Aplicaciones guiadas: Blast. Genome Browsers.
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- Concepción Valdéz Correa
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1 Curso de Formación UEB Herramientas Bioinformáticas para la Investigación Biomédica 1 r bloque (20/06/2012) Introducción a la Bioinformática y a las Bases de Datos 3 a sesión Aplicaciones guiadas: Blast. Genome Browsers. Dr. Alex Sánchez (responsable UEB) alex.sanchez@vhir.org
2 Sesión 3 Índice de contenidos BLAST - Motivación: predicción funcional - Similaridad vs Homología - Alineamiento por parejas Sistemas de puntuación Sistemas de puntuación para proteínas Matrices de substitución (PAM, BLOSUM) - BLAST (Alineamiento contra BD) Blast en NCBI Cómo funciona? Parámetros, criterios, Bit-scores, E-values Dónde cortar? Existe homología? GENOME BROWSERS - Ensembl - NCBI Map Viewer - UCSC - VEGA
3 BLAST Búsqueda de homologías
4 Predicción funcional de una proteína/gen - Secuencia problema: Queremos averiguar sus posibles propiedades. - La evolución es un proceso conservativo Cambian los residuos en una secuencia pero se conservan las propiedades bioquímicas y los procesos fisiológicos - Si somos capaces de encontrar secuencias homólogas a la secuencia problema podemos inferir que ésta debe de tener propiedades similares a las de la secuencia conocida. - La búsqueda (el hallazgo, de hecho) de secuencias homólogas puede ser una vía para predecir la función de una proteína o un gen.
5 Similaridad vs Homología - Homología: - Descendencia de un ancestro común - Medida cualitativa: dos secuencias son homólogas o no lo son - Similaridad - Medida cuantitativa para determinar el grado de relación entre dos secuencias - Podemos usar una medida de similaridad para inferir homología
6 Sistemas de puntuación - Queremos medir el grado de similaridad de dos secuencias - Es necesario definir un criterio(sistema de puntuación) que evalue esta similaridad Ejemplo: - Match=1 - Mismatch=0 S= A T G C A G T T= A T A A G T
7 Sistemas de puntuación - El alineamiento de las secuencias puede aumentar la puntuación: - Match=1 - Mismatch=0 - Gap=-1 S= A T G C A G T T= A T A A G T p(s,t) Σ = 2 S= A T G C A G T T= A T A A G T p(s,t) Σ = 3 S= A T G C A G T T= A T A A G T
8 Sistemas de puntuación - Match=1 - Mismatch=-1 - Gap Open=-3 - Gap Ext.=-2 S= A T G C A G T T= A T A A G T p(s,t) Σ = -2 S= A T G C A G T T= A T A A G T p(s,t) Σ = -3 S= A T G C A G T T= A T A A G T p(s,t) Σ = -1
9 Sistemas de puntuación para proteínas - Match=1 - Mismatch=0 - Gap=-1 S= T T Y G A P P W C S T= T G Y A P P P W S p(s,t) Σ= 4 S= T T Y G A P P W C S T= T G Y A P P P W S
10 Sistemas de puntuación para proteínas Los AA tienen distintas propiedades posibilidades distintas de ser sustituidos unos por otros en la evolucion aliphatic hydrophobic aromatic M I L V F C S+S Y A W G T H P G C SH K R S D E N Q charged tiny polar small positive
11 Matrices de substitución A 4 R -1 5 N D C Q E G H I L K M Pairwise alignment scores are determined using a scoring matrix such as Blosum62 F P S T W Y V A R N D C Q E G H I L K M F P S T W Y V
12 Matrices de substitución BLOSUM62 S= T T Y G A P P W C S T= T G Y A P P P W S p(s,t) Σ= 14 S= T T Y G A P P W C S T= T G Y A P P P W S
13 Matrices de substitución - No hay una matriz única que se pueda usar siempre - Según la familia de proteínas y el grado de similitud esperado se usará una u otra - Las más utilizadas PAM y BLOSUM - PAM: Percent Accepted Mutation Matrix - Derivadas de alineamientos globales de secuencias próximas - PAM40 PAM250. A mayor nº, mayor distancia evolutiva - BLOSUM: BLOcks of amino acid SUbstitution Matrix - Derivadas de alineamientos locales de secuencias distantes - BLOSUM90 BLOSUM45 El nº representa porcentaje de identidad
14 Matrices de substitución - Generalmente, la matrices BLOSUM funcionan mejor que las PAM para búsquedas de similaridad local(henikoff & Henikoff, 1993). - Cuando comparamos proteinas cercanas deberíamos usar matrices PAM mas bajas o BLOSUM mas altas, mientras que para proteinas distantes sería mas conveniente el uso de matrices PAM mas altas o BLOSUM mas bajas. - Para búsquedas en BBDD sin información previa es bastante comun el uso de una BLOSUM62.
