamientos proteicos. Qué sucede en el caso de alineamientos de secuencias de DNA o RNA? Para los nucleótidos también se han calculado matrices PAM de forma similar a la explicada para proteínas [22], teniendo en cuenta las diferentes probabilidades de mutaciones por transición (A G, C T/U) o transversión (A/G C/T/U). Sin embargo, programas como BLAST emplean por defecto puntuaciones de 1 y -2 para evaluar coincidencia/no coincidencia de nucleótidos respectivamente. Aunque el uso de matrices

11 PAM puede mejorar alineamientos de nucleótidos con identidades < 70 %, normalmente su mayor sensibilidad no compensa el mayor tiempo necesario para realizar los alineamientos, especialmente cuando estamos trabajando con genomas. Como ya se explicó, cuando se requiere alinear secuencias de DNA o RNA divergentes se prefiere traducirlas a secuencias proteicas antes de realizar su alineamiento Significación estadística y E-value Tenemos dos secuencias alineadas y hemos puntuado su alineamiento mediante las matrices de sustitución, ahora bien cómo sabemos si ambas secuencias son homólogas o su alineamiento es fruto del azar? si su similitud o identidad son altos podremos suponer que son homólogas (ver Subsección 8.3.1), aunque nunca lo sabremos con el 100 % de certeza. Ahora surge otra pregunta, qué se considera una alta identidad o similitud? Valores de identidad o similitud para encontrar homólogos en una familia proteica concreta pueden no ser suficientemente altos para otra familia diferente. Según vamos bajando el umbral de similitud/identidad para la búsqueda de homólogos, llega un momento en que no podemos diferenciar entre los que realmente lo son y los que no. El porcentaje de identidad del % en proteínas marca el límite donde coexisten alineamientos de verdaderos y falsos homólogos. Estos casos de alineamientos dudosos se denominan twilight zone y serán analizados en la siguiente Subsección Para intentar evitar la inexactitud de las medidas de similitud e identidad, se usa la significación estadística. La significación estadística mide la probabilidad de que un alineamiento no sea debido al azar. Si el alineamiento es improbable que sea fruto del azar, entonces ambas secuencias son probablemente homólogas. Como en el caso de la identidad/similitud, la significación estadística tampoco garantiza con un 100 % de certeza la homología, pero permite discriminar mucho mejor alineamientos dudosos. La primera medida de significación estadística fue introducida por Lipman y Pearson [9, 15]. Para ello generaron secuencias al azar tomando bloques de aminoácidos de la secuencia alineada y calcularon sus valores de similitud. Tras ello calcularon la desviación de la medida de similitud del alineamiento original respecto a los alineamientos de secuencias aleatorias. Si esta desviación era superior a 6 veces la desviación estándar ambas proteínas eran probablemente homólogas. Esta medida se llama Z-score (Z), se calcula restando el valor de la similitud calculada mediante una matriz de sustitución (S) al valor medio de los alineamientos de secuencias al azar (µ), todo ello dividido entre la desviación estándar (σ): Z(S) = S µ σ (8.7) Sin embargo, el Z-score es únicamente válido para distribuciones normales (gausianas) y los valores de alineamientos de secuencias al azar siguen un patrón de distribución de valores extremos. Otra medida estadística muy usada en bioinformática son los P-values (ver Capítulo 3 Estadística y R ). El P-value (P ) del alineamiento de dos secuencias es la probabilidad de que dos secuencias aleatorias (de la misma longitud y composición) tengan una similitud mayor o igual al alineamiento original. A pesar de la validez de este parámetro estadístico, cuando alineamos secuencias se prefiere usar el E-value. El E-value (E) nos da el número esperado de secuencias aleatorias cuyo alineamiento da valores de similitud mayores o iguales que el valor del alineamiento original. La ventaja de usar E-values es su mayor manejabilidad, pues su rango de valores ( + ) es más amplio e intuitivo que los P-values (0-1). No obstante, ambos valores pueden interconvertirse con la siguiente fórmula: P (S) = 1 e E(S) (8.8)

