Análisis de parámetros inmunoquímicos y paraproteínas. Informe del III Taller de Inmunoquímica de la Sociedad Española de Inmunología

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1 Panorama Inmunología Vol. 25 / Núm 1/ Enero-Marzo 2006: Análisis de parámetros inmunoquímicos y paraproteínas. Informe del III Taller de Inmunoquímica de la Sociedad Española de Inmunología J.J. Rodríguez Molina 1*, J. Sequí Navarro 2*, L.M. Villar Guimerans 3* y el Grupo de Trabajo de Inmunoquímica 4. Taller SEI Servicio de Inmunología, Hospital General Universitario Gregorio Marañón, Madrid. 2 Servicio de Inmunología, Hospital Carlos III, Madrid. 3 Servicio de Inmunología. Hospital Ramón y Cajal, Madrid. 4 Grupo de Trabajo de Inmunoquímica: Montserrat Alsina Donadeu; Cándido Juárez Rubio; Eva Mª Martínez Cáceres; María José Amengual Guedaní; María José Rodrigo Anoro; Carmen Cámara Hijón. Luis Fernández Pereira; Pilar Sanchez Mozo; Inmaculada Alarcón Torres; Pedro González Porqué; Pilar Varela Peña; Luis Allende Martínez; Mª José Sentchordi Izquierdo; Carmen Jiménez Garófano; Cecilia Muñoz Calleja; Margarita López Trascasa; Nieves Fernández Arcas; Rocío Álvarez López; Joana Ferrer Balaguer; Marcos López Hoyos y Luis Larrad Mur. *Coordinadores. Taller SEI, Santander Mayo 2004 Los tres coordinadores han redactado el trabajo en igualdad. REPORT OF THE III WORKSHOP ON IMMUNOCHEMISTRY OF THE SPANISH SOCIETY OF IMMUNOLOGY Recibido: 7 Febrero 2006 Aceptado: 16 de Marzo 2006 RESUMEN Objetivo: El III Taller de Inmunoquímica (IQ) auspiciado por la Sociedad Española de Inmunología (SEI), consistió en un estudio de comparación interlaboratorios para evaluar la homogeneidad de los métodos analíticos en IQ. El objetivo es la creación de herramientas de control de calidad que permitan estandarizar los procedimientos analíticos (1-4). Métodos: En el ejercicio han participado 21 centros y ha consistido en la cuantificación de IgG, IgA, IgM, IgE total, cadenas ligeras κ y λ, subclases de IgG, C3, C4, FR, PCR y ASLO en muestras de suero. También se han caracterizado los Componentes Monoclonales (CM) en muestras de suero y orina. El estudio se realizó mediante los métodos de trabajo habituales (5,6). Los laboratorios remitieron los resultados a los coordinadores del Taller, que procedieron a su análisis y presentación en el Congreso de la SEI. Resultados: Los parámetros analíticos estandarizados por la International Federation of Clinical Chemistry (IFCC) mostraron una buena homogeneidad, exceptuando el C4, que presentaba una importante dispersión de los resultados asociada a diferencias puntuales de estandarización entre distintos fabricantes. La heterogeneidad fue mayor en los parámetros no estandarizados por la IFCC. La identificación de los CM en sangre y orina demostró una alta homogeneidad. Los resultados cuantitativos de los isotipos de los CM es más heterogénea que en las inmunoglobulinas policlónales. Conclusiones: Los estudios intercomparativos son de gran utilidad para conocer el estado de homogeneidad entre los laboratorios. Se constata la necesidad de reforzar la calidad, la evaluación de proveedores y elaborar protocolos de trabajo consensuados. PALABRAS CLAVE: Proteínas séricas / Inmunoquímica / Paraproteínas / Calidad en salud. ABSTRACT Objective: The III workshop in immunochemistry supported by the Sociedad Española de Inmunología (SEI), consisted in a inter-laboratory comparative study to evaluate the homogeneity of the analytic methods in immunochemistry. The objective was to create quality control tools to standardise analytic