INSTITUTO UNIVERSITARIO DE CIENCIAS MÉDICAS FUNDACION Dr BARCELO

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1 INSTITUTO UNIVERSITARIO DE CIENCIAS MÉDICAS FUNDACION Dr BARCELO TECNICATURA DE ANALISIS CLINICOS ETAPA ANALITICA DOCENTE Dra TELMA BRICH AÑO 2013 ENZIMOLOGIA DIAGNOSTICA CONTENIDO ESTRUCTURA DELAS ENZIMAS FUNCION CINETICA ENZIMATICA CLASIFICACION MODULADORES-INHIBIDORES DETERMINACIONES SERICAS MAPA CINETICO TISULAR BIOMARCADORES ISOENZIMAS ENZIMAS CARDIACAS ENZIMAS PANCREATICAS ENZIMAS HEPATICAS BIBLIOGRAFIA Diagnóstico Clínico por el laboratorio, Todd-Sanford, Editorial Salvat, Fundamentos de la Interpretación Clínica de los exámenes de laboratorio, G. Ruiz Reyes, ed. Panamericana 2da Ed 1

2 En la práctica clínica el estudio de las enzimas séricas involucra una gran variedad de patologías. Algunas enzimas tienen amplia distribución tisular así como otras son específicas de un determinado tejido considerándose de esta forma marcadoras de ciertas enfermedades. 1. ESTRUCTURA DE LAS ENZIMAS Las enzimas están en el centro de cada proceso bioquímico, actúan en secuencias organizadas catalizando cientos de reacciones: degradan nutrientes, transforman la energía química, sintetizan macromoléculas biológicas. Son macromoléculas de origen proteico y peso molecular alto. Tienen estructura primaria, secundaria, terciaria y cuaternaria. En su estructura espacial presentan regiones denominadas sitios activos que son los lugares donde se unen las moléculas de sustrato para que la enzima pueda realizar su función de catalizador. La actividad catalítica de la enzima depende de esta configuración espacial, por lo tanto es muy sensible a los cambios de temperatura, ph y concentración de sales del medio. 2. FUNCIÓN: Son Catalizadores Biológicos. Tienen como función aumentar la velocidad de las reacciones químicas. Su actividad como catalizadores se basa en reducir la energía necesaria para que se produzca una reacción química específica. Se puede considerar una enzima como: HOLOENZIMA = APOENZIMA + COENZIMA La apoenzima es la porción proteica sujeta a desnaturalización como todas las proteínas, esta desnaturalización se asocia con una pérdida de actividad enzimática. La coenzima es la porción esencial en la actividad catalítica. No es una proteína, se une transitoriamente durante la reacción. Ejemplo de coenzima : NAD: Nicotinamida adenina dinucleótido proviene de la Vitamina B3 CoA: Coenzima A proviene del Acido Pantoténico. TTP: Tiamina pirofosfato proviene de Tiamina (Vitamina B1) Los activadores o reguladores son iones metálicos que ayudan a captar el sustrato: Ej. iones zinc o magnesio. 2

3 3. CINETICA ENZIMÁTICA La cinética enzimática estudia la velocidad de las reacciones catalizadas por las enzimas. Las enzimas catalizan la conversión reversible del sustrato (S), en un producto de reacción (P), pasando por la formación de un complejo intermedio transitorio enzima- sustrato (E- S). Esto se puede esquematizar de la siguiente manera: Existen diferentes modelos para explicar la especificidad enzima sustrato: algunos autores consideran (Fisher) un modelo rígido tipo llave cerradura, otros consideran un ajuste flexible entre ambos, o la teoría más moderna en la cual se considera que tanto enzima como sustrato sufren cambios conformacionales durante la etapa de transición. De todas maneras la condición esencial es que una vez transcurrida la reacción la enzima recupera su estado conformacional original. 3

4 La medida de la velocidad de las reacciones catalizadas por enzimas se realiza siempre en las condiciones óptimas de ph, temperatura, presencia de cofactores, y se utilizan concentraciones saturantes de sustrato. La velocidad puede determinarse midiendo la aparición de los productos o la desaparición de los sustratos. Inicialmente, la enzima transforma el sustrato en producto siguiendo un comportamiento lineal. A medida que avanza la reacción, se va agotando la cantidad de sustrato y va disminuyendo la cantidad de producto que se genera por unidad de tiempo (disminuye la velocidad de la reacción), lo que se manifiesta en forma de curva asintótica. Las reacciones catalizadas por enzimas son saturables, la velocidad de catálisis no muestra un comportamiento lineal en un gráfico al aumentar la concentración de sustrato. Si la velocidad inicial de la reacción se mide a una determinada concentración de sustrato [S]), la velocidad de la reacción (Vi) aumenta linealmente con el aumento de la [S]. Sin embargo, cuando se aumenta mucho la [S], la enzima se satura y alcanza su velocidad máxima (V max ), que no sobrepasará en ningún caso. La ecuación de Michaelis-Menten se usa para describir la velocidad de reacción y la concentración de sustrato presente. 4

5 Vi = V max x [S] Km +[S] Cuando [S] es mucho menor que Km (condiciones fisiológicas) el termino Km + [S] es esencialmente igual que Km Vi = V max [S] / Km + [S] V max [S] / Km Vi = (V máx.)[s] Km Km: es la concentración de sustrato para la cual la velocidad de reacción es la mitad de la velocidad máxima. Es característico de cada enzima. El valor de Km da idea de la afinidad de la enzima por el sustrato. En el diseño de una metodología para medir la velocidad enzimática se toman en cuenta estas consideraciones, de tal forma que se mide la velocidad inicial de la reacción (Vi), antes que se consuma el 10 % del sustrato y se pueda considerar constante durante el tiempo de medida. Además no es necesario considerar la reacción inversa ya que es tan pequeño el producto que la reacción inversa apenas ocurre 4. CLASIFICACION DE LAS ENZIMAS DE ACUERDO A SU DISTRIBUCION TISULAR Las enzimas que se encuentran en el plasma pueden dividirse para su estudio en dos grupos: enzimas funcionales y enzimas no funcionales. Enzimas funcionales: Tienen una función definida y específica en el plasma y su concentración plasmática es proporcional a la del tejido donde se producen. A este grupo pertenecen la seudocolinesterasa, ceruloplasmina, lipoproteinlipasa, así como las enzimas que intervienen en la coagulación. La determinación de la actividad de estas enzimas tiene interés clínico en la evaluación tanto de la función propia de la enzima en el estudio como de la función del tejido que la sintetiza. Enzimas no funcionales: No tienen una función conocida en el plasma, ya sea porque no dispone de la cantidad necesaria de sustratos, cofactores o activadores a nivel plasmático y su 5