12 Donde E(S) es el E-value para obtener un valor de similitud mayor o igual que S. La fórmula para calcular analíticamente E-values fue publicada por Karlin y Altschul [8]: E(S) = Kmne λs (8.9) E es proporcional al espacio de búsqueda (mn), m es la longitud de la secuencia problema, n es la longitud de todo el conjunto de secuencias a alinear con la secuencia problema, λ es un parámetro para normalizar los valores de similitud y hacerlos independientes de la matriz de sustitución empleada, y K es un factor de escalado para el espacio de búsqueda. En la ecuación podemos observar como E disminuye exponencialmente según aumenta el valor de similitud exigido (S). A su vez la relación linear de E con el espacio de búsqueda sugiere la importancia estadística del espacio muestral respecto a considerar únicamente valores de similitud como estábamos haciendo hasta el momento. Un valor de E = 0,1 cuando estamos alineando una secuencia contra una base de datos de 1000 secuencias puede ser equivalente a E = 0,001 si únicamente alineamos contra 10 secuencias. Hasta ahora habíamos usado los valores de identidad y similitud para evaluar los alineamientos de secuencias, a partir de este momento pasaremos a usar los valores de E-value. Tampoco habíamos tenido en cuenta que los valores de similitud dependían de la matriz de sustitución empleada al calcularlos, lo cual supone algo similar a definir una distancia sin nombrar las unidades. Podemos calcular valores de similitud normalizados en unidades de similitud arbitrarias llamados bit-scores (S ) con la siguiente fórmula: S = λs ln K ln 2 (8.10) Ahora el cálculo de E-values es mucho más sencillo, puesto que los parámetros K y λ están implícitos en S : E(S ) = mn2 S (8.11) Finalmente podemos concluir este apartado con la idea de que los E-values son los mejores indicadores que tenemos para conocer la validez de un alineamiento en el reconocimiento de secuencias homólogas. Valores de E(S) <= 0,001 son habitualmente suficientes para considerar que el alineamiento de dos secuencias no es fruto del azar sino de la homología, incluso valores superiores de E(S) pueden darse en homólogos remotos El twilight u ocaso de los alineamientos La zona de twilight (ocaso) de los alineamientos de proteínas es el rango de pares de valores de longitudes de secuencia y valores de identidad para los cuales existe una alta probabilidad de que sean erróneos [18, 19]. Si observamos la Figura 8.5 podemos concluir que alineamientos con menos del 25 % de residuos idénticos pertenecen la mayoría a proteínas no homólogas. Además, si la longitud de la secuencia proteica alineada es menor de 80 aminoácidos, se requiere de mayor % de identidad para encontrar homología. Llegando a requerirse una identidad del 100 % para secuencias más cortas que 10 residuos. En el caso de secuencias de nucleótidos la zona de twilight es más difusa, la identidad entre las secuencias de cdna o mrna de dos genes homólogos cuyas proteínas compartan un 25 % de identidad puede ser mucho menor.

13 A la hora de evaluar alineamientos se utilizará siempre que sea posible el E-value como ya se ha explicado. El E-value nos dará la probabilidad de que existan falsos alineamientos y por ello estemos dentro de la zona de twilitght o no. Sin embargo, en casos dudosos podremos considerar la identidad entre secuencias y valorar su pertenencia o no al grupo de alineamientos dudosos. Un buen consejo para alineamientos dentro de la zona de twilitght, es alinear ambas secuencias contra bases de datos anotadas. Si encontramos para alguna de las secuencias resultados de genes o proteínas de la misma familia con buenos alineamientos, podremos esclarecer la homología de las secuencias iniciales. Programas de alineamiento como BLAST recomiendan secuencias de longitud mayor a 22 nucleótidos o 6 aminoácidos, esto se debe en parte a la necesidad de una mínima longitud de