procedures (1-4). Methods: 21 centres have participated in the workshop. It comprised the quantification of IgG, IgA, IgM, total IgE, κ and λ light chains, IgG subclasses, C3, C4, RF, CRP and ASL in serum samples. Monoclonal proteins present in serum and urine samples have been also characterised. The study was performed using standard routine methods (5,6). Each laboratory sent its results to the workshop coordinators that proceeded to analyse and present them in the Congress of the SEI. Results: Analytical parameters standardised by the International Federation of Clinical Chemistry (IFCC) showed a good homogeneity, except C4, that exhibited an important dispersion associated to punctual differences in standardisation between different manufacturers. Analytical parameters not standardised by IFCC showed higher heterogeneity. The identification of the monoclonal proteins in serum and urine was highly homogeneous. Quantitative results of monoclonal isotypes was more heterogeneous than that of polyclonal immunoglobulins. Conclusions: Inter-comparative studies are very useful to investigate the homogeneity among different laboratories. These results demonstrate the need of: quality controls, evaluation of suppliers, and elaboration of consensus working procedures. KEY WORDS: Serum Proteins / Immunochemistry / Paraproteins / Quality of Health Care. 57

2 ANÁLISIS DE PARÁMETROS INMUNOQUÍMICOS Y PARAPROTEÍNAS... VOL. 25 NUM. 1/ 2006 INTRODUCCIÓN Los miembros del grupo de Inmunoquímica (GIQ) de la Sociedad Española de Inmunología (SEI) han desarrollado un importante compromiso en la mejora de la competencia técnica, a través de Talleres especializados similares a los de Histocompatibilidad, Autoinmunidad e Inmunidad Celular que funcionan desde hace años en nuestra sociedad (1-4). El I Taller de IQ (Valladolid, 2002) tuvo carácter organizativo. El II Taller (Cádiz, 2003) sirvió para configurar el grupo de Trabajo en IQ. El III Taller de IQ (Santander, 2004) ha consistido en un ejercicio de colaboración interlaboratorios diseñado para cuantificar parámetros IQ, con un apartado específico para el estudio de paraproteínas o componentes monoclonales (CM). Los Talleres de IQ dotan a los laboratorios de Inmunología, de un Control de Calidad Externo. Esto permite comparar los resultados de los distintos laboratorios participantes entre si, e identificar desviaciones y, si las hubiese, iniciar acciones correctoras (5,6). En ellos, también se impulsa el desarrollo de protocolos de consenso con normas y consejos de aplicación para el diagnóstico de muestras clínicas. Entre los objetivos del Grupo de Trabajo en IQ, está la incorporación de nuevos avances técnicos y conseguir que el Taller sea una herramienta de acreditación de los laboratorios participantes. La metodología de este Taller ha consistido en ejercicios de cuantificación de parámetros básicos en el campo de la IQ: Inmunoglobulinas (Igs) IgG, IgA, IgM, subclases de IgG, factores del complemento C3 y C4, factor reumatoide (FR), proteína C reactiva (PCR) y antiestreptolisina O (ASLO), en cuatro muestras de suero y en la cuantificación de IgE total en otras tres muestras de suero. Otro aspecto abordado ha sido la realización de ejercicios de caracterización de Paraproteínas en cuatro muestras de suero y cuatro muestras de orina, que incluye el análisis cualitativo identificando la especificidad isotípica de la cadena pesada (CP) y el tipo de cadena ligera (CL) de los CM y la determinación cuantitativa de las Igs y las CL. En los parámetros cuantitativos se realizó