15 Alineamiento contra BD Supongamos que buscamos secuencias homólogas a nuestra secuencia problema. - Una estrategia posible es hacer alineamientos contra una base de datos de secuencias. - El algoritmo de Smith-Waterman obtiene un alineamiento local óptimo, dado un sistema de puntuacion dado - Demasiado lento para buscar contra una BBDD
16 Alineamiento vs BD - El algoritmo BLAST(Basic Local Alignment Search Tool) permite un rápida comparación(alineamiento) de una secuencia problema contra una BBDD - Es rápido y preciso (ademas, accesible via web) - Algoritmo heurístico: puede obviar alineamientos óptimos
17 Blast en NCBI
18 Blast en NCBI
19 Ejemplo
20 Ejemplo
21 Cómo funciona Blast? - Fase 1: compilar una lista de palabras (w=3) con score por encima de un threshold T (highscoring segment pairs (HSPs)) - Ejemplo: búsqueda para human RBP FSGTWYA Lista de palabras (w=3): FSG SGT GTW TWY WYA YSG TGT ATW SWY WFA FTG SVT GSW TWF WYS
22 Fase 2: Cómo funciona Blast? - Escaneo de la base de datos para buscar entradas que coincidan con la lista compilada. - Esto es relativamente rápido y fácil.
23 Cómo funciona Blast? - Fase 3: cuando encontramos un hit (es decir, una coincidencia entre una palabra y una entrada de la BBDD), extender el hit en ambas direcciones. - Calcular los scores a cada paso (usando la matriz de substitución) - Parar cuando la puntuación cae por debajo de cierto cutoff. KENFDKARFSGTWYAMAKKDPEG RBP (query) MKGLDIQKVAGTWYSLAMAASD lactoglobulin (hit) extender Hit! extender
24 Parámetros del algoritmo
25 Criterios de selección
26 Bit-scores - El valor de la puntuaciones obtenidas por un emparejamiento carecen de sentido si no se tiene en cuenta el tamaño de la base de datos y el sistema de puntuación - Los Bit-scores normalizan las puntuaciones para independizarlas de ambos factores de forma que podamos compararlas
27 E-values E = Kmn e -λs - Dada una secuencia que ha obtenido una puntuacion E- value es el número esperado de puntuaciones iguales o superiores a las de dicha secuencia atribuibles al azar. - Un E-value de 10 para una coincidencia significa, que, en una base de datos de secuencias aleatorias del mismo tamaño en la que se ha realizado la búsqueda, se podría esperar encontrar hasta 10 coincidencias con la misma puntuación o similar. - El E-value es la medida de corte más utilizada en las búsquedas en bases de datos. Sólo se informa de las coincidencias que superan un nivel mínimo - El E-value oscila entre 0 y cualquier valor
28 Dónde cortar? - Valores bajos de E se pueden interpretar como un p- valor (probabilidad de encontrar por azar una secuencia con la misma puntuación o superior) - Si queremos seguridad de que las seqs. que encontramos son realmente homologas (mas especificidad), tomaremos valores de corte pequeños (E=0.05, Bit scores altos + Alto porcentaje de identidad) - Si, en cambio, nos interesa explorar y priorizamos no perder información por delante de la seguridad (mas sensibilidad), podemos relajar el punto de corte (E=1, 10 + Bit scores normales + Alto porcentaje de identidad)
29 Existe homología? >gb AAA placental protein 14 [Homo sapiens] Length=162 Score = 33.9 bits (76), Expect = 0.34 Identities = 24/107 (22%), Positives = 46/107 (42%), Gaps = 11/107 (10%) Query 28 RVKENFDKARFSGTWYAMAKKDPEGLFLQDNIVAEFSVDETGQMSATAKGRVRLLNNWD K GTW++MA + L + A V T + +L+ W+ Sbjct 5 QTKQDLELPKLAGTWHSMAMA-TNNISLMATLKAPLRVHITSLLPTPEDNLEIVLHRWEN 63 Query 87 -VCADMVGTFTDTEDPAKFKMKYWGVASFLQKGNDDHWIVDTDYDTY 132 C + T +P KFK+ Y ++ ++DTDYD + Sbjct 64 NSCVEKKVLGEKTGNPKKFKINYTVA NEATLLDTDYDNF RBP4 y PAEP: Bit-score bajo, E-value 0.34, 22% identidad ( zona gris ). - Pero son, en efecto, homólogas. Se puede comprovar con una búsqueda BLAST con PAEP como secuencia query, y se encuentran muchas lipocalinas.
30 Genome browsers
31 Sesión 3 Índice de contenidos GENOME BROWSERS - Ensembl - NCBI Map Viewer - UCSC - VEGA
32 Ensembl Genome Browsers NCBI Map Viewer UCSC Genome Browser VEGA Genome Browser
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