PRACTICA VI: BUSQUEDA DE SIMILITUDES EN BASES DE DATOS

Transcripción

1 Objetivo: PRACTICA VI: BUSQUEDA DE SIMILITUDES EN BASES DE DATOS Ø Conocer el fundamento de los programas BLAST y FASTA y utilizarlos eficientemente para la búsqueda de similitudes de secuencias de DNA y de proteínas en bases de datos. Objetivos específicos: Ø Conocer el fundamento del algoritmo del programa BLAST Ø Conocer y aplicar las diferentes modalidades con BLAST para buscar similitudes de secuencias de aminoácidos y nucleótidos en bases de datos. Ø Conocer y emplear las herramientas especializadas de BLAST para localizar homologías remotas, analizar secuencias de genomas y buscar dominios conservados. Ø Conocer el fundamento del algoritmo del programa FASTA e identificar sus diferencias con respecto a BLAST. Ø Utilizar el programa FASTA para la búsqueda de similitudes en bases de datos. Introducción. La comparación de secuencias de nucleótidos o proteínas provenientes de uno o diferentes organismos es de gran importancia en Biología Molecular. Al encontrar similitudes entre secuencias, los científicos pueden inferir la función de genes secuenciados recientemente, predecir nuevos miembros de familias de genes y explorar relaciones evolutivas. Ahora que se han secuenciado genomas completos la búsqueda de similitud de secuencias es una tarea obligada que permite saber en cuantos otros organismos se encuentran secuencias similares, en que regiones del genoma están codificadas, en cuantos procesos metabólicos participan e incluso conocer regiones importantes para la regulación de su función. Aunque los algoritmos de programación dinámica garantizan el encontrar el alineamiento óptimo entre dos secuencias, los programas que los utilizan requieren de tiempos de cómputo y memoria muy grandes, por lo que no suelen ser convenientes para realizar búsquedas de similitudes en grandes bases de datos. Por este motivo con frecuencia se utilizan algoritmos de tipo heurístico que permiten encontrar soluciones, cercanas a las óptimas (sub-óptimas), pero con requerimientos de tiempo y de memoria mucho menores que los anteriores. BLAST es el acrónimo de Basic Local Alignment Search Tool y es la herramienta más utilizada para buscar secuencias similares en bases de datos. BLAST integra diferentes variantes de programas que se pueden utilizar para buscar diferentes tipos de secuencias contra diferentes bases de datos. A su vez, BLAST es un algoritmo heurístico para buscar similitudes locales en grandes bases de datos. 1

2 El algoritmo BLAST trata de localizar los segmentos más significativos de residuos alineados entre dos secuencias, para lo cual el programa asume que un alineamiento significativo entre dos secuencias relacionadas esta integrado por palabras que tienen en común ambas secuencias. Para alcanzar esta tarea el programa BLAST extrae todas las palabras de una longitud predefinida w que integran a la secuencia problema. Estas palabras forman alineamientos con todas las combinaciones posibles de palabras de longitud w a los que se les calcula su puntuación utilizando una matriz de substitución tal como BLOSUM o PAM. Posteriormente se seleccionan aquellos alineamientos de palabras cuya puntuación supera un valor de corte predefinido. Las palabras así seleccionadas integran lo que se denomina el vecindario. En el siguiente paso se buscan todas las palabras del vecindario en cada una de las secuencias contenidas en la base de datos. Las palabras encontradas en estas secuencias constituyen sitios a partir de los cuales se puede extender un alineamiento local sin huecos entre la secuencia problema y la secuencia de la base de datos (hits). La extensión de estos sitios o hits producirá un incremento significativo en la puntuación del alineamiento local cuando las secuencias estén relacionadas biológicamente. Por otra parte cuando no exista relación entre las secuencias, la puntuación del alineamiento decaerá rápidamente. La extensión se realiza de tal manera que se obtiene el alineamiento local sin huecos de puntuación máxima, que en BLAST se denomina Par de Segmentos de Puntuación Máxima o HSP (Del inglés High-scoring Segment Pair). Se utiliza entonces un valor de corte para seleccionar únicamente los HSPs con las puntuaciones más significativas y posteriormente se utiliza la teoría estadística para decidir si la puntuación y longitud de los segmentos es suficiente para establecer una relación evolutiva entre las secuencias o si no pueden distinguirse de las que se podrían obtener al azar entre secuencias no relacionadas. Mejoras relativamente recientes del programa BLAST permiten combinar los HSPs más significativos para producir un alineamiento local con huecos (Gapped-BLAST) o bien combinar varios resultados de secuencias altamente significativas encontradas, para producir un alineamiento múltiple, el cual se transforma posteriormente en una tabla o matriz denominada PSSM (Position Specific Scoring Matrix) con la cual se puede repetir la búsqueda de similitudes con mayor sensibilidad para encontrar homólogos remotos. FASTA es otro algoritmo heurístico para la búsqueda acelerada de similitudes en bases de datos que se basa en encontrar palabras de una longitud determinada (k-tuplos) que son compartidas entre dos secuencias y que se encuentran en una misma diagonal (alineamiento local sin huecos). El algoritmo selecciona las mejores diagonales, determina si es posible un alineamiento significativo entre ambas secuencias y calcula el alineamiento óptimo de los residuos contenidos en las diagonales seleccionadas. Tanto BLAST como FASTA utilizan teoría estadística para decidir que tan significativos son los alineamientos desde el punto de vista biológico. 2

3 Recursos informáticos utilizados: Sitios WEB a utilizar: (Servidor BLAST del NCBI). (European Bioinformatics Institute - EBI) Procedimiento Consultar en la base de datos del NCBI la información relativa a la secuencia de la proteína con número de acceso (NP_524326) y de la secuencia del mrna mensajero con número de acceso NM_ Identifique de que secuencias se tratan y a que organismo pertenecen Descripción de la página principal de BLAST. BLAST es en realidad una colección de diversos programas para la búsqueda de similitudes de secuencias. El usuario debe seleccionar la aplicación más conveniente para el problema que se desea estudiar. Al entrar a la página principal del programa BLAST del NCBI ( se puede observar que el programa consta de 3 secciones principales (figura 1): Figura 1: Secciones principales de la interfaz de usuario del programa BLAST del NCBI. La primera de las secciones permite realizar búsquedas con BLAST en los genomas de los organismos disponibles en el NCBI. La segunda sección permite utilizar las aplicaciones tradicionales de BLAST para realizar búsquedas en bases de datos de secuencias de aminoácidos o de nucleótidos. La tercera sección permite el acceso a aplicaciones especializadas de BLAST. 3

4 1. BLAST Assembled RefSeq genomes: Permite utilizar BLAST para realizar búsquedas de similitudes en genomas específicos. En la página se muestran los accesos de BLAST para los organismos más comunes, pero se dispone también de un acceso a la lista completa de los genomas disponibles. 2. Basic BLAST: Contiene accesos directos a las diferentes aplicaciones básicas de BLAST para la búsqueda en bases de datos de secuencias de aminoácidos y de nucleótidos, así como para las opciones de BLAST traducido. 3. Specialized BLAST: Contiene accesos directos para aplicaciones especiales de BLAST tales como la búsqueda de dominios conservados, analizar la posible contaminación de secuencias con vectores, etc. Búsqueda de similitudes con blastp 1. En la sección Basic BLAST dar clic en el programa protein BLAST. En la página mostrada escribir el número de acceso de la proteína NP_ en el primer recuadro de la sección Enter Query Sequence, notar que una vez que hemos dado clic sobre otra opción o cualquier otra parte de la página en la casilla de Job Title se ha puesto el número de acceso de la proteína y el nombre de la proteína d la que se trata. En la sección Choose search set seleccionar la base de datos swiss protein sequences. Verificar que en la sección de program selection esté activo el algoritmo blastp (protein- protein BLAST). Al dar clic sobre el link algorithm parameters se despliegan una serie de opciones que permiten modificar algunos parámetros antes de realizar la búsqueda como son, el número de secuencias mostradas en los resultados, el tipo de matriz a usar, el valor de corte (threshold), las penalizaciones por apertura y extensión de huecos entre otras. En este caso modificar el número de secuencias mostradas a 250 (Max target sequences) y dejar valores por defecto para los parámetros restantes. Dar un clic en el botón BLAST para realizar la búsqueda. 2. Se abre una página indicando que la búsqueda está en proceso. Cuando se utilizan las opciones por defecto, BLAST localiza automáticamente dominios conservados en la secuencia problema y esta información se muestra en esta pantalla debajo del encabezado que muestra el nombre de la proteína a la que pertenece el número de acceso tecleado. También aparece el tiempo aproximado en el que la página se actualizará automáticamente. Una vez actualizada la página muestra los resultados de la búsqueda. Identificar en la página de resultados la siguiente información: a) Database: La base de datos en la que se realizó la búsqueda (para este ejemplo debe ser swissprot) b) Query: Descripción de la secuencia utilizada como problema. c) Distribution of 100 BLAST Hits on the Query Sequence: Es una representación gráfica de los 100 resultados más significativos de la búsqueda. En la parte superior se muestra una regla con una escala representando la secuencia problema y en seguida se representan con líneas con una longitud a escala las secuencias más significativas encontradas. El color de las líneas está relacionado con la puntuación 4

5 del alineamiento según la escala de colores mostrada en la parte superior de esta gráfica. Al colocar el ratón sobre alguna de estas líneas se muestra información sobre la secuencia que representan. Al dar un clic, sobre alguna de estas líneas se avanza directamente al alineamiento entre la secuencia problema y la secuencia seleccionada. El número de secuencias mostrado en esta sección puede modificarse utilizando la opción Reformat these results mostrada en la parte superior de la página de resultados. d) Distance tree of results: Al dar un clic sobre esta opción se abre una nueva ventana que muestra un gráfico de árbol basado en las puntuaciones de los alineamientos con la secuencia problema. La secuencia problema se resalta en color amarillo. Con esta herramienta gráfica se pueden identificar fácilmente las secuencias de mayor similitud al problema. e) Sequences producing significant alignments. Muestra una lista de las secuencias más significativas encontradas, ordenadas de menor a mayor valor de expectación. La lista incluye los números de acceso (en hipervínculo para poder consultar información sobre la secuencia), parte del título de la secuencia, la puntuación (score) en bits y el valor de expectación (E value). También aparecen iconos que permiten dirigirse a otras páginas adicionales con información relativa a ciertas secuencias. Por ejemplo el icono marcado como G permite dirigirse a la base de datos Gene que muestra información detallada sobre el gen que codifica a la proteína encontrada durante la búsqueda. f) Alignments. Muestra los alineamientos de cada una de las secuencias encontradas con la secuencia problema así como información detallada sobre los mismos, como la puntuación (score), el valor de expectación (Expect), el método empleado para definir los parámetros estadísticos de la búsqueda (method), número y porcentaje de identidades, similitudes y huecos en el alineamiento. En el alineamiento se identifican las secuencias problema (Query) y la encontrada en la base de datos (Sbjct) con una numeración que permite identificar fácilmente las secciones de las secuencias involucradas en los alineamientos (recuerde que se trata de alineamientos locales). Cuando los aminoácidos comparados son idénticos se escribe la letra del aminoácido en el renglón central entre las secuencias, cuando los aminoácidos son similares se escribe un signo + (dado que son aminoácidos que dan puntuación positiva con la matriz empleada). También se incluye un cuadro de verificación junto al título de la secuencia. Con este se pueden seleccionar las secuencias más importantes para que el investigador pueda descargarlas posteriormente presionando el botón Get selected sequences. g) Resumen de la búsqueda. Al final de la página se muestra información sobre la búsqueda la cual incluye el nombre de la base de datos, el tamaño de la misma, los valores de Lambda y K empleados para el cálculo de los valores de expectación, la matriz de evaluación empelada y otros detalles tales como el tamaño del espacio de búsqueda. 3. En la parte superior de la página de resultados dar clic en el acceso directo Reformat these results. En el recuadro Format cambiar la opción Show para la presentación del alineamiento de HTML a Plain Text y presionar el botón View report. Los resultados se presenta ahora en formato de Texto que se puede grabar desde el menú Archivo del explorador. Guardar los resultados en formato de archivo de texto. 5

6 Búsqueda de similitudes de secuencias de nucleótidos con blastn. 1. Regresar a la página principal de aplicaciones de BLAST (esto se puede hacer dando clic en la pestaña Home que se encuentra en la parte superior izquierda de cualquier página de resultados o de opciones de BLAST) e ingresar ahora al programa Nucleotide BLAST. 2. En la sección Enter Query sequence escribir la clave de acceso NM_ y elegir en la sección de bases de datos la opción Others (nr etc.) y la base de datos Reference mrna sequences (refseq_rna). Verificar que en la sección Program selection se encuentre seleccionada la opción Somewhat similar sequences (blastn). Utilizar los parámetros del algoritmo que se encuentran por defecto y realizar la búsqueda presionando el botón BLAST. 3. Una vez abierta la página de resultados, estos se presentan de una manera similar a los resultados obtenidos en la búsqueda anterior. En la página también se muestran los resultados de manera gráfica en donde se representan las distribuciones de los hits encontrados sobre la secuencia problema. La opción de mostrar el árbol de distancias de los resultados. La lista de secuencias que produjeron alineamientos significativos, con las puntuaciones de cada alineamiento, el valor de expectación, la identidad y además de iconos que permiten visualizar diferente información de cada una de las secuencias que se encontraron. También se muestran los alineamientos entre cada una de las secuencias encontradas con la secuencia problema, en el renglón entre las dos secuencias se escribe una línea vertical si ambas secuencias tienen el mismo nucleótido en esa posición, los huecos están representados por guiones (-) y si retrata de nucleótidos diferentes se representan con un espacio en blanco. 4. Observar el cuadro de resultados obtenido y compárelo con el de la búsqueda anterior Qué diferencias observa en esta presentación? 5. Observe los resultados obtenidos y los valores de expectación encontrados. A que organismos pertenecen las secuencias encontradas más significativas? Los resultados son los esperados? 6. Guarde la lista de resultados en formato de archivo de texto para futuras referencias. Búsqueda de similitudes de secuencias de nucleótidos con discontiguous-megablast. El programa megablast es una versión diferente del programa BLAST diseñada para la comparación de secuencias de nucleótidos divergentes. Es más eficiente que otras versiones de BLAST para comparar secuencias de nucleótidos las cuales producen alineamientos con bajos niveles de identidad (las otras versiones de BLAST están configuradas para buscar secciones de concordancias exactas con una longitud determinada para acelerar el tiempo de búsqueda). 6

7 1. Regresar a la página principal de aplicaciones de BLAST e ingresar ahora al programa Nucleotide BLAST. 2. En la sección Enter Query sequence escribir la clave de accesso NM_ y elegir en la sección de bases de datos la opción Others (nr etc.) y la base de datos Reference mrna sequences (refseq_rna). Verificar que en la sección Program selection se encuentre seleccionada la opción More dissimilar sequences (discontiguous megablast). Utilizar los parámetros del algoritmo que se encuentran por defecto y realizar la búsqueda presionando el botón BLAST. 3. Observar el cuadro de resultados obtenido y compárelo con el de la búsqueda anterior Qué diferencias observa en los alineamientos obtenidos y los valores de expectación encontrados? Guarde la lista de resultados en formato de archivo de texto para futuras referencias. 4. Realice la búsqueda con los mismos parámetros descritos en el paso no 2. pero seleccionando el programa Highly similar sequences (megablast) Qué diferencias observa en los resultados obtenidos en este caso con respecto a los obtenidos con blastn y discontiguous megablast? 5. Guarde la lista de resultados de megablast en formato de archivo de texto para futuras referencias. Búsqueda de similitudes de secuencias de nucleótidos utilizando las opciones de BLAST traducido. Como se habrá notado, las búsquedas en las que se comparan directamente las secuencias de nucleótidos no son muy eficientes, especialmente para localizar genes en organismos evolutivamente muy. Por el contrario, las búsquedas con secuencias de proteínas son más eficientes. Las opciones de BLAST traducido permiten traducir ya sea la secuencia problema, las secuencias en las bases de datos o ambas, para buscar más eficientemente secuencias codificantes. blastx 1. En la página principal de BLAST seleccionar el programa blastx, el cual permite traducir una secuencia de nucleótidos problema en sus seis marcos de lectura posibles y hacer la comparación de los productos con una base de datos de proteínas. 2. En la sección Enter Query sequence escribir la clave de acceso NM_ La parte Genetic code permite modificar el código genético que se empleará para traducir la secuencia nucleotídica, esta opción es para mejorar la traducción dependiendo de la naturaleza del molde a traducir, dejar la opción de código genético como la predeterminada (Standard), y elegir la base de datos swisprot y realizar la búsqueda presionando el botón BLAST. 7

8 3. Comparar los resultados obtenidos con los generados con el programa blastp. 4. Observe detenidamente los alineamientos obtenidos. Observe que aunque el problema es una secuencia de nucleótidos, los alineamientos se muestran como secuencias de aminoácidos; sin embargo, la numeración del problema corresponde a la numeración de la secuencia de nucleótidos. 5. Guarde la lista de resultados en formato de archivo de texto para futuras referencias. tblastn 1. En la página principal de BLAST seleccionar el programa tblastn, el cual permite realizar una búsqueda entre una secuencia de proteína que ha sido traducida en los seis marcos de lectura posibles y una base de datos de nucleótidos. 2. En la sección Enter Query sequence escribir la clave de acceso NP_ y seleccionar la base de datos refseq_rna. Adicionalmente en la sección Algorithm parameters modificar el valor de la opción Max target sequences a 1000, esto permite que el número máximo de secuencias alineadas a mostrar sean 1000, realizar la búsqueda presionando el botón BLAST. 3. Examinar los resultados obtenidos y compararlos con los resultados que produjeron los programas blastn y megablast, en particular observe, dentro de los alineamientos significativos la variedad de organismos a los que pertenecen las secuencias estudiadas, Cuál búsqueda ha sido más eficiente para localizar genes de esta proteína en diversos organismos? 4. Observe los alineamientos obtenidos y compárelos con los obtenidos con blastx. Note ahora que el alineamiento se presenta como secuencias de aminoácidos. No obstante, si da clic en alguno de los vínculos de las secuencias encontradas podrá observar que se ingresa a un registro de una secuencia de nucleótidos. En este caso la numeración de la secuencia de la base de datos (Sbjct) corresponde a la de la secuencia de nucleótidos. Observe que además de las puntuaciones del alineamiento también se proporciona el dato frame el cual indica el marco de lectura de la traducción de la secuencia (1, 2 o 3) y el signo (+/-) la cadena que fue traducida. 5. Almacene los resultados obtenidos en formato de texto para futuras referencias. tblastx 1. En la página principal de BLAST seleccionar el programa tblastx, el cual permite realizar una búsqueda entre una secuencia de nucleótidos problema y una base de datos de nucleótidos, pero ambas traducidas en los seis marcos de lectura posibles. 2. Introduzca en la sección Enter Query sequence la clave de acceso NM_079602, dejar la opción de código genético como la predeterminada y seleccionar la base de datos 8

9 refseq_rna. Adicionalmente en la sección Algorithm parameters modificar el valor de la opción Max target sequences a 1000, esto permite que el número máximo de secuencias alineadas a mostrar sean 1000, realizar la búsqueda presionando el botón BLAST. 3. Note el tiempo requerido en esta ocasión para completar la búsqueda. Observe los resultados obtenidos y compárelos con los de búsquedas previas. En particular debe notar que la sección de los alineamientos involucra ahora varios alineamientos alternativos para cada secuencia, cada uno de ellos involucrando distintos marcos de lectura para las secuencias. Por otra parte la numeración de las secuencias esta basada en la secuencia de nucleótidos, aunque los alineamientos se muestran como secuencias de aminoácidos. Por qué aparecen varios alineamientos alternativos? Cuál sería el alineamiento correcto? 4. Compare los resultados obtenidos, en particular los valores de expectación y la diversidad de organismos involucrada Cuál de las búsquedas ha sido la más eficiente para localizar genes que codifican para homólogos en diversas especies? 5. Almacene los resultados obtenidos en formato de texto para futuras referencias. Búsqueda de homólogos remotos con PSI-BLAST. La localización de homólogos remotos con una secuencia puede resultar una labor complicada especialmente si el grado de conservación de la secuencia es muy bajo, lo que puede producir valores de expectación no significativos. No obstante, si se utiliza la información presente en homólogos más cercanos, se pueden incrementar notablemente la sensibilidad de las búsquedas. Una forma sencilla de incorporar la información de homólogos cercanos consiste en crear un alineamiento múltiple con los alineamientos más significativos y utilizarlo para buscar similitudes contra la base de datos. Para esto PSI-BLAST convierte el alineamiento en una matriz de puntuación de posiciones específicas o PSSM (De sus siglas en inglés Position Specific Scoring Matrix) y la búsqueda se repite varias veces, incorporando en cada búsqueda, los nuevos homólogos encontrados. De esta forma se incrementa notablemente la sensibilidad para la localización de homólogos remotos. 1. En la página principal de BLAST ingresar al programa Protein BLAST. 2. Para este ejemplo se buscaran homólogos de la beta globina humana (NP_000509). Se sabe que las globinas de la hemoglobina son parálogas de la mioglobina y que también poseen homólogos en organismos tan remotos en la historia evolutiva como son las plantas. Para comprobar esta teoría realice una búsqueda con blastp utilizando la clave de acceso anterior contra la base de datos PDB. Observe los resultados obtenidos encontró secuencias de mioglobinas o de globinas de plantas en esta búsqueda? 9

10 3. Ahora ingrese la misma búsqueda con la clave de acceso anterior para buscar homólogos en la base de datos del PDB, pero esta vez seleccione el programa PSI- BLAST (Position-Specific Iterated BLAST). Realice la búsqueda presionando el botón BLAST! Compare los resultados de esta primera búsqueda con los obtenidos con blastp. 4. En la página de resultados se especifica que se trata de los resultados de la iteración 1. Observe que en los resultados se marcan las secuencias con valores de expectación significativos. Estas secuencias son las que se utilizarán para construir la PSSM. Presione el botón para ejecutar la segunda iteración. Esta instrucción le mandará a una página que se actualizará cuando los resultados de la segunda iteración estén listos. Notar que ahora en la página de resultados s especifica que son los de la segunda iteración. 5. Observe los resultados obtenidos en esta segunda iteración. Qué secuencias nuevas se localizaron en esta ocasión? Observe si entre los resultados se observan resultados de mioglobinas o de la leghemoglobina (hemoglobina de plantas). Anote las claves de acceso PDB de una estructura beta globina humana, una mioglobina y de la leghemoglobina (en caso de encontrarlas). A continuación descárguelas de la base de datos PDB y visualícelas con RasMol. En verdad se les puede considerar proteínas homólogas de la beta globina humana? Imprima las estructuras para anexarlas a sus resultados. 6. Realice varias iteraciones más de PSI-BLAST. Cuántas iteraciones son necesarias para que ya no sean incluidas nuevas secuencias en la búsqueda? Búsquedas en genomas específicos. 1. Ingresar a la página principal de BLAST y dar un clic el acceso directo list all genomic BLAST databases. En la página mostrada buscar la sección Invertebrates y dar un clic en el link BLAST frente a la palabra Insects. En la página mostrada introducir la clave de acceso NP_ cambie tanto el tipo de problema (Query) y la base de datos a proteína y seleccione todos los genomas disponibles (4) presionando el botón Select all. Realice la búsqueda con los 4 genomas seleccionados presionando el botón BLAST. 2. De los resultados obtenidos localice los resultados obtenidos para el genoma de Drosophila melanogaster de la base de datos RefSeq. Presione la puntuación para visualizar el alineamiento. Posteriormente presione el acceso para ingresar a las secuencias de las isoformas de la Glutation Tranferasa o bien al acceso G, con información relativa a gen que las codifica En qué cromosoma y en que posiciones se localiza el gen que codifica para esta proteína en dicho organismo? 10

11 Búsquedas de similitudes con FASTA FASTA es otro programa heurístico para la búsqueda de similitudes en bases de datos que utiliza un algoritmo basado en un concepto similar al de la construcción de gráficas de puntos, ya que trata de localizar diagonales que corresponden a las regiones de mayor similitud entre las dos secuencias. 1. Descargue la secuencia de la proteína NP_ en el formato FASTA y utilizar el programa FASTA implementado en el EBI ( para buscar homólogos de esta proteína en la base de datos SWISPROT. Entre los parámetros a configurar del programa seleccione SCORES = 100, ALIGN = 100, HIST = yes. Examine la lista de resultados obtenidos. Utilice las siguientes opciones para visualizar los resultados: Fasta Result, MView y VisualFasta. Qué similitudes observa en los resultados de esta búsqueda y los encontrados con BLAST? Guía para el reporte de la práctica. 1) Resumir en un cuadro el número de resultados significativos encontrados para la búsqueda de homólogos de la glutatión-transferasa empleando el mrna o la proteína (según sea el caso) de Drosophila melanogaster con blastp, blastn, megablast, discontiguous-megablast, blastx, tblastn, tblastx, FASTA y SSEARCH. Emplee las bases de datos RefSeq para proteínas o mrna. Como datos adicionales incluir: clave de acceso del problema, base de datos, tamaño de la base de datos, puntuación y valor E). En función de los resultados, y tomando en cuenta el tamaño de la base de datos y su origen discuta cual herramienta logró la mayor sensibilidad. 2) Incluya tres alineamientos de la proteína glutation-transferasa, encontrados con blastp, que ilustren los casos de alta similitud (sin huecos), similitud intermedia y baja similitud (pero aún significativa). 3) Reporte resumiendo en un cuado, el número de iteración, clave de acceso, puntuación y valor de expectación, con PSI_BLAST con que se localiza a los siguientes homólogos de la beta-globina humana con PSI-BLAST: a) La alfa-globina de Homo sapiens. b) La mioglobina Humana. c) Una hemoglobina de invertebrados. d) La leghemoblobina de soya. e) Una hemoglobina bacteriana. 4) Reporte las estructuras de los homólogos empleando una representación de cartones (cintas y resortes) empleando el programa Jmol y discuta brevemente respecto a la sensibilidad de esta herramienta y la confiabilidad (especificidad) de los resultados. 11

12 Preguntas extra. 1. Investigue las características de los algoritmos BLAST y de FASTA Cuál se espera que sea más sensible para la detección de homologías remotas y porqué? Cuál se espera que funcione más rápido? 2. Con frecuencia se desea buscar similitudes con secuencias cortas de nucleótidos para el diseño de iniciadores de PCR o sondas para microarreglos. De las aplicaciones disponibles de BLAST cuál sugeriría para esta tarea? Cuáles serían las ventajas y las desventajas de utilizar BLAST para este tipo de diseños? 3. Suponga que se desea investigar la presencia de genes 16S de rrna en bacterias para la elaboración de árboles filogenéticos, cuál de las aplicaciones BLAST recomendaría para esta tarea? 4. Cuál es la importancia de traducir las secuencias de nucleótidos en los 6 marcos de lectura posibles al utilizar las opciones de BLAST traducido? Tendrá alguna relevancia esta técnica cuando hay errores en la secuenciación de DNA codificante? 5. Describa porque la realización de una búsqueda de similitudes con un alineamiento múltiple o una PSSM puede incrementar notablemente la sensibilidad para la localización de homólogos remotos. 6. Explique brevemente que ocurriría si en lugar de emplear la matriz preconfigurada por BLAST (BLOSUM62), utilizara una matriz de menor similitud. (Puede comprobarlo con los datos empleados en la práctica). 7. Investigue otros métodos más modernos que existan para buscar secuencias similares en bases de datos. 12

13 Bibliografía. 1. Altschul, S. F., et al. (1990): Basic local alignment search tool. J Mol Biol 215(3): Altschul, S. F., et al. (1997): Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs. Nucleic Acids Res 25(17): Anderson, I. y A. Brass (1998): Searching DNA databases for similarities to DNA sequences: when is a match significant? Bioinformatics 14(4): BLAST help group (2007): BLAST Program Selection Guide, NCBI. 5. Korf I, et al., (2003): BLAST, O'Reilly, USA, 6. Mount D. W. (2001): Bioinformatics: sequence and genome analysis, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, USA, pp: Nicholas, H. B., Jr., et al. (2000): Strategies for searching sequence databases. Biotechniques 28(6): , 1180, 1182 passim. 8. Pearson WR (2000): Protein sequence comparison and Protein evolution, Tutorial - ISMB Peri, S., et al. (2001): Common pitfalls in bioinformatics-based analyses: look before you leap. Trends Genet 17(9): Ye, J., et al. (2006): BLAST: improvements for better sequence analysis. Nucleic Acids Res 34(Web Server issue): W