un estudio estadístico de los resultados reportados por los participantes y se evaluó su homogeneidad aplicando el porcentaje del coeficiente de variación (CV), a cada uno de los parámetros y muestras. En los parámetros con mayor dispersión en el CV se aplicó la prueba estadística de Grubbs y se rechazaron los valores extremos (7,8). Los coordinadores del Taller han preparado y distribuido las muestras biológicas de suero y orina clasificadas de acuerdo con los ejercicios de intercambio propuestos. Una vez analizadas las muestras, los laboratorios participantes remitieron sus resultados a los coordinadores del estudio, que procedieron al análisis estadístico de los mismos que se presentó en el XXX Congreso de la SEI celebrado en Santander en mayo de En esta publicación se describen los resultados de los ejercicios interlaboratorios. MATERIALES Y MÉTODOS Laboratorios participantes y responsables del Taller 2004 En los ejercicios participaron 21 laboratorios y tres de ellos, actuaron como coordinadores. Los laboratorios participantes recibieron un código de identificación, que les permitió valorar de manera confidencial sus resultados respecto al conjunto de los participantes en el ejercicio. Listado de responsables y laboratorios participantes Los laboratorios se ordenan en orden alfabético según la ubicación del centro hospitalario. 1. Montserrat Alsina Donadeu: malsina@egarlab.com. Hospital Mutua de Terrassa. Terrasa. Barcelona 2. Cándido Juárez Rubio: cjuarez@hsp.santpau.es. Inmunología Hospital de Sant Pau. Barcelona. 3. Eva Mª Martínez Cáceres: evammc@ns.hugtip.scs.es. Inmunología. Hospital Universitario Germans Trias i Pujol. Badalona. Barcelona 4. María José Amengual Guedan: mjamengual@cspt.es. UDIAT-CD. Corporació Sanitaria Parc Taulí. Sabadell. Barcelona. 5. María José Rodrigo Anoro: mjrodrigo@vhebron.net. Inmunología. Hospital Vall d Hebron. Barcelona 6. Álvaro Prada: aprada@hcru.osakidetza.net. Inmunología. Hospital de Cruces. Baracaldo. Bilbao. 7. Carmen Cámara Hijón. Luis Fernández Pereira: kkk3@hotmail.com. Inmunología. (Laboratorio de Análisis Clínicos). Hospital San Pedro de Alcántara. Cáceres. 8. Pilar Sanchez Mozo: smozo@canalejo.org. Laboratorio de Inmunología. Complejo Hospitalario Universitario Juan Canalejo. La Coruña. 9. Inma Alarcón Torres: ialator@gobiernodecanarias.org. Servicio Análisis Clínicos. Hospital de Gran Canaria «Dr. Negrín». Las Palmas Gran Canaria. 10. Luisa Mª Villar Guimerans: lvillar.hrc@salud.madrid.org. Pedro González Porqué. pgonzalez.hrc@salud.madrid.org. Servicio de Inmunología Hospital Ramón y Cajal. Madrid. 11. Pilar Varela Peña: pvarela@h12o.es. Luis Allende Martínez. Inmunología Hospital 12 de Octubre. Madrid. 12. Julia Sequí Navarro: jsequi.hciii@salud.madrid.org. Inmunología. Mª José Sentchordi Izquierdo. Bioquímica. Hospital Carlos III. Madrid. 13. Carmen Jiménez Garófano: mjimgar@oc.mde.es. Inmunología. Hospital Central de la Defensa. Madrid. 14. Cecilia Muñoz Calleja: cmunoz.hlpr@salud.madrid.org. 58

3 INMUNOLOGÍA J.J. RODRÍGUEZ MOLINA ET AL. TABLA I. Muestras de los ejercicios realizados en el Taller Descripción de las muestras enviadas a los laboratorios y determinaciones realizadas Tipo de Muestra/nº Identificación. Determinaciones del ejercicio* Suero / 40101, 40102, 40103, Cuantificación IgG, IgA, IgM (19) C3, C4 (19) FR (16) PCR (14) ASLO (8) Subclases: IgG (13) Suero / 40201,40202, Cuantificación IgE (17) Suero / 40301, 40302, 40303, Análisis componente monoclonal Identificación cualitativa (17) Cuantificación IgG, IgA, IgM (16) Cuantificación CL k y λ (5) Orina /40401, 40402, 40403, Análisis componente monoclonal Identificación cualitativa (17) Cuantificación CL κ y λ (7) *nº Laboratorios participantes que realizan la determinación. Servicio de Inmunología. Hospital de la Princesa. Madrid 15. Margarita López Trascasa: mlopeztrascasa.hulp@ salud.madrid.org. Servicio de Inmunología. Hospital Universitario «La Paz». Madrid. 