secuencia para salir de la zona de twilitght y poder realizar alineamientos con un mínimo de probabilidad de certeza. Figura 8.5: Identidad de secuencia vs. longitud de alineamiento. Gráfica original de Sander y Schneider [19] donde las proteínas homólogas están representadas por X y el resto por cuadrados. La curva marca la separación entre alineamientos de proteínas homólogas y otras no homólogas o dudosas Técnicas y programas de alineamiento Ahora que ya hemos visto las bases teóricas del alineamiento de secuencias vamos a ver cómo se pueden emplear diferentes herramientas para ello. Pero primero deberemos diferenciar entre dos tipos posibles de Alineamientos: Global: alineamiento de la secuencia completa. Es útil cuando se comparan secuencias muy similares en tamaño y composición, por ejemplo de dos genes muy conservados. Local: cuando sólo nos interesa alinear regiones similares entre secuencias. Se utiliza cuando las secuencias a comparar son diferentes en tamaño o poseen regiones no conservadas. Un ejemplo

14 podría ser el alineamiento de un dominios proteico entre dos proteínas con diferente número total de dominios. Para realizar de una forma eficiente y rápida estos alineamientos se utilizan algoritmos computacionales de programación dinámica. No vamos a entrar en detalle, pero sí que merece la pena conocer los dos más importantes: Needleman Wunsch [12] es el empleado para realizar alineamientos globales y Smith Waterman [21] sirve para optimizar alineamientos locales entre secuencias. Jonathan Pevsner realiza una muy buena y detallada descripción de ambos métodos en su libro Bioinformatics and Functional Genomics [17]. A su vez hay que distinguir entre el alineamiento de pares de secuencias y alineamientos múltiples: Pares de secuencias: mide la similitud entre dos secuencias, por ejemplo la secuencia problema y cada una de las secuencias de una base de datos, realizando comparaciones individuales entre pares. Alineamiento múltiple: compara más de dos secuencias al mismo tiempo. Es especialmente importante cuando queremos interrelacionar varias secuencias entre sí, por ejemplo para calcular árboles filogenéticos, buscar patrones o regiones conservadas. Es un problema bastante más complejo que el de alinear sólo 2 secuencias y existen diferentes técnicas que ofrecen diferentes resultados. En ambos casos el alineamiento puede ser local o global Alineamiento local de pares de secuencias A continuación se explicará el uso de dos de los programas más populares para el alineamiento local de pares de secuencias: BLAST y FASTA. Ambos usan el algoritmo de Smith Waterman junto a técnicas heurísticas que los hacen extremadamente rápidos y útiles para búsquedas en grandes bases de datos. BLAST BLAST 6 (Basic Local Alignment Search Tool) es la herramienta más popular de búsqueda y alineamiento de secuencias. De hecho, el artículo original que la describe [1] es uno de los más citados en la historia de la ciencia. Como su propio nombre indica, realiza alineamientos locales tanto de nucleótidos como de amino ácidos, normalmente las secuencias problema se alinean contra secuencias de bases de datos. El algoritmo de BLAST tiene el siguiente funcionamiento: 1. Algoritmo heurístico: divide la secuencia a alinear en subsecuencias (k-meros) de longitud más corta (3 amino ácidos o 28 nucleótidos por defecto) y busca éstas entre las secuencias de la base de datos. 2. Programación dinámica: cuando encuentra varias subsecuencias en una misma entrada de la base de datos, extiende el alineamiento hacia ambos lados mediante el algoritmo de programación dinámica de Smith Waterman [21] y una matriz de sustitución (por defecto Blosum62 para amino ácidos). 3. Significación estadística: finalmente calcula el bit-score y E-value del alineamiento local extendido que nos dará la probabilidad de que dicho alineamiento sea fruto del azar en comparación con el tamaño de la base de datos (ver Subsección 8.3.3). Existe una familia de programas que usan el algoritmo BLAST de diferentes formas: 6 BLAST.

