RNA-Seq: Introducción al ensamblado de novo de transcriptomas

Transcripción

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3 RNA-Seq: Introducción al ensamblado de novo de transcriptomas Diego Nicolás de Panis Instituto de Ecología Genética y Evolución de Buenos Aires (IEGEBA, CONICET-UBA) RNAseq y Anotación Funcional FCEN UBA Miércoles 27 de Noviembre de 2013

4 Las secuencias generadas por las tecnologías de NGS más extendidas actualmente son considerablemente más cortas que los elementos genómicos que se pretenden estudiar > Muchos análisis comienzan con un proceso de ensamblado de esas secuencias

5 A grandes rasgos todas las estrategias se basan en una simple asunción: fragmentos muy similares se originan en el mismo lugar >Para RNA-Seq la mecánica es del estilo del ensamblado genómico de novo, pero tiene otras particularidades que son propias

6 En transcriptómica las secuencias a ser reconstruidas tienen un alto nivel de coverage no uniforme. También, repeticiones entre distintos mensajeros, como exones compartidos por distintas isoformas o variantes de splicing, o mensajeros incompletos todas características que generan dificultades a la hora de ensamblar y provocan ambiguedades

7 El tamaño de las lecturas generadas por el secuenciador tiene un papel fundamental en la complejidad del ensamblaje A mayor tamaño son menos las repeticiones que confunden al proceso de ensamblado La presición de secuenciación también juega un papel muy importante Segmentos con divergencia menor que la tasa de errores del secuenciador no van a poder ser distinguidos fácilmente por el programa ensamblador

8 Ensamblado de novo Cuando no se cuenta con un genoma de referencia o está incompleto o su calidad no es buena Teóricamente permite reconstruir todo el transcriptoma Útil para transcriptomas corrompidos (ej. células cancerígenas) Permite detectar rearreglos cromosómicos

9 Tiene un requerimiento computacional más alto Hay que filtrar ensamblados quiméricos Necesita una secuenciación de mayor profundidad Es sensible a los errores de secuenciación

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12 Particiona las lecturas provenientes de la secuenciación en muchos grafos de de Bruijn individuales, cada uno representando un determinado gen. Luego procesa los grafos individualmente para extraer las variantes de splicing enteras y separar mensajeros derivados de genes parálogos Por usar k-mers en los grafos de de Bruijn, al ser estos más cortos que el tamaño de las lecturas, se reduce el costo computacional

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15 Short Oligonucleotide Analysis Package SOAPdenovo-Trans

16 Verificación y control de calidad Después del ensamblado, un análisis de blastx del RNA obtenido contra una base de datos no redundante. Y de paso ya se avanza con la anotación funcional Como no hay un genoma de referencia, una forma de verificar la calidad del ensamblado es alinear los dominios conservados encontrados en el RNA obtenido contra el transcriptoma o genoma de alguna especie relacionada

17 Filtrado Chimeric & misassembled transcripts: se pueden encontrar a partir de lo anterior. Artificial low abundance transcripts: se pueden reducir a partir de comparar su presencia en distintas condiciones. > Complementar transcriptoma de un tejido con el de otros tejidos, el de una condición con el de diferentes condiciones

18 > Mapeos & Conteos ~Como ayer! Bowtie Tophat HTSeq RSEM HTSeq-count recibe un alineamiento (SAM/BAM) y una lista de features (GTF/GFF3) y devuelve el número de lecturas que caen en esas features. Remember: transcripts grow with reads --> NORMALIZE!

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23 Referencias > Trinity Full-length transcriptome assembly from RNA-Seq data without a reference genome. Nature Biotechnology 29, (2011) > SOAPdenovo-Trans SOAPdenovo-Trans: De novo transcriptome assembly with short RNA-Seq reads > HTSeq

24 > RSEM RSEM: accurate transcript quantification from RNA-Seq data with or without a reference genome. BMC Bioinformatics > IGV Integrative Genomics Viewer. J T. Robinson, H Thorvaldsdóttir, W Winckler, M Guttman, E S. Lander, G Getz, J P. Mesirov. Nature Biotechnology 29, (2011) Comparative study of de novo assembly and genome-guided assembly strategies for transcriptome reconstruction based on RNA-Seq. Lu B, Zeng Z, Shi T. Sci China Life Sci (2): Comparative analysis of de novo transcriptome assembly. Clarke K, Yang Y, Marsh R, Xie L, Zhang KK. Sci China Life Sci Feb;56(2): RNA-Seq Assembly - Are We There Yet? Schliesky S, Gowik U, Weber AP, Bräutigam A. Front Plant Sci Sep 25;3:220. Sequence assembly demystified. Nagarajan N, Pop M. Nat Rev Genet Mar;14(3):157-67

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