16. Juan José Rodríguez Molina: jrodriguezmo.hgugm@ salud.madrid.org. Servicio de Inmunología. Hospital General Universitario «Gregorio Marañón». Madrid. 17. Nieves Fernández Arcas: nieves.fernández.sspa@ juntadeandalucia.es. Antonio Alonso Ortiz. Servicio Inmunología. Hospital «Carlos Haya». Málaga. 18. Rocío Alvarez López: mdrocio.alvarez@carm.es. María Montes Casado: m.montescasado@terra.es. Servicio de Inmunología Hospital Virgen Arrixaca. Murcia. 19. Joana Ferrer Balaguer: jferrer@hsd.es; joanaf@arrakis.es. Inmunología. Hospital Son Dureta. Palma de Mallorca. Baleares. 20. Marcos López Hoyos: inmlhm@humv.es. Servicio de Inmunología. Hospital Universitario Marqués de Valdecilla. Santander. 21. Luis Larrad Mur: linm-larrad@hcu-lblesa.es. Servicio de Inmunología. Hospital Clínico Universitario. Zaragoza. Coordinadores Juan José Rodríguez Molina. Inmunología. Hospital General Universitario Gregorio Marañón. Madrid. Julia Sequí Navarro. Inmunología. Hospital Carlos III. Madrid. Luisa María Villar Guimerans Inmunología. Hospital Ramón y Cajal. Madrid Metodología del estudio En el Taller de IQ 2004 se han realizado un conjunto de ejercicios interlaboratorios, que valoran la cuantificación de los parámetros IQ: IgG, IgA, IgM, subclases de IgG, factores del complemento C3 y C4 y reactantes FR, ASLO y PCR, en cuatro muestras de suero y la cuantificación de IgE total en tres muestras de suero. En un segundo ejercicio se estudiaron los CM de cuatro muestras de suero y orina. Muestras de los ejercicios interlaboratorios Las muestras de suero procedían de los Servicios de Inmunología del Hospital General Universitario Gregorio Marañón (HGUGM) y del Hospital Ramón y Cajal (HRC) de Madrid y las muestras de orina, del Servicio de Inmunología del HGUGM. Todas ellas se procesaron y distribuyeron de forma centralizada desde el Servicio de Inmunología del HGUGM. Las muestras seleccionadas se trataron con azida sódica hasta una concentración de un 0.1%, se numeraron, prepararon alícuotas y etiquetaron con las referencias de Taller IQ de la SEI, el número de muestra y el ejercicio correspondiente. Los paquetes de alícuotas se remitieron a los respectivos laboratorios a temperatura ambiente y de forma simultánea. 59

4 ANÁLISIS DE PARÁMETROS INMUNOQUÍMICOS Y PARAPROTEÍNAS... VOL. 25 NUM. 1/ 2006 TABLA II. Cuantificación de parámetros Inmunoquímicos. Taller Descripción de los equipos, casas comerciales, métodos y parámetros estudiados Equipo/Casa Comercial Método de estudio Parámetros* BNII/Dade Behring Nefelometría Punto final IgG, IgA, IgM (10) C3,C4 (10) FR (8) PCR (7) ASLO (3) Subclases: IgG1, IgG2, IgG3 (13), IgG4 (11) INMAGE/Beckman-Coulter Nefelometría Cinética IgG, IgA, IgM (9) C3,C4 (9) FR (7) PCR (6) ASLO (4) Subclases: IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 (4) Modular/Roche Turbidimetría FR, PCR, ASLO (1) Placas de Inmunodifusión/ Binding Site Inmunodifusión radial Subclases: IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 (2) *nº Laboratorios participantes que realizan la determinación. Se han distribuido a todos los laboratorios participantes un total de 11 muestras de suero y cuatro de orina, agrupadas según se describe