15 blastn: busca una secuencia de nucleótidos en una base de datos del mismo tipo. blastp: busca una secuencia proteica en una base de datos de proteínas. blastx: traduce a amino ácidos una secuencia de nucleótidos y la busca en una base de datos de proteínas. tblastn: busca una secuencia proteica en una base de datos de nucleótidos previamente traducidos a proteínas. tblastx: traduce a amino ácidos una secuencia de nucleótidos y la busca en una base de datos de nucleótidos previamente traducidos a proteínas. bl2seq: compara dos secuencias entre sí, sin usar base de datos. blastpgp: realiza la búsqueda de una proteína en una base de datos varias veces, de forma que en cada nueva búsqueda se utiliza una nueva secuencia o perfil que es fruto de la combinación de los resultados de la búsqueda anterior. De esta forma es posible encontrar secuencias homólogas evolutivamente más remotas que con una búsqueda clásica, pero también existe el peligro de encontrar secuencias sin ningún tipo de relación. megablast: es una versión más rápida de blastn utilizada para buscar un gran número de secuencias de DNA en bases de datos. Para acelerar la búsqueda, concatena varias secuencias en una única y tras la búsqueda separa los resultados. Finalmente apuntar que todos los programas enumerados se pueden usar en su versión online 6 o descargarlos para usarlos en nuestro ordenador 7. FASTA El paquete de programas FASTA 8 es más popular por el formato de archivo que lleva su nombre (ver??) que por sus herramientas. Sin embargo FASTA es un conjunto de programas de alineamiento muy similar a BLAST [9]. El esquema del algoritmo de alineamientio de FASTA es casi idéntico al de BLAST por lo que no se volverá a explicar. Únicamente destacar que BLAST es más rápido que FASTA, aunque FASTA puede ser más sensible para alinear secuencias muy divergentes Alineamiento global de pares de secuencias El alineamiento global de secuencias tiene más limitaciones de uso que el local. No sirve para detectar similitud entre proteínas de diferente longitud o con múltiples dominios funcionales que no son de una misma familia o que poseen largas duplicaciones o delecciones en la secuencia. Su utilidad es más bien limitada al alineamiento de proteínas homólogas para generar árboles filogenéticos, ya que los valores de similitud de estos alineamientos pueden ser transformados fácilmente en distancias evolutivas [16]. Needle y Stretcher Needle es un programa que implementa rigurosamente el algoritmo de Needleman-Wunsch [12]. Forma parte de EMBOSS 9 (The European Molecular Biology Open Software Suite). Cuando las secuencias 7 Download NCBI Software. 8 FASTA Sequence Comparison at the University of Virginia. 9 The European Molecular Biology Open Software Suite.

16 a alinear son largas, el alineamiento puede fallar o ser muy lento debido a las altas necesidades de memoria del algoritmo (proporcional al producto de las longitudes de ambas secuencias). Stretcher es una modificación del algoritmo de Needleman-Wunsch [11] que requiere únicamente una cantidad de memoria proporcional a la secuencia más corta, con lo cual es válido para todo tipo de secuencias. También forma parte del paquete de programas EMBOSS Alineamiento múltiple de secuencias El alineamiento múltiple de secuencias sirve, como su nombre indica, para alinear más de dos secuencias al mismo tiempo. Normalmente las herramientas de alineamiento múltiple incluyen algoritmos para realizar tanto alineamientos de tipo local como global. La principal utilidad del alineamiento múltiple es la detección de homología entre grupos de secuencias que presentan baja similitud entre sí, pero que al compararlas en su conjunto se detectan posiciones o regiones muy conservadas que indican su origen evolutivo común. Por ello este tipo de alineamiento permite fácilmente la detección de regiones o dominios conservados entre varias secuencias proteicas, como pueden ser sitos catalíticos, de trasducción de señal o dominios de unión a DNA o entre proteínas. Los resultados de este tipo de alineamientos también son muy valiosos para el análisis filogenético y la construcción de árboles (ver Capítulo 9 Filogenia y evolución molecular ). El cálculo del mejor alineamiento múltiple alcanza gran complejidad según se aumenta el número de secuencias, lo que también incrementa las posibles combinaciones entre sus alineamientos y diferentes posibilidades de incluir gaps entre ellas. Para resolver el problema se emplean diferentes estrategias heurísticas para obtener buenos alineamientos en un tiempo razonable, aunque no sean los óptimos. La técnica progresiva (también conocida como método jerárquico o de árbol) es la más popular. Consiste en realizar previamente todas las posibles combinaciones de alineamientos entre pares de secuencias para construir un árbol de distancias por similitud. El alineamiento comienza tomando como referencia el alineamiento de las dos secuencias más similares y va añadiendo una por una y en el orden establecido por el árbol el resto de secuencias a alinear. El principal problema del método progresivo es su fuerte dependencia del alineamiento de las dos secuencias inicialmente alineadas que servirán de referencia al resto, si ambas secuencias son muy diferentes darán un mal alineamiento que irá empeorando según se añadan más secuencias. ClustalW/ClustalO Clustal Omega 10 es el programa de alineamiento múltiple más popular (en su versión antigua se conoce como ClustalW). Utiliza una técnica progresiva mejorada que realinea de forma iterativa las secuencias iniciales y que utiliza modelos ocultos de Markov para mejorar la eficiencia de los alineamientos. Permite obtener alineamientos múltiples de buena calidad incluso con cientos de miles de secuencias en un tiempo razonable [20]. Tcoffee T-Coffee 11 es otro programa de alineamiento múltiple de método progresivo. Su principal característica es que permite integrar en el alineamiento información estructural, de estructura secundaria o combinar diferentes métodos de alineamiento múltiple en un único resultado. 10 Clustal: Multiple Sequence Alignment T-Coffee.

17 Edición y visualización de alineamientos Para terminar el capítulo hablaremos de cómo visualizar y modificar alineamientos de una forma gráfica a partir de los archivos generados por los programas de alineamiento explicados en los apartados anteriores. Un programa de edición y visualización de alineamientos muy completo es Jalview 12. Es un programa gratuito que además permite hacer nuevos alineamientos, representar árboles filogenéticos o visualizar estructuras moleculares. Jalview se puede usar tanto en su versión online como descargarlo y usarlo en nuestro ordenador. 12 Jalview.

18 8.4. Bibliografía [1] S. F. Altschul, W. Gish, W. Miller, E. W. Myers, and D. J. Lipman. Basic local alignment search tool. J Mol Biol, 215(3):403 10, [2] D. A. Benson, I. Karsch-Mizrachi, D. J. Lipman, J. Ostell, and E. W. Sayers. Genbank. Nucleic Acids Res, 39(Database issue):d32 7, [3] U. Consortium. Reorganizing the protein space at the universal protein resource (uniprot). Nucleic Acids Res, 40(Database issue):d71 5, [4] M. O. Dayhoff and R. M. Schwartz. A model of evolutionary change in proteins, volume 5, chapter 22, pages National Biomedical Research Foundation, [5] G. H. Gonnet, M. A. Cohen, and S. A. Benner. Exhaustive matching of the entire protein sequence database. Science, 256(5062):1443 5, [6] S. Henikoff and J. G. Henikoff. Amino acid substitution matrices from protein blocks. Proc Natl Acad Sci U S A, 89(22): , [7] D. T. Jones, W. R. Taylor, and J. M. Thornton. The rapid generation of mutation data matrices from protein sequences. Comput Appl Biosci, 8(3):275 82, [8] S. Karlin and S. F. Altschul. Methods for assessing the statistical significance of molecular sequence features by using general scoring schemes. Proc Natl Acad Sci U S A, 87(6):2264 8, [9] D. J. Lipman and W. R. Pearson. Rapid and sensitive protein similarity searches. Science, 227(4693): , [10] A. G. Murzin. Can homologous proteins evolve different enzymatic activities? Trends Biochem Sci, 18(11):403 5, [11] E. W. Myers and W. Miller. Optimal alignments in linear space. Comput Appl Biosci, 4(1):11 7, [12] S. B. Needleman and C. D. Wunsch. A general method applicable to the search for similarities in the amino acid sequence of two proteins. J Mol Biol, 48(3):443 53, [13] W. R. Pearson. Effective protein sequence comparison. Methods Enzymol, 266:227 58, [14] W. R. Pearson. Protein sequence comparison and Protein evolution. PhD thesis, University of Virginia, [15] W. R. Pearson and D. J. Lipman. Improved tools for biological sequence comparison. Proc Natl Acad Sci U S A, 85(8):2444 8, [16] W. R. Pearson and T. C. Wood. Statistical significance in biological sequence comparison. PhD thesis, University of Virginia, [17] J. Pevsner. Bioinformatics and Functional Genomics. Wiley, [18] B. Rost. Twilight zone of protein sequence alignments. Protein Eng, 12(2):85 94, [19] C. Sander and R. Schneider. Database of homology-derived protein structures and the structural meaning of sequence alignment. Proteins, 9(1):56 68, [20] F. Sievers, A. Wilm, D. Dineen, T. J. Gibson, K. Karplus, W. Li, R. Lopez, H. McWilliam, M. Remmert, J. Soding, J. D. Thompson, and D. G. Higgins. Fast, scalable generation of high-quality protein multiple sequence alignments using clustal omega. Mol Syst Biol, 7:539, [21] T. F. Smith and M. S. Waterman. Identification of common molecular subsequences. J Mol Biol, 147(1):195 7, [22] D. States, W. Gish, and S. Altschul. Improved sensitivity of nucleic acid database searches using application-specific scoring matrices. Methods, 3:66 70., 1991.