Análisis genético usando datos de secuenciación masiva. Michael Hackenberg

Transcripción

1 Análisis genético usando datos de secuenciación masiva Michael Hackenberg

2 Motivación Existen diferentes situaciones en las que interesa detectar el genotipo de un individuo Identificación del portador: análisis genético de una pareja que está pensando en tener un hijo y cuyos miembros pertenecen a familias con antecedentes. Diagnóstico pre-natal: es el test genético de un feto. Puede ser realizado en los casos en los que existe riesgo de que el bebé presente genes asociados a un retraso mental o discapacidad física. Exploración del recién nacido: se realiza frecuentemente como medida preventiva de salud, presentando una ventaja obvia para el recién nacido cuando existe un tratamiento disponible. Trastornos de aparición tardía: incluye el análisis de enfermedades en adultos como, por ejemplo, cáncer y enfermedades cardiacas. Estas enfermedades son complejas y las causas para su desarrollo pueden ser tanto genéticas como medioambientales.

3 Enfermedades mendelianas

4 Ejemplos: Enfermedades mendelianas Base de datos: OMIM (Online Mendelian Inheritance in Man) Toda la información acerca de enfermedades mendelianas conocidas incluyendo genes y la relación entre el genotipo y fenotipo Hemoglobinopathies: sickle cell anaemia,thalassemia Inborn errors of metabolism:pku,alkaptonuria Albinism Cystic Fibrosis Hirschsprung disease

5 Fenotipos complejos Factores genéticos Fenotipo complejo Factores ambientales Algunos canceres Diabetes (ambos tipos) Alzheimer Adicciones Altura Etc, etc, Objetivo Corto plazo: Descubrir la base molecular de un fenotipo complejo, es decir la variación genética que puede explicar las diferencias fenotípicas entre los individuos de dos grupos (casos/controles) Largo plazo: Mejorar la prevención y el tratamiento de enfermedades

6 SNPs En un principio podríamos usar diferentes tipos de variación para detectar las diferencias entre poblaciones o grupos (sanos/enfermos) pero el análisis genético se basa frecuentemente en SNPs SNPs: Polimorfismo de nucleótido simple Suelen tener solo dos alelos, por ejemplo C/T Mas de 2/3 de todos los SNPs derivan de un dinucleótido CpG (mutación por metilación) MAF: Minor Allele Frequency (frecuencia del alelo menos frecuente) A partir de una MAF del 5% (algunas veces del 1%) se define como SNP común Los SNPs comunes se suelen emplear en los estudios de asociación

7 Tipos de variación: insercion y deleción Inserción en humano/chimpancé Deleción en ratón/rata

8 Alineamientos

9 Genotípo y haplotípo

10 Frecuencia vs. Efecto

11 Detectar variación con chips de DNA El principio de detectar variación mediante chips de DNA es el mismo que determinar los perfiles de expresión:

12 Secuenciación masiva Métodos actuales Second Generation Sequencing (Secuenciación masiva) 454 Pyrosequencing (PS) Illumina Reversible Termination (RT) SOLID Sequencing by Ligation (SBL)

13 Secuenciación

14 Secuenciación

15 Variación y genotípo SNP calling: detectar si en una posición dada existe variación Genotype calling: Detectar el genotípo de un individuo en la posición

16 Variación y genotípo Posición: chr9: Alelo de la referencia: C 8 reads indican timina en la muestra 10 reads indican citosina en la muestra Heterocigoto con genotipo: C/T

17 Detección de variación y genotípo

18 Protocolo (1) discovery: alignment of sequence reads to the reference genome and identification of candidate sites or regions at which one or more samples differ from the reference sequence; (2) filtering: use of quality control measures to remove candidate sites that were probably false positives; (3) genotyping: estimation of the alleles present in each individual at variant sites or regions; (4) validation: assaying a subset of newly discovered variants using an independent technology, enabling the estimation of the false discovery rate (FDR). Independent data sources were used to estimate the accuracy of inferred genotypes.

19 El punto de partida: FASTQ La salida del secuenciador: Los reads (lecturas) en formato GSM522374_1:1:148:931:861 TAGTTCTACAGTCCGACGATCTCGTATGCCGTCTTC + GSM522374_1:1:148:931:517 AGCTACATTGTCTGCTGGGTTTCTCGTATGCCGTCT + GSM522374_1:1:148:931:648 TGAGGTAGTAGGTTGTGTGGTTAATCGTATGCCGCT + GSM522374_1:1:148:931:770 GCTACATTGTCTGCTGGGTTTCTCGTATGCCGTCTT + Identificador Secuencia del read Calidad del read La calidad Los caracteres se pueden convertir en un score (Q, Phred score) de calidad

20 Phred Quality Score Línea de calidad: ASCII codificación B = + = 43 Codificación depende del fabricante (por ejemplo codificación Sanger para la línea de calidad de de arriba) Q(B) = = 33 (primer base) Q(@) = = 31 (tercer base) Q(+) = = 10 (cuarta base)

21 Phred Quality Score Q y probabilidad de un error de secuenciación

22 Example of extended CIGAR and the pileup output. Li H et al. Bioinformatics 2009;25: ( Author(s 2009 The

23 Formato VCF

24 Formato VCF