en la Tabla I. Las muestras de suero seleccionadas para los ejercicios de cuantificación de los parámetros IQ, consisten en mezclas de sueros humanos, codificadas como 40101, 40102, 40103, 40104, y para cuantificar los niveles de IgE las alícuotas 40201, y Las muestras de suero remitidas para el estudio de paraproteínas séricas han sido codificadas como 40301, 40302, y La muestra procede de un único suero, las otras tres muestras son de las mezclas de sueros de sujetos sanos a los cuales se les adicionó una paraproteína relevante. Las muestras de orina, fueron codificadas como 40401, 40402, 40403, y Todas ellas consistían en mezclas de orinas normales a las cuales se les adicionaron diversas orinas con un componente monoclonal (CM). Las muestras y eran dos diluciones distintas de la misma orina. Análisis de las muestras Los responsables de las áreas de IQ de los laboratorios participantes, a la recepción de las muestras constitutivas de los ejercicios del Taller 2004, procedieron al análisis de las respectivas alícuotas. Los estudios fueron realizados en cada laboratorio según los procedimientos analíticos habituales de diagnóstico clínico. Estudio de la cuantificación de las Igs IgG, IgA, IgM, subclases de IgG, factores del complemento C3 y C4 y reactantes FR, PCR y ASLO en las muestras de suero Los laboratorios realizaron cuantificaciones de las Inmunoglobulinas (Igs): IgG, IgA, IgM, las subclases de IgG, los factores del complemento C3 y C4 y los reactantes FR, PCR y ASLO en las muestras descritas en la Tabla I, con los métodos, equipos y antisueros de los respectivos proveedores descritos en la Tabla II. Se emplean los método de Nefelometría a Punto Final ( NefPF) con los equipos BN II (Dade-Behring), los métodos de Nefelometría Cinética ( NefC) con los equipos IMAGE (Beckman/Coulter), el método de Turbidimetría con el equipo Olimpic Turb (Roche) y la técnica de Inmunodifusión radial de Binding Site. Los laboratorios utilizaron los reactivos y antisueros de los respectivos proveedores para los equipos. Estudio de la cuantificación de IgE total en muestras de suero La cuantificación de IgE total, se realizo en 17 laboratorios en las tres muestras de suero preparadas para este ejercicio, definidas en la Tabla I. Los métodos, equipos y reactivos utilizados se muestran en la Tabla III. Estudio de las paraproteínas en las muestras séricas El análisis cualitativo de las paraproteínas fue realizada con los métodos, equipos antisueros y el número de participantes, que se describen en la Tabla IV. 60

5 INMUNOLOGÍA J.J. RODRÍGUEZ MOLINA ET AL. TABLA III. Estudio de las cuantificaciones de IgE total. Descripción de los métodos de análisis, equipos empleados y nº de laboratorios participantes en el estudio Métodos Equipo Nº de (Casa comercial) laboratorios CAP AUTOCAP (Pharmacia) 3 CAP UNICAP (Pharmacia) 3 Nefelometría Punto Final BNII (Dade-Behring) 8 Nefelometría Cinética Image (Beckman-Coulter) 1 ELISA propio Anticuerpo monoclonal IgE 1 Turbidimetría Immulite/Quimio (Roche) 1 La identificación de los CM de las 4 muestras de suero fue realizada en 18 laboratorios empleando las técnicas de: inmunofijación (IF) (15 laboratorios), electroforesis capilar sustractiva (ECS) (1 laboratorio), e inmunoelectroforesis (IEF) (2 laboratorios). Los antisueros empleados en el reconocimiento de las Igs y de las cadenas ligeras (CL), proceden de los respectivos proveedores del material técnico de los equipos (Tabla V). Los parámetros cuantitativos valorados en el estudio de las paraproteínas séricas son: la cuantificación de las Igs (IgG, IgA e IgM), las CL Totales κ y λ (CLT) y el cálculo del cociente κ/λ. En 13 laboratorios se cuantificaron los isotipos de las Igs séricas (IgG, IgA, IgM), 6 laboratorios emplean el método de NefPF, otros 6 laboratorios utilizan el método de NefC y 1 laboratorio el método Turbidimétrico. Además, en 5 laboratorios se cuantificaron las CLT κ y λ, 3 laboratorios emplean el método de NefPF y 2 el método de NefC. Los 5 laboratorios emplearon antisueros anti-clt, los cuales reconocen las CL libres (CLL) y las ligadas a las cadenas pesadas. Estudio de paraproteínas en muestras de orinas El análisis cualitativo del CM de las cuatro muestras de orina se ha realizado en 17 laboratorios con los métodos y equipos descritos en la Tabla IV. La cuantificación en orina de las CL κ y λ se realizó en 7 laboratorios, con los equipos y antisueros que se detallan en la Tabla VI. Evaluación estadística de los parámetros analizados en el Taller 2004 En el análisis estadístico de la cuantificación de los parámetros IQ se valoró la media de los resultados (X) y el TABLA IV. Estudio de Paraproteínas. Métodos de análisis y equipos empleados en el estudio cualitativo con métodos de inmunoelectroforesis Métodos Equipo (Casa comercial) Nº de laboratorios Nº de laboratorios Sueros Orinas Inmunofijación Hydrasis (Sebia) Inmunofijación Paragon (Beckman) 3 4 Inmunofijación Agarosa (Helena) 1 1 Inmunoelectroforesis Manual 2 1 Electroforesis capilar unmunosustractiva CZE/Hydrasis Izasa/Beckman/Coulter 1 TABLA V. Paraproteínas en muestras de sueros. Descripción de métodos, equipos, parámetros y nº de laboratorios participantes en el estudio cuantitativo Técnica Equipo (Casa comercial) Parámetros Nº de laboratorios Antisueros Nefelometría punto final BNII (Dade-Behring) IgG, IgA, IgM 6 Behringwerke CLT (κ y λ) 3 Nefelometría cinética Image (Beckman-Coulter) IgG, IgA, IgM 6 Beckman Institute CLT (κ y λ) 2 Turbidimetría Olimp Turb (Roche) Sistema IgG, IgA, IgM 1 61

6 ANÁLISIS DE PARÁMETROS INMUNOQUÍMICOS Y PARAPROTEÍNAS... VOL. 25 NUM. 1/ 2006 TABLA VI. Estudio de Paraproteínas en muestras de orina. Descripción de métodos de nefelometría, equipos, antisueros, parámetros estudiados y nº de laboratorios participantes en el estudio cuantitativo Método Equipo Antisueros Parámetros Nº de laboratorios (Casa comercial) Nefelometría punto final BNII Behringwerke CLT κ y λ 1 (Dade-Behring) CLL κ y λ 2 Nefelometría cinética Inmage Beckman Institute CLT κ y λ 2 (Beckman-Coulter) CLL κ y λ 2 coeficiente de variación (CV %) interlaboratorios. El criterio de homogeneidad se estableció sobre el valor del CV %, clasificando los resultados como concordantes si el CV % era menor del 10 %, discordantes entre 10 y 20 % y muy discordantes si el CV % era mayor de 20. En las series de resultados se aplicó la prueba estadística de Grubbs (7, 8) para descartar los valores discrepantes. En los ejercicios de Paraproteínas se realizó el estudio de homogeneidad en los resultados cuantitativos, y en los datos cualitativos se comparo la descripción de los CM. RESULTADO DE LOS EJERCICIOS TALLER 2004 Cuantificación de los parámetros inmunoquímicos IgG, IgM, IgA, C3, C4, subclases de IgG, FR, PCR y ASLO Las valoraciones estadísticas relativas al estudio de los parámetros IQ analizados en el Taller 2004 se muestran en la Tabla VII. En el ejercicio de cuantificación de las Igs se observa una buena concordancia (CV < 10%) en los resultados correspondientes a los parámetros IgA e IgM de todas las muestras y en la cuantificación de IgG de la muestra 40101, sin embargo los resultados