Detectar micrornas en datos de secuencación masiva

Transcripción

1 Detectar micrornas en datos de secuencación masiva

2 Función Introducción Un microrna es un RNA corto de entre 19 y 25 nt de longitud. Están implicados en la regulación génica post-transcripcional y probablemente también en la metilación del ADN. Los microrna se transcriben a partir de genes de ADN pero no se traducen a proteína (genes no-codificantes) Son presentes en un amplio rango de especies tanto en plantas como en animales. Muchos de ellos son altamente conservados La mayoría de los genes de microrna se ubican en regiones intergénicas y tienen su propio promotor y elementos regulatorios Aprox. 40% de los genes de microrna están ubicado en intrones se transcriben conjuntamente con el gen hospedador. Están involucrados en muchos procesos básicos (metabolismo, desarrollo, sistema inmunológico, etc.) Algunos microrna están implicados en el desarrollo de patológicas como el cáncer

3 Procesamiento Introducción La mayoría se transcriben mediante polimerasa II (algunos mediante pol III) como largos transcritos primarios (premicrorna) El pri-mirna se procesa mediante la proteína Drosha pre-mirna El pre-mirna se exporta al citoplasma mediante Exportin 5 Dicer procesa el pre-mirna en el citoplasma y genera el microrna maduro El microrna maduro se asocia con el complejo proteico RISC (RNA-induced silencing complex ) RISK inicia o la inhibición de la traducción o la degradación del mrna

4 Secuenciación Introducción Preparación de la librería Extracción del RNA total Añadir adaptadores 5 y 3. Existen adaptadores que reconocen específicamente el grupo 3 hidroxilo que es el resultado del procesamiento por Dicer Purificar RNA corto (electroforesis en gel) normalmente fragmentos entre 17 y 30 bp RT-PCR para generar la librería de cdna Punto de partida: resultado de la secuenciación en formato GSM522374_1:1:148:931:861 TAGTTCTACAGTCCGACGATCTCGTATGCCGTCTTC BB@?0:4@B@-@/A<3A7@-=@<1=@87=?<==9# Secuencia/read Calidad del read Phred Score

5 El punto de partida: FASTQ La salida del secuenciador: Los reads (lecturas) en formato GSM522374_1:1:148:931:861 GSM522374_1:1:148:931:517 GSM522374_1:1:148:931:648 GSM522374_1:1:148:931:770 GCTACATTGTCTGCTGGGTTTCTCGTATGCCGTCTT Identificador Secuencia del read Calidad del read La calidad Los caracteres se pueden convertir en un score (Q, Phred score) de calidad

6 Phred Quality Score Línea de calidad: ASCII codificación B = = 43 Codificación depende del fabricante (por ejemplo codificación Sanger para la línea de calidad de de arriba) Q(B) = = 33 (primer base) Q(@) = = 31 (tercer base) Q() = = 10 (cuarta base)

7 Phred Quality Score Q y probabilidad de un error de secuenciación

8 Diferentes pasos del análisis Preprocesamiento de los datos: filtrar reads con calidad baja, convertir formato fastq en read/count Detección del adaptador 5 : los moléculas de RNA que se secuencia suelen ser mas cortos que el read (número de ciclos) que conlleva la secuenciación parcial de adaptador. Alineamiento de los reads frente a librerías de referencia: micrornas conocidos de mirbase, Rfam, transcritos & conteo de los reads IsomiRs: Detectar, clasificar y cuantificar la existencia de IsomiRs Expresión diferencial: Detectar aquellos micrornas conocidos (y nuevos micrornas) que se expresan de forma diferencial entre dos condiciones

9 Preprocesamiento Convertir fastq en read/count que es la entrada para virtualmente todos los GSM522374_1:1:148:931:861 GSM522374_1:1:148:931:517 GSM522374_1:1:148:931:648 GCTACATTGTCTGCTGGGTTTCTCGTATGCCGTCTT Filtrar reads con calidad baja Recortar los reads (Eliminar los adaptadores) Agrupar las secuencias únicas y contar su número de copias Establecer un número mínimo de copias sequence count GCTATGACGGTTACACTCTCCGGTCG 2.0 TAGGTCAAGGTGTAGCCCATGAGGTG 14.0 AAAGGGATTTTTGGAGCAGGGAGATG 2.0 GGCTGCCTGCGGATGAAGTCGTATGG 1.0

10 Detectar los adaptadores Debido a la longitud de los microrna se secuencia parcialmente el adaptador 3 TCGTATGCCGTCCTGCTTGT Conviene buscar y eliminar el adaptador ya que este no alineará con las referencias (micrornas conocidos, genoma, etc). Hay que establecer el número de desemparejamientos y longitud mínima Equilibrio entre sensibilidad (número alto de MM y longitud corta) y especificidad (longitud baja y número alto de desemparejamientos permitidos) >16#1.0 TGATAGAATGCTCGACACGGTTCGTATGCCGTCTTC >17#1.0 CGCTCCTACCGTTGATCGTATGCCGTCTTCTGCTTG >18#1.0 GGCGGATGTAGCCAAGTGGATCGGTAGCCGTCTTTT >19#1.0 AGATTGAATGAAAGTAAAGGACGGTCGTATGCCGTC >20#308.0 TCGGACCAGGCTTCAATCCCTCGTATGCCGTCTTCT >21#1.0 CATAGTCCTATATGGAGAACCGGATCGTATGCCGTC >22#21.0 TAATTCATGATCTGGCATCGTATGCCTTCTTCTGCT >23#1.0 AGGATGGCTCGGCTGCTCGTATGCCGTTTTCTGCTT >16#1.0 TGATAGAATGCTCGACACGGT >17#1.0 CGCTCCTACCGTTGA >18#1.0 GGCGGATGTAGCCAAGTGGATCGGTAGCCGTCTTTT >19#1.0 AGATTGAATGAAAGTAAAGGACGG >20#308.0 TCGGACCAGGCTTCAATCCC >21#1.0 CATAGTCCTATATGGAGAACCGGA >22#21.0 TAATTCATGATCTGGCA >23#1.0 AGGATGGCTCGGCTGC

11 Mapear a una librería de referencia Reads >2001# TGGCTCAGTTCAGCAGGAACA >5078#102 CAAAGTGCTCATAGTGCAGGTA >6099#19 AACACACCTGGTTAACCTCTTT >8101# TGGCTCAGTTCAGCAGGAACA >9601#2087 TGGCTCAGTTCAGCAGGAACA >10003#2000 TAGCAGCAGGTAAATATTGGC Alinear los reads con parámetros: Max. Número de desemparejamientos Longitud mínima (cubertura) microrna librería de mirbase >hsa-mir-16 TAGCAGCACGTAAATATTGGC >hsa-mir-24 TGGCTCAGTTCAGCAGGAACA >hsa-mir-20b CAAAGTGCTCATAGTGCAGGTA >hsa-mir-329 AACACACCTGGTTAACCTCTTT El conteo es directamente proporcional al nivel de expresión microrna count hsa-mir-16 2 hsa-mir-24 2 hsa-mir-20b 1 hsa-mir-329 1

12 IsomiRs Mediante las nuevas técnicas de secuenciación se ha podido observar diferentes variantes llamados IsomiRs Diferentes longitudes (nucleasas o cleavage alternativo): para detectar variaciones en la longitud hay que mapear los reads frente a una librería de pre-microrna Adición de nucleótidos (NTA: non-templated additions): Solo se puede detectar si los adaptadores han sido eliminados del read previamente RNA editing: Difícil de detectar debido a la existencia de errores de secuenciación. Todavía no está de todo claro si estos cambios son funcionales o se deben a errores (secuenciación & Dicer) El programa SeqBuster ofrece los análisis mas completos para estudiar los IsomiRs

13 Expresión diferencial El objetivo final de muchos análisis es la detección de micrornas que se expresan de forma diferencial entre dos condiciones (enfermo/sano, tratado/no-tratado, etc.) Se ha desarrollado métodos específicos para la expresión digital (digital expression) RNA-seq (Marioni, et al., 2008) DEGseq (Wang, et al., 2010): edger (Robinson, et al., 2010): DESeq (Anders and Huber, 2010): miranalyzer utiliza DESeq para detectar expresión diferencial Procesar todas las muestras con miranalyzer Mediante las IDs de cada proceso se pueden formar los dos grupos

14 Detectar microrna nuevos Una posibilidad es usar la homología Mapear los reads frente a un conjunto exógeno de micrornas Detectar la posición cromosómica de los mapeados Extraer una secuencia alrededor de la posición cromosómica Determinar la estructura secundaria: Existe un hairpin (horquilla)?, La fold energy es mayor que un umbral dado? El programa mirexpress ( predice nuevos micrornas de esta forma

15 Aprendizaje automatizada Otra posibilidad es usar aprendizaje automatizada Los pasos comunes en todos los métodos son: Mapear los reads al genoma Agrupar los reads que mapean en la misma posición Extraer la secuencia genómica de la posición añadiendo secuencias flanking con tal de incluir totalmente la posible secuencia pre-microrna Determinar la estructura secundaria rechazando aquellas con no presentan un hairpin Calcular propiedades basadas en la estructura, composición de secuencia, expresión o signaturas especificas de Dicer (existencia del microrna*, etc) Entrenar un modelo (SVM, Random Forest, etc.) Predecir la probabilidad de un candidato de ser un nuevo microrna

16 Programas disponibles DSAP (servidor web): Expresión diferencial, isomirs, comparación entre especies, filtrado por Rfam, representación gráfica. mirtools (servidor web): Predicción de microrna nuevos, expresión diferencial, representación gráfica, limitado a 10 Mb SeqBuster (servidor web & local): Expresión diferencial, isomirs, representación gráfica miranalyzer (servidor web & local): Predicción de nuevos microrna, expresión diferencial (también de nuevos micrornas), color space, Los programas comparten muchos pasos de análisis Difieren en: la manera exacta o el orden en el que se llevan a cabo. número de análisis disponibles (expresión diferencial, detectar IsoMirs, predecir microrna nuevo, etc.) Sevidor web / aplicación local