6 concentración plasmática es considerablemente menor que los niveles titulares. Sin embargo, normalmente existen niveles circulantes detectables de la mayoría de las enzimas no funcionales debido a la renovación celular natural o pequeños traumatismos espontáneos. Su presencia en plasma en niveles más altos de lo normal sugiere un aumento en la velocidad de destrucción celular y tisular. La determinación de estos niveles de enzimas plasmáticas puede proveer información valiosa para diagnóstico y pronóstico de algunas patologías. Estas enzimas pueden dividirse en dos grupos: 1. Enzimas de secreción Se producen en glándulas exocrinas, como páncreas y próstata, así como en tejidos como mucosa gástrica y hueso. En adenocarcinoma y osteosarcoma se observa un aumento importante de la actividad plasmática de las fosfatasas ácida y alcalina. 2. Enzimas del metabolismo intermedio: Su concentración intracelular es miles de veces más alta que en el plasma. El aumento de la permeabilidad de la membrana plasmática puede conducir a la liberación a la circulación general. Algunas de las enzimas que corresponden a este grupo son: aspartato amino transferasa (AST o GOT), glutámico pirúvico transaminasa (GPT), lactato deshidrogenada (LDH), creatín quinasa (CK), amilasa, γ-glutamiltranspeptidasa (γ-gt). 5. CLASIFICACIÓN DE ENZIMAS SEGÚN LA RECCION QUE CATALIZA Se siguen las directrices de la comisión internacional de enzimas de bioquímica, según la cual todas las enzimas se denominan con las iniciales EC y cuatro números separados por puntos. El primer número define la clase El segundo número indica la subclase El tercer número indica la sub-subclase El cuarto número es su número de serie específico. (Ej. EC es la Lactato Deshidrogenasa. El primer 1 nos dice que pertenece a la clase de las oxidorreductasas; el siguiente 1 nos dice que es de la subclase oxidasa; el tercer 1 que la sub-subclase es la de las citocromooxidasas y, por último, el 27 nos dice que ocupa el lugar 27 de las citocromooxidasas) Existen 6 clases posibles de enzimas: CLASE I: Oxidorreductasas (Catalizan reacción REDOX) CLASE II: Transferasas (Catalizan la transferencia de grupos funcionales que contengan C,N,P de un compuesto donante a otro receptor) CLASE III: Hidrolasas (Catalizan reacciones de hidrólisis) 6

7 CLASE IV: Liasas (catalizan reacciones reversibles de adición de un grupo a un doble enlace) CLASE V: Isomerasas (catalizan la reorganización de la estructura de un sustrato sin modificar la formula empirica) CLASE IV: Ligasas (catalizan reacciones de unión de sustrato que necesitan energía aportada por ATP, GTP) 6. MAPA ENZIMATICO TISULAR Es la descripción de un órgano en función de la concentración relativa de las enzimas que contienen sus células. El mapa enzimático tisular está constituido, por la cantidad de cada una de las distintas enzimas que contienen todas las células de un determinado órgano. La medida de los diversos mapas enzimáticos séricos, por su parte, constituye el intento de lograr la especificidad bioquímica de los diferentes órganos. Cuanto mayor sea la cantidad de enzimas que se determinen, más completo será el mapa y mejor podrá determinarse el cuadro patológico. Aunque desde el punto de vista biológico son muchas las enzimas objeto de atención, el interés clínico se centra en el estudio de aquellas cuyas variaciones son patognomónicas, es decir, indicadoras de enfermedad o, por lo menos, de determinadas alteraciones funcionales. Es adecuado determinar más de una enzima en el suero, por el hecho de no existir enzimas que sean simultáneamente órgano específicas y lo suficientemente sensibles. 7. MODULADORES DE LA ACTIVIDAD ENZIMÁTICA Las enzimas pueden ser inhibidas o activadas. La inhibición puede ser reversible o irreversible. Generalmente la inhibición es reversible y la cinética de la inhibición puede tener tres patrones: competitiva, no competitiva y acompetitiva. Los inhibidores competitivos compiten con el sustrato por el sitio catalítico de la enzima, su efecto en la cinética es aumentar el valor de Km. Los inhibidores no competitivos se unen a un sitio de la enzima diferente del sitio catalítico, o eliminan un cofactor necesario para la enzima. Su efecto cinético 7

8 es disminuir la Vmax, porque reducen la capacidad de la enzima para transformar el sustrato en producto. Los inhibidores acompetitivos son raros, actúan uniéndose al complejo E-S e impidiendo su disociación. El efecto cinético es disminuir tanto Km como Vmax. 8. DETERMINACION DE NIVELES SÉRICOS DE ENZIMAS Las determinaciones enzimáticas en el laboratorio se basan en demostrar in vitro la actividad catalítica que una enzima tiene in vivo, por lo tanto, el sistema en estudio mide su funcionalidad. La actividad de un enzima se mide mediante determinación de la cantidad de sustrato transformado en producto por unidad de tiempo en condiciones precisas de temperatura, ph, etc. a. Unidades de medición Los laboratorios clínicos expresan la actividad enzimática en UI/ L. Las UI/ L se definen como la cantidad de enzima que cataliza la conversión de 1mol de sustrato o coenzima por minuto en las condiciones de la prueba. b. Factores que afectan la velocidad de la reacción: 8

9 Enzima : actividad enzimática Sustrato Inhibidores Activadores Temperatura ph Fuerza iónica Concentración de proteínas Interferentes Para que una prueba enzimática sea válida, la concentración de la enzima debe ser el único factor limitante, es decir que el resultado refleje la cantidad de enzima y no se vea afectado por otras sustancias o circunstancias. Debe tenerse en cuenta la posible interferencia por muestras obtenidas con anticoagulantes (resultados falsamente elevados o disminuidos) por hemólisis de la muestra (se eleva falsamente la LDH por ejemplo), por opalescencia o característica lechosa del suero (produce lecturas variables de absorción de luz). c. Desarrollo de la reacción enzimática La actividad enzimática se expresa en unidades que habitualmente representan una de las siguientes circunstancias: 1. Aumento de la concentración de uno de los productos. 2. Descenso de la concentración del sustrato. 3. Cambio en la concentración de la coenzima como medida del desarrollo de la reacción. Ejemplos: 1. La LDH (Enzima láctico deshidrogenasa) cataliza la reducción de piruvato a lactato y la simultanea oxidación de NADH a NAD+ (nicotinamida adenina dinucleótido,abreviado NAD + en su forma oxidada y NADH en su forma reducida) LDH Piruvato + NADH + H+ Lactato + NAD+ 2. El NADH absorbe en el rango de la luz ultravioleta (340 nm), propiedad utilizada para la determinación enzimática. La mezcla de reacción aporta piruvato y NADH, como sustratos, en un medio de ph adecuado 3. La reacción se inicia por el agregado de muestra en estudio que contiene la LDH que se pretende cuantificar. 9

10 4. Utilizando un espectrofotómetro se mide la disminución de absorbancia a 340 nm, indicador del consumo de NADH. La velocidad de desaparición del sustrato es proporcional a la cantidad de enzima LDH presente en la muestra. Si los sustratos o productos carecen de una propiedad espectral de medición, se utiliza el acople de la reacción que cataliza la enzima de interés a una segunda reacción cuyos sustratos o productos pueden determinarse por espectrofotometría. Ejemplo: Las transaminasas son enzimas que catalizan la transferencia el grupo amino de un aminoácido a un cetoácido. Existe una gran variedad de transaminasas de las cuales dos son usadas frecuentemente como indicadores de daño hepático o cardíaco: la glutámico pirúvico transaminasa (GPT) y la glutámico oxalacético transaminasa (GOT) GPT Alanina + α-cetoglutarato piruvato + glutamato (Actividad in vivo) GPT (Fosfato de piridoxal) Alanina + α-cetoglutarato Piruvato + glutamato LDH 10

11 Piruvato + NADH + H Lactato + NAD+ (Determinación in vitro) En la reacción in vitro ni los sustratos ni los productos absorben luz en el rango UV o visible, por lo cual la determinación de las transaminasas se realiza a través de una reacción acoplada que utiliza como sustrato un producto de la reacción anterior. La velocidad de desaparición de NADH, determinada midiendo absorción de luz 340 nm, será proporcional a la actividad de GPT presente en la muestra. 9. MARCADORES BIOQUÍMICOS Los biomarcadores o marcadores bioquímicos son sustancias que se encuentran en el suero y que indican el daño de un órgano o tejido específico. La mayoría de las enzimas se encuentran dentro de las células, donde son necesarias para el metabolismo. Los niveles plasmáticos normalmente son muy inferiores al 1% de los niveles celulares y reflejan la tasa de liberación de la enzima debido al proceso de recambio celular. Por esta razón el aumento del nivel plasmático de muchas enzimas se pueden considerar como marcadores de daño celular.. Isoenzimas Son isoformas de una enzima. Catalizan la misma reacción química pero difieren en general en su secuencia de aminoácidos y tienen diferentes parámetros cinéticos, pero al encontrarse distribuidas en diferente proporción en diferentes tejidos, su actividad se ajusta al metabolismo de cada uno de ellos. Esta característica hace que su determinación se utilice para identificar el tejido dañado que libera la enzima al plasma. Ejemplos: 1. Lactato Deshidrogenasa LDH está ampliamente distribuida por todos los tejidos pero es más abundantes en corazón, músculo esquelético, riñón e hígado. Está constituida por cuatro subunidades, que pueden ser de dos tipos: subunidad H, específica del corazón y subunidad M del músculo. Estas subunidades se combinan de 5 formas diferentes dando lugar a 5 isoenzimas: LDH 1(4H), LDH 2 (3H/1M), LDH 3 (2H/2M), LDH 4 (3h/1H) y LDH 5 (4M). 11

12 La LDH existente en el miocardio contiene más isoenzimas LDH 1 y LDH 2, y en el hígado y músculo esquelético mayor proporción de LDH 4 y LDH Cretina Quinasa CK: es una transferasa que cataliza la formación de ATP requerido por los sistemas contráctiles. Es una enzima citoplasmática y mitocondrial ampliamente distribuida por los tejidos, pero en forma decreciente se localiza en músculo esquelético, músculo cardíaco, placenta, cerebro y otros tejidos. La CK-MM predomina en el músculo esquelético, en el miocardio también predomina la CK-MM pero hay entre un 13-22% de CK-MB. En el cerebro hay un 100% de CK-BB. El biomarcador ideal reúne las siguientes características: 1. Está ausente o con valores sin cambios, en ausencia de daño. 2. Aumenta su concentración en forma proporcional con el grado de daño. 3. Es específico de un órgano o tejido. Interés clínico 1. En procesos inflamatorios aparecen en plasma en primer término enzimas de bajo e intermedio peso molecular (por ej: en las hepatitis, encima de entre a Da). 2. El nivel de enzimas en el suero que se observa en una lesión es generalmente proporcional a la magnitud de membrana celular afectada. 3. En los daños celulares mínimos, primero pasan a la sangre las enzimas citoplasmáticas y en caso de daño extenso o más intenso, lo hacen las enzimas localizadas en las membranas de las organelas (por ej: la glutámico deshidrogenasa (GLDH) mitocondrial). 4. Hay factores que alteran la permeabilidad selectiva de la membrana celular y que provocan una salida al espacio extracelular de enzimas intracelulares. Los más conocidos son: Baja concentración de oxígeno (hipoxia) Agentes químicos (iodoacetato, cianuro, tetracloruro de carbono) Agentes físicos (ph, temperatura osmolaridad) Algunos virus. 12

13 Para los fines diagnostico, una elevación de las enzimas celulares en el plasma es equiparable a una lesión celular. Es importante tener en cuenta que las enzimas cuyos niveles aumentan en suero raramente derivan de una necrosis celular sino que lo hacen por un grado sucesivo de liberación debido a que la biosíntesis enzimática se conserva mientras la célula vive. En los casos extremos de necrosis, después de un breve lapso, las actividades en el suero disminuyen por falta de nuevos aportes debido a una biosíntesis proteica nula. 10. ASPECTOS PRÁCTICOS CONDICIONES DE LA MUESTRA No utilizar muestras que hayan sido congeladas y descongeladas varias veces para evitar desnaturalizar irreversiblemente la proteína constituyente de la enzima. Separar lo antes posible el coágulo del suero porque hay ciertas enzimas como la LDH y la Fosfatasa Ácida que se encuentran en los hematíes y plaquetas que pueden liberarse al medio. No trabajar con muestras hemolizadas porque en estas aumentan los componentes intraeritrocitarios como el LDH y AST. Evitar el estasis venoso prolongado durante la extracción porque esta produce hipoxia y aumento de permeabilidad en las células sanguíneas. Evitar en envejecimiento de las muestras CONDICIONES DE LOS REACTIVOS Y DEL INSTRUMENTAL Revisar siempre la fecha de caducidad de los reactivos, sobre todo la solución de sustrato y comprobar que se han recibido y almacenado en las condiciones adecuadas de temperatura. Cuando se reconstituye el reactivo, anotar la fecha y seguir las instrucciones del fabricante respecto al almacenamiento y fecha de caducidad. El aparato para medir la actividad enzimática, bien sea manual o automático debe cumplir 2 requisitos: debe ser un espectrofotómetro fiable que mida de forma correcta a la longitud de onda del ensayo. Además tiene que tener un buen sistema de regulación de temperatura, de tal forma que permita mantener la temperatura de trabajo en un margen de 0,1 ºC. 11. INTERPRETACIÓN DE LOS RESULTADOS A. ENZIMAS CARDÍACAS 13

14 El corazón (y también el músculo esquelético) presentan altas concentraciones de enzimas y proteínas implicadas en la generación de energía y la contracción muscular. Enzimas como la CK, la AST y la LDH están presentes en concentraciones altas, tanto en el músculo esquelético como en el cardíaco, aunque existen diferencias en sus cantidades relativas y, en el caso de CK y LDH, de sus patrones de isoenzimas Marcadores bioquímicos de daño cardíaco Infarto de miocardio: Es la muerte de parte de las células del músculo cardíaco que se produce secundaria a una isquemia (falta de irrigación sanguínea). Los criterios comúnmente aceptados de diagnóstico de infarto agudo de miocardio (IAM), requiere la presencia de dos de los tres siguientes criterios: 1. dolor torácico 2. cambios en el ECG 3. aumento y disminución característica de los biomarcadores cardíacos. Aunque la CK y, en menor grado la LDH, son sensibles al daño muscular, sólo sus isoenzimas distinguen el daño cardíaco del de músculo esquelético. 1. Mioglobina La mioglobina es una proteína compuesta por una cadena polipeptídica y un grupo prostético Hemo que está presente en todas las fibras del músculo estriado, y cerca de 2% se encuentra en tejido de masa cardiaca y esquelética, pero está ausente en el músculo liso. La función principal de la mioglobina es transportar oxígeno de la membrana reservorio de oxígeno en el músculo Debido a que se trata de una molécula de poco peso molecular «escapa» rápidamente hacia la célula miocárdica demandante, ésta puede ser detectada 2 horas después de ocurrido el infarto La mioglobina es el primer marcador que se eleva después del daño celular miocárdico. No es una enzima. Marcador precoz. No cardio específica. 2. Troponina Es un complejo de proteínas estructurales y regulatorias del músculo cardíaco y esquelético. Consiste de tres subunidades: Troponina T, Troponina I y Troponina C. Las troponinas TnT y TnI están presentes en el músculo esquelético y cardíaco. Los niveles séricos de troponinas son habitualmente muy bajos y resultan indetectables. Por lo tanto son altamente sensibles y específicas, siendo capaz de detectar incluso, zonas microscópicas de infarto de miocardio. Las Troponinas inician su elevación a las 3 a 7 horas de producido el evento y se 14

15 mantienen por encima de los valores normales de 7 a 14 días, pudiendo servir estas para un diagnóstico retrospectivo. Resultados falsos positivos, han sido observados en la Troponina T en pacientes en situación de Insuficiencia Renal Terminal, sometidos a diálisis. No es una enzima. Cardioespecífica. Sensible. Elevación precoz. Metodología: Quimioluminiscencia- Inmunocromatografia 3. Creatin kinasa La creatina quinasa cataliza la producción de fosfocreatina a través de la fosforilación de una molécula de creatina, consumiendo una molécula de ATP en el proceso. La función de la CK en músculo es contribuir al almacenamiento de energía en forma de creatina fosfato usando ATP y creatina como sustratos, durante los períodos de descanso. En la contracción, la creatina fosfato es escindida a creatina y ATP por acción también de la CK. CK Creatina P + ADP Creatina + ATP La CK necesita magnesio como cofactor. Es un dímero de subunidades catalíticas. Las dos subunidades se denominan M, de músculo y B, de cerebro en inglés (brain). Las tres isoenzimas resultantes son: CK- MM, CK-MB y CK-BB. La CK se encuentra distribuida por todo el cuerpo, pero solo se encuentra en cantidades significativas en músculo y cerebro, aunque la CK de cerebro prácticamente nunca cruza la barrera hematoencefálica hacia el torrente sanguíneo. En el músculo esquelético, la CK-MB supone entre el 0 al 6% de la CK total. En un corazón normal, entre el 15 y el 20% de la CK es CK-MB. Por esto, la CK-MB sirve como marcador de daño cardíaco. La CK-BB es la dominante en cerebro y músculo liso. Enzima CK-MB cardioespecífica. Se mide actividad enzimática. Valores de referencia Los valores normales disminuyen en personas de mayor edad. Los rangos de referencia para CK se ven afectados por la cantidad de masa muscular, la edad, el sexo, la raza y la actividad muscular. Variables pre analíticas El ejercicio es la variable que más influye en los valores de CK, sobre todo el ejercicio de fuerza, o al ejercicio intenso. La inactividad grave disminuye los valores de CK, por eso los valores de pacientes hospitalizados disminuyen con respecto a los valores al momento de la admisión. 15

16 Los niveles de CK aumentan con cualquier tipo de daño muscular, incluyendo inyecciones intramusculares. En el embarazo, puede existir un leve aumento de la CK. La isoenzima CK-BB, puede alcanzar un 10% del total, por su producción placentaria. La CK-MB está presente en cantidades mínimas en individuos normales. La hemólisis puede causar un ligero aumento de los niveles de CK debido a la presencia de la Adenilato kinasa. Puede encontrarse elevada por dosis elevadas o inadecuadas de estatinas, en polidistrofias, miopatías, espasmos musculares. La CK no es estable cuando se mantiene a temperatura ambiente por unas horas. Es estable durante meses si se congela. La variación diaria (CV intraindividual) en individuos con actividad basal es de 20 a 30%. Métodología. Determinación anal tica CK (suero del paciente) Fosfato de creatina + ADP creatina +ATP HK ATP + D-glucosa ADP + G6P G 6 PDH G6P + NADP+ D 6 fosfogluconato + NADPH + H+ Fundamento: Reacción enzimática cinética acoplada. La velocidad de formación de NADPH es directamente proporcional a la actividad catalítica de la CK y se determina midiendo el aumento de absorbancia fotométricamente a 340 nm. Isoenzima CK-MB Las tres isoenzimas de la CK se encuentran en el citosol celular o asociada con estructuras miofibrilares. La ventaja de la CK-MB sobre la CK Total reside en su mejor especificidad de órgano.. La CK-MB aumenta a las 3 a 6 horas tras el inicio de los síntomas de IAM y el máximo se alcanza entre las 12 y 24 horas. La cirugía cardíaca, la miocarditis y la cardioversión eléctrica, cateterización coronaria, anginas de pecho, también elevan a menudo los niveles séricos de la isoenzima MB. Por todo ello, ha sido necesario desarrollar marcadores bioquímicos cardíacos más específicos. Métodos para determinar isoenzimas de CK (CK MB) a) Métodos no inmunológicos: 16

17 Electroforesis: Técnica semicuantitativa que conduce generalmente a una sobreestimación de la CPK-MB. Lenta y poco práctica, sobre todo en un Laboratorio de Urgencias. Cromatografía de intercambio iónico. No garantiza la separación absoluta de las isoenzimas MB y BB. b) Métodos inmunológicos: 1. Inmunoinhibición: CK-MB actividad. Es un método inmunológico indirecto. Este método permite medir la actividad de la subunidad B de la isoenzima MB, después del bloqueo específico de las subunidades M (de MM y de MB) por un anticuerpo específico. La actividad residual, después de la inmunoinhibición, corresponde a la MITAD de la isoenzima MB. Interferencia por hemolisis. 2. Métodos basados en la medición de masa:(no ACTIVIDAD) Técnicas radioinmunológicas: IRMA Técnicas enzimoinmunológicas (CK-MB masa): mediante el uso de anticuerpos monoclonales específicos. Éste método es sensible a la interferencia de la adenilatoquinasa, y a diferencia de lo que ocurre con el método de inmunoinhibición permite su realización en una muestra de sangre hemolizada. Proporciona buenos resultados, su determinación está automatizada, es rápida y por tanto, adaptable al Laboratorio de Urgencias, siendo este el método de elección. El desarrollo de anticuerpos monoclonales permite en el laboratorio de urgencias determinar por el método de INMUNOCROMATOGRAFÍA simultáneamente: Mioglobina- CK masa y Troponina I. 4. Lactato dehidrogenasa (LDH) Es una enzima, localizada exclusivamente en el citoplasma de la célula, que transfiere H+ (deshidrogenasa) y cataliza la oxidación reversible de L-lactato a piruvato. Sus isoenzimas conocidas son: LD1, LD2, LD3, LD4, LD5. Metodología de determinación:fundamento LDH (suero del paciente) Piruvato + NADH + H+ Lactato + NAD+ 17

18 Fundamento: La velocidad de disminución de NADH se mide fotométricamente y es directamente proporcional a la actividad de la LDH en la muestra o control. Para la cuantificación de las isoenzimas se pueden utilizar métodos no inmunológicos (electroforesis) y métodos inmunológicos. Mediante éste último se determina directamente la LD1, tras el tratamiento del suero por un anticuerpo dirigido contra la subunidad M de la LD, que elimina las isoenzimas Ld2, LD3, LD4 y LD5 5. Aspartato amino transferasa (AST)(GOT) Es una enzima de localización mitocondrial y citoplasmática que cataliza la transferencia reversible del grupo amino desde el aspartato al a-cetoglutarato. Metodología de la determinación: Método enzimático cinético. Reacción acoplada. GOT (suero del paciente) 2-oxoglutarato + L-aspartato Glutamato + Oxalacetato MDH Oxalacetato + NADH + H+ Malato + NAD+ Fundamento: La velocidad de disminución del NADH se mide fotométricamente (a 340 nm) y es directamente proporcional a la actividad de AST en la muestra problema o control. El contenido hístico de AST, de mayor a menor concentración tisulares: Cardíaco. Hepático. Músculo esquelético. Riñón. Cerebro. Páncreas. Bazo. Pulmón. Eritrocitos. Se encuentra elevada en suero (sangre), en las enfermedades hepáticas, necrosis miocárdica, necrosis del músculo esquelético, distrofia muscular progresiva y 18

19 dermatomiositis, pancreatitis aguda, embolia pulmonar, necrosis renal y cerebral, hemólisis, ejercicio físico intenso, después de la administración de opiáceos, salicilatos o eritromicina. Es normal en las enfermedades musculares de origen neurogénico En la Necrosis Miocárdica, se eleva a las 6 a 8 horas después del comienzo de los síntomas, alcanza el pico a las 18 a 24 horas y vuelve a la normalidad a los 4 a 5 días. La AST (GOT) no presenta ventajas sobre la CPK y la LDH: no es específica del miocardio y no aparece en la circulación de forma muy precoz. RESUMEN El ascenso característico de los Marcadores Séricos se produce en todos los enfermos con IAM clínicamente (ECG con onda Q) demostrado. Los niveles de CPK Total y de CPK-MB no suelen aumentar en la Angina Inestable. Sin embargo, cerca de la tercera parte de los enfermos, que se cree padecen Angina Inestable a juzgar por la ausencia de la elevación de la CPK Total y la CPK-MB, presentan elevaciones de la ctnt o ctni, muy sugerentes de Microinfarto o Daño Miocárdico Menor. El hallazgo de una elevación de la Troponina, incluso ante valores normales de CPK Total y CPK-MB, sugiere un pronóstico desfavorable, por lo que debe considerarse que estos enfermos han sufrido un Infarto de Miocardio y se le debe tratar como tal. 19

20 Para confirmar el Diagnóstico de Certeza de Necrosis Miocárdica, los Marcadores Séricos Cardíacos deben medirse en el momento del ingreso del paciente en el Centro Hospitalario, a las 2 horas, a las 4 horas, a las 6 horas, a las 9 horas después y, de nuevo, a las 12 y 24 horas del ingreso sí el diagnóstico sigue siendo dudoso. B. ENZIMAS PANCREATICAS Ante la sospecha de pancreatitis se realizan, habitualmente los análisis de amilasa y, menos frecuentemente, de lipasa. Si estas enzimas están elevadas en suero, se confirma el diagnóstico de pancreatitis. La amilasa y la lipasa pueden provenir de otras fuentes distintas del páncreas, entonces empleando los dos análisis se aumenta la certeza del diagnostico. Una alternativa válida es determinar la isoenzima específica de páncreas. La interpretación de la medida de amilasa sérica total está dificultada por la isoenzima salival que puede producir falsos positivos, y por la presencia en individuos normales de macroamilasas, que dan valores altos de amilasemia. 1. Amilasa La amilasa presente en sangre y en orina es predominantemente de origen pancreático y salival (isoenzimas P y S, respectivamente).contienen al menos un átomo de calcio por molécula, este metal es necesario para su actividad catalítica. Macroamilasemia: es la elevación persistente de la actividad de la amilasa sérica sin signos clínicos de alteración pancreática. Se atribuye a la presencia de 20

21 complejos macromoleculares de amilasa unida a inmunoglobulinas, cuyo mayor tamaño impide la eliminación renal, prolongando su vida media. Determinación de amilasa total en suero y orina La amilasa es estable en suero y en orina una semana a temperatura ambiente, y refrigerada se mantiene estable por seis meses en contendores bien cerrados. Se puede conservar congelada por mucho más tiempo. No se debe medir en muestras de plasma anticoagulado con citrato u oxalato, ya que secuestran el calcio necesario para la actividad de la enzima. Existen numerosos métodos para medir la actividad de amilasa, basados en diferentes principios y sustratos. 1. Análisis sacarogénicos, donde la cantidad de azúcares reductores formados se determinan después de que son incubados el suero y un sustrato de almidón. 2. Métodos amiloclásticos, que sigue la disminución de la concentración del sustrato de almidón cuando se incuba con el suero. 3. Métodos enzimáticos en los cuales la maltosa formada es metabolizada (por lo general a través de la glucosa) en una serie de reacciones que generan NADH 4a. Métodos enzimáticos que cuantifican la liberación de p-nitrofenol a partir de maltopentaosido de p-nitrofenol y sustratos de hexaosido. 4b. Métodos enzimáticos que cuantifican la liberación de 2-cloro-p-nitrofenol a partir del sustrato 2-cloro-pnitrofenil- α-d-maltotriosido (CNPG3). -Cloro-p- CNPG3 (2-cloro-p-nitrofenil- α-dnitrofenol α-amilasa La α-amilasa reacciona directamente con el CNPG3 para liberar 2-cloro-pnitrofenol que es medido a 405 nm. El incremento en absorbancia a 405 nm es proporcional a la cantidad de α-amilasa en la muestra. Independientemente del método elegido debe evitarse la contaminación de la muestra con saliva, debido a que su contenido en amilasa es 700 veces superior al del suero. El fraccionamiento de las isoenzimas de amilasa puede realizarse por medios físicos como la electroforesis, cromatografía. Otra alternativa es por inhibición química empleando un inhibidor proteico específico de la amilasa salival. Existe un kit comercial con este método. También existe un método de inmunoinhibición. No es común el dosaje de las isoenzimas en nuestro medio. Interpretación clínica Se observan elevaciones de amilasa sérica y urinaria en una variedad de alteraciones: 21

22 Pancreatitis aguda, su elevación en suero se produce dentro de las 6 a 48 hs siguientes al comienzo de la patología. Su valor no tiene correlación con la gravedad de la enfermedad. La actividad retorna a valores normales en tres a cinco días, en formas edematosas leves de la enfermedad. La amilasa urinaria aumenta en pancreatitis aguda dentro de las primeras horas de la elevación sérica. Se pueden encontrar resultados falsos negativos en orina si la muestra se recoge muy pronto o muy tarde, o en pacientes con necrosis fulminante donde la producción de amilasa disminuye o puede cesar. Puede haber casos de aumento de amilasa urinaria sin aumento de la sérica. Un 20% de los pacientes con pancreatitis tienen amilasemia normal. Pacientes hiperlipidémicos con pancreatitis tienen valores normales de amilasa en suero y orina., se cree que los triglicéridos podrían inhibir la actividad de amilasa. La amilasa puede aumentar en pacientes con carcinoma hepático. Se eleva en el 60% de pacientes con cetoacidosis diabética. Puede aumentar en pacientes con colecistitis o úlcera péptica, transplante renal, resección gástrica, hepatitis viral, embarazo ectópico interrumpido, cáncer de pulmón. Amilasa aumentada en líquido ascítico puede ocurrir en: pancreatitis, seudoquistes pancreáticos perforados, roturas del conducto pancreático, cáncer de páncreas. 2. Lipasa Es una glucoproteína producida por el páncreas. Las lipasas son enzimas que hidrolizan ésteres de glicerol a ácidos grasos de cadena larga. Para su actividad catalítica completa necesita colipasa y sales ácidos biliares. La colipasa se produce en el páncreas y está presente en el suero, pero en cantidad insuficiente para activar la lipasa, entonces para medir la actividad de la lipasa, se debe añadir colipasa al reactivo. La lipasa también está presente en hígado, estómago, intestino, leucocitos, adipocitos y leche. El calcio es necesario para la máxima actividad de la lipasa, pero a altas concentraciones tiene efectos inhibidores. Los metales pesados y la quinina inhiben la actividad de la lipasa. Por su pequeño tamaño, la lipasa filtra por el glomérulo, pero se reabsorbe completamente, entonces no se encuentra en orina. Metodología. Determinación analítica La Lipasa pancreática humana cataliza una reacción de dos etapas: el 1-2- diglicerido se hidroliza a 2-monoglycerido y a los ácidos grasos. El 2- monoglycerido es hidrolizado más a fondo por la lipasa del monoglicérido (MGLP) al glicerol y a los ácidos grasos. El glicerol entonces se cuantificado usando una 22

23 reacción de GPO-Trinder de primer orden. Los cambios de la absorbancia se miden a 550nm. Interpretación clínica Pancreatitis: Es la autolisis del parénquima del páncreas exocrino. Esto determina la liberación a la circulación de las 2 enzimas: la Lipasa Pancreática y la -Amilasa. Las dos se filtran por el glomérulo renal pero la Lipasa se reabsorbe en el túbulo y la - Amilasa sí aparece en orina. Para diagnosticar la pancreatitis aguda se determinan Lipasa y -Amilasa en sangre y -Amilasa en orina. Estas enzimas aparecen elevadas en el plasma a las 6-8 horas y alcanzan su máxima concentración entre las horas, normalizándose entre el 2º-8º día. En la orina, la -Amilasa aparece elevada a las 5-8 horas después de hacerlo en el plasma y se normaliza varios días después de normalizarse en el plasma. El aumento de lipasa no es específico de pancreatitis aguda, también se encuentra aumentada en pancreatitis crónica, obstrucción del conducto pancreático, enfermedades renales, colecistitis aguda, obstrucción o infarto intestinal, úlcera duodenal, enfermedad hepática, alcoholismo, cetoacidosis diabética, y otras. C. ENZIMAS HEPATICAS Función hepática: 1. Almacenamiento de glucógeno 2. Síntesis de ácidos grasos (AG) y conversión a cetonas, formación de lipoproteínas, colesterol y fosfolípidos 3. Síntesis de proteínas plasmáticas, conversión y desaminación de aminoácidos y formación de urea 4. Metabolismo y almacenamiento de vitaminas 5. Síntesis, liberación y degradación factores de coagulación 6. Catabolismo y excreción de hormonas 7. Detoxificación de sustancias endógenas (Bilirrubina), bacterias, subproductos y sustancias exógenas (fármacos) 8. Formación de bilis: secretora y excretora 9. Mantenimiento del balance hidroelectolítico El hepatograma es un conjunto de determinaciones bioquímicas que son útiles en la evaluación del funcionamiento del hígado. La selección de las determinaciones que componen el hepatograma depende de las necesidades y de las posibilidades de cada laboratorio. Un hepatograma completo está compuesto por: Bilirrubina total y directa. (BT, BD) Transaminasas ( AST, ALT) 23

24 Fosfatasa alcalina (FAL) Gama-glutamil transferasa (GGT) Concentración de protrombina (TP) Proteínas totales Albúmina 1. Trasnsaminasas. Las transaminasas son enzimas que catalizan la transferencia reversible de un grupo amino entre un aminoácido y un cetoácido. Esta función es esencial para la producción de los aminoácidos necesarios para la síntesis de proteínas en el hígado. La aspartato aminotransferasa (= AST = glutámico oxalacético transaminasa = GOT ) se localiza sobre todo en la mitocondria y está presente en otros órganos, además del hígado, como son, en orden de frecuencia, el miocardio, músculo esquelético, riñones, cerebro, páncreas, pulmón, leucocitos y eritrocitos.vida media: 48 hs. La alanina aminotransferasa (= ALT = glutámico pirúvico transaminasa = GPT) se localiza fundamentalmente a nivel citosólico en el hepatocito, lo que explica su mayor especificidad. Vida media 18 hs. La elevación sérica de transaminasas se correlaciona con el vertido a la sangre del contenido enzimático de los hepatocitos afectados, aunque la gradación de la elevación enzimática puede no relacionarse con la gravedad de la lesión. Se puede considerar la enfermedad hepática como la causa más importante del aumento de la actividad de la ALT y frecuente del aumento de la actividad de la AST. El P-5 -P es un cofactor necesario tanto para AST como para ALT Variación pre analítica AST aumenta en ejercicio en hombres, y ALT también pero en menor medida. El fallo renal produce disminución de ALT y en menor medida de AST. En individuos sanos, la ALT puede aparecer muy baja falsamente por la unión de su cofactor, P-5 -P, a proteínas plasmáticas. La hemólisis aumenta los niveles de las dos Transaminasas debido a que la actividad de ambas en los eritrocitos es mayor que en el suero normal. El efecto es mayor para AST que para ALT. Metodología: Determinación analítica Las dos enzimas se miden a través de reacciones acopladas utilizando NADH como el producto final de la reacción Se mide espectrofotométricamente a una longitud de onda de 340 nm. Existe un método que es recomendado por la Federación Internacional de Química Clínica (IFCQ) pero no todas las pruebas 24

25 comerciales lo siguen exactamente, lo que da lugar a una estandarización deficiente. GPT L-alanina + 2-oxoglutarato piruvato + L-glutamato LDH Piruvato + NADH + H+ L-lactato + NAD+ GOT L-aspartato + 2-oxoglutarato MDH oxalacetato + NADH + H+ oxalacetato + L-glutamato L-malato + NAD+ Las muestras para la medida de Transaminasas son estables de 12 a 24 hs, pero por la hemólisis, empiezan a aumentar pasado ese tiempo. La AST es estable en suero, refrigerada, hasta tres semanas, y congelada, indefinidamente. La ALT tiene una estabilidad similar refrigerada, pero congelada sufre descensos importantes al ser congelada. Interpretación clínica La causa más importante de aumento de ambas es el daño de los hepatocitos. Cuando hay daño muscular aumenta más AST que ALT. AST puede aumentar en pacientes con tumores malignos. AST y ALT pueden tener valores engañosamente bajos en fallo renal, lo que podría enmascarar un daño hepático. 2. Fosfatasa alcalina (FAL) Las formas de fosfatasa alcalina (FAL) más abundantes en plasma están codificadas por un único gen, que produce una enzima no específica de tejido que se encuentra en hígado, riñón y hueso. Estas formas se diferencian en sus cadenas laterales de carbohidratos. Otros tres genes codifican para la FAL de origen placentario, intestinal y de células germinales (muy parecida a la placentaria). En las células, la FAL se encuentra principalmente unida a las membranas celulares, donde escinden compuestos que contienen fosfato y pueden facilitar el movimiento de sustancias a través de las membranas celulares. La FAL hepática se encuentra en la membrana de las células de los canalículos biliares. Los osteoblastos producen la iso forma de FAL ósea, que escinde al pirofosfato (PPi), un inhibidor de la mineralización ósea. Las células del epitelio intestinal, producen la isoforma FAL intestinal que se libera al intestino después de la ingestión de comidas grasas. Rango de referencia 25

26 Depende de la edad y del sexo: durante la niñez los niveles aumentan gradualmente hasta los diez años, llegando a tener valores tres a cuatro veces mayores que los de adultos, y siendo mayores en niños que en niñas. Estos valores altos son a expensas de la FAL ósea, debido a que están en período de crecimiento. Luego de un aumento en los primeros años de la adolescencia, los valores de referencia empiezan a bajar hasta los valores de adulto en los primeros años de la segunda década de vida, y son parecidos en hombres y mujeres, hasta los cincuenta años. Después de la menopausia, la isoenzima ósea aumenta ligeramente en mujeres. El embarazo hace que los niveles de referencia se dupliquen o tripliquen a expensas de la isoenzima placentaria. Variación pre analítica La masa corporal aumentada incrementa la FAL. Los contraceptivos orales disminuyen los valores de FAL. Los agentes antiepilépticos aumentan la FAL, principalmente la isoenzima hepática. El tabaquismo produce aumentos de 10% aproximadamente, debido a la producción pulmonar de una isoenzima similar a la placentaria. Las transfusiones sanguíneas y la circulación extracorpórea, hacen que disminuya la FAL, probablemente debido a la quelación de los cationes necesarios para su acción por el citrato. Metodología: Determinación analítica La fosfatasa alcalina hidroliza el p-npp para formar el cromógeno amarillo p- nitrofenol de acuerdo con la Siguiente ecuación. Fosfatasa alcalina Fosfato de p-nitrofenilo + H2O p-nitrofenol + HPO H+ El incremento en la absorbancia de la mezcla de reacción a 415 nm debido a la formación del p-nitrofenol, es proporcional a la actividad de la fosfatasa alcalina El zinc es un componente de la enzima, y el magnesio y otros cationes la activan. Los quelantes utilizados para evitar la coagulación de la sangre (EDTA, citrato, oxalato), disminuyen de falsamente la actividad de FAL Existen varios métodos para separar las isoenzimas de FAL. Los ensayos de inhibición, que son poco reproducibles no se suelen usar para esto. El fraccionamiento por calor se ha usado mucho, pero requiere un control muy estricto de la temperatura y el tiempo para lograr resultados reproducibles, y requiere el uso de estándares de composición conocida. Por todo esto los métodos más utilizados son la electroforesis en geles de poliacrilamida y el isoelectroenfoque, que son capaces de resolver múltiples bandas de FAL. Existen inmunoensayos comerciales para las isoenzimas de hueso y placentaria, pero presentan cierta reactividad cruzada. 26

27 Interpretación clínica Las causas más comunes son enfermedades de hígado y hueso. Los trastornos que producen colestasis producen una elevación mayor que los trastornos hepatocelulares. El aumento de la actividad del hueso produce aumentos de FAL en enfermedad de Paget, osteosarcoma, tumores metastáticos en hueso, y enfermedades metabólicas del hueso. Pacientes con diabetes, fallo renal, cirrosis, hospitalización prolongada, pueden tener aumentos de la FAL a expensas de la isoenzima intestinal Pacientes con tumores malignos pueden tener valores elevados de FAL, isoenzima placentaria, principalmente se observa en tumores de células germinales. Se pueden encontrar niveles bajos de FAL en deficiencia de zinc, que es un cofactor de la enzima. 3. Gammaglutamil transpeptidasa (GGT) La GGT cataliza la transferencia del grupo γ-glutamilo desde un péptido u otro compuesto a sí misma, a otros péptidos, a aminoácidos o al agua. La enzima está, generalmente, unida a la membrana plasmática de las células en el lado canalicular, los túmulos renales proximales, las células epiteliales intestinales y las de próstata. Existen varias isoenzimas pero la que contribuye en mucha mayor proporción a la actividad en plasma es la hepática. Rangos de referencia GGT muestra marcados cambios con edad y sexo, aumentando con la edad, y siendo mayor en hombres que en mujeres. Metodología. Determinación analítica GGT σ glutamil 3 carboxi 4 nitranilida + glicilglicina glutamilglicinglicina + 5 amino 2 nitrobenzoato lσ Método enzimático cinético colorimétrico, medición fotométrica de la absorbancia. Interpretación clínica Aumentada principalmente para la evaluación del daño hepático Hepatitis alcohólica Cirrosis Tumor metastático de hígado Colestasis intrahepática Obstrucción extrahepática 27

28 Hepatitis crónica Cáncer hepático primario HÍGADO Y ENZIMAS SÉRICAS Hepatitis víricas agudas: están aumentadas la ALT (GPT), AST (GOT) y GGT. La que aumenta en mayor cantidad es la ALT. No existe apenas relación entre la gravedad del daño hepático y la elevación de las enzimas. Las transaminasas se normalizan en un plazo de 3-5 semanas. Si la hepatitis cronifica no se normalizan. Si la hepatitis es fulminante las transaminasas descienden de forma brusca debido a la necrosis masiva del hígado que hace que no quede tejido hepático para liberar enzimas. Colestasis: es una obstrucción a nivel biliar que determina un estancamiento o estasis de la bilis en el interior del hígado. Se elevan sobre todo la GGT y la Fosfatasa Alcalina. Etilismo crónico: se determina GGT en plasma. Cirrosis hepática: hay una elevación moderada de las transaminasas, siendo mayor el aumento de la AST que de la ALT. Si la cirrosis es de origen etílico estará también aumentada la GGT y si es de origen biliar estarán aumentadas las Fosfatasas Alcalinas. NEOPLASIAS Cáncer de Próstata: aumenta la Fosfatasa Ácida total pero no es un marcador precoz de la enfermedad porque aumenta cuando ya hay metástasis Metástasis hepáticas: aumenta la Fosfatasa Alcalina y la GGT Metástasis óseas: si las metástasis son condensaciones aumenta la Fosfatasa Alcalina. Si son de tipo lítico aumentan las Fosfatasas Ácidas totales 28