relativos al parámetro IgG de las tres muestras restantes fueron discordantes (10% < CV < 20%). La aplicación de la prueba estadística de Grubbs al parámetro IgG de las muestras con un CV % >10 (40102, y 40104), señala que la eliminación de los cuatro resultados discrepantes mejora el CV hasta hacerlo inferior al 10%. El análisis estadístico de los niveles del factor C3 del complemento, mostró una buena concordancia (CV < 10%) en los 4 sueros estudiados. La cuantificación de los niveles del factor C4 indica discordancia con un CV >10% y la aplicación de la prueba de Grubbs no permitió descartar ningún valor. Cuando se analizan los resultados agrupándolos según la metodología utilizada, se observan dos patrones correspondientes a laboratorios que utilizaban metodologías Beckman-Coulter o Dade-Behring, concordantes entre si, pero con medias discrepantes y con CV <10% en ambos casos. Paralelamente a la evaluación de las conclusiones del Taller se recibió notificación de uno de estos proveedores sobre un defecto puntual de recuperación de valor del control de C4 para determinados lotes. En la cuantificación de las subclases de IgG han participado 13 laboratorios. El análisis estadístico presenta un CV >10 % en todas las subclases de IgG, más importante en las subclases IgG3 e IgG4. En cuanto a los reactantes PCR, FR y ASLO, las medias y los CV % obtenidos se describen en la Tabla VII. Se pueden establecer tres patrones de concordancia, en primer lugar se situarían los resultados correspondientes al estudio de la PCR, parámetro estandarizado por la IFCC, que muestra una concordancia buena o intermedia en las tres muestras valorables (CV %: 8, 15,9), mejorando con la aplicación de la prueba estadística de Grubbs (CV %: 6, 4,6). En segundo lugar estarían los parámetros FR y ASLO que muestran una alta discrepancia (CV >20 %), asociada a las diferentes estandarizaciones aplicadas por los principales fabricantes de reactivos y equipos. Cuando se agruparon los resultados según la metodología utilizada el CV no fue nunca superior al 15 %. Cuantificación de IgE total Las muestras y no son valorables estadísticamente debido a los diferentes rangos de medida de las cinco metodologías empleadas. La muestra presenta niveles indetectables en los siete laboratorios que emplean la metodología NefPf. La muestra 40203, con un valor alto de IgE total supera el umbral > 2000 KU/L en los 3 laboratorios que emplean el equipo AUTOCAP (Pharmacia). La muestra 40202, con un valor intermedio de IgE total muestra un alto nivel de concordancia (CV < 10%). Estudio de las Paraproteínas en muestras de suero Este ejercicio incluye la identificación del CM y la evaluación cuantitativa de las Igs IgG, IgA, IgM y las CL κ y λ. 62

7 INMUNOLOGÍA J.J. RODRÍGUEZ MOLINA ET AL. TABLA VII. Cuantificación de Parámetros Inmunoquímicos. Descripción de los valores medios (X), % coeficiente de variación (CV) y modificaciones con la aplicación del estadístico de Grubbs Parámetro (N) X (CV%) X (CV%) X (CV %) X (CV %) Grubbs : X (CV %) (a/b) Grubbs: X (CV %) (a/b) Grubbs : X (CV %) (a/b) Grubbs: X (CV %) (a/b) IgG (N=19) 1210 (6) 1325 (16 ) 900 (13 ) 2526 (10 ) 1289 (4 ) (15a/ 4b) 881 (5 ) (15a / 4b) 2453 (2 ) (15a / 4b) IgM (N=19) 121,8 (4 ) 135 (5 ) 67 (8 ) 216 (5 ) IgA (N=19) 209 (8 ) 293 (7) 17,5 (6 ) 629 (9 ) C3 (N=19) 94 (7 ) 171 (9 ) 145 (9 ) 132 (7 ) C4 (N=19) 10 (18 ) 34 (17 ) 32 (15 ) 25 (16 ) Subclase IgG1 (N=12) 826 (16 ) 844 (14 ) 692 (11 ) 1686 (11 ) Subclase IgG2 (N=13) 307 (17 ) 377 (11 ) 116 (19 ) 562 (17 ) Subclase IgG3 (N=13) 67 (34 ) 62 (32 ) 42 (29 ) 125 (27 ) Subclase IgG4 (N=11) 64 (31) 43 (32 ) 10 (45 ) 91 (29 ) 59 (16 ) (10a/ 1b) 40 (18 ) (10a/ 1b) 85 (13 ) (10a/ 1b) ASLO (N=10) 82 (19 ) 66 (20 ) 81 (38 ) 99,05 (26 ) 71 (13 ) (9a/ 1b) FR (N=16) < rango 59 (20 ) < rango 92 (25 ) PCR (N=14) 0,96 (8 ) 8 (15 ) < rango 8 (9 ) 0,94 (6 ) (13a/ 1b) 9 (4 ) (11a/ 3b) 8 (6 ) (13a/ 1b) (N) nº Laboratorios participantes. En cada uno de los parámetros analizados se muestran los valores medios X y el CV (%). En los parámetros en los que la prueba estadística de Grubbs descarto valores se detallan los valores medios x, el CV (%) y el cociente (a)/ (b), (a) indica el nº total de laboratorios participantes y (b) el nº laboratorios excluidos, después de aplicar el estadístico de Grubbs. TABLE VIII. Identificación de los Componentes Monoclonales en muestras de suero Análisis* Muestra Muestra Muestra Muestra Cualitativo (18) IgG λ (17) IgD λ (4) IgM κ (18) IgA κ (18) IgG λκ (1) IgD λ + λ libre (3) λ libre (11) *nº Laboratorios que identifican el Componente Monoclonal. Identificación del CM en suero. Los resultados de la identificación de los CM se describen en la Tabla VIII. En la muestra 40301, 17 laboratorios identificaron una banda monoclonal IgGλ y 1 laboratorio identificó IgGκ. En la muestra 40302, 4 laboratorios identificaron una banda monoclonal IgDλ, 3 laboratorios IgDλ + λ libre y 11 laboratorios CL tipo λ. Todos los laboratorios identifican la presencia de la CL tipo λ, y 7 lo asocian con el isotipo IgD del CM. En las muestras y todos los laboratorios identificaron los CM respectivos IgMκ e IgAκ. Las valoraciones estadísticas de las Igs IgG, IgA e IgM y las CLT κ y λ en las muestras con paraproteínas se detallan en la Tabla IX. La cuantificación de las Igs policlonales mostró homogeneidad, con un CV < 10% en todos los casos. Por el contrario, en las Igs monoclonales la heterogeneidad es alta. Los resultados de la cuantificación de las CLT κ y λ, muestran aumento de la CL κ o λ correspondiente al respectivo CM de la muestra (Tabla IX). El estudio de la homogeneidad de estos valores muestra resultados discrepantes porque los dos fabricantes que realizan en el mercado esta 63

8 ANÁLISIS DE PARÁMETROS INMUNOQUÍMICOS Y PARAPROTEÍNAS... VOL. 25 NUM. 1/ 2006 TABLA IX. Valores medios (X) y Coeficiente de Variación (CV %) de la cuantificación de Igs (G, M, A), CLT(κ, λ), cociente κ/λ y Σ Igs (G+M+A), Σ CLT(κ + λ), en las muestras del ejercicio de Paraproteínas séricas. Taller Cuantificación (N) IgGλ IgDλ IgMκ IgAκ X (CV %) X (CV %) X (CV %) X (CV %) IgG (15) 623 (4)CM 511 (6) 804 (5) 1015 (5) IgA (15) 118 (6) 55 (5%) 125 (7) 1148 (15)CM IgM (15) 42 (8) 26 (10%) 2526 (21)CM 122 (7) κ (5) 202 (78)* 251 (80)* 1803 (104)* 1207 (78)* λ (5) 270 (65)* 428 (66)* 195 (61)* 235 (62)* Cociente κ/λ κ/λ = 0,69 κ/λ = 0,53 κ/λ = 6,9 κ/λ = 4,65 (N) nº Laboratorios Participantes; X = valor medio de las cuantificaciones de los parámetros estudiados; CV % = Coeficiente de variación expresado en porcentaje de las cuantificaciones de los parámetros estudiados. *Dispersión anómalamente alta debido a que los valores de cadenas ligeras en suero son diferentes dependiendo de la casa comercial suministradora de reactivos. La cuantificación de las Igs se realizó en 15 laboratorios y de las CLT (κ, λ) en 5 laboratorios. En las filas 1, 2 y 3 se detalla el promedio de la cuantificación de las Igs (G, M, A). CM: isotipo del componente monoclonal. En las filas 4 y 5 se expresa la sumatoria de las CL y en la fila 6 el cociente κ/λ indica el aumento del tipo de CL. TABLE X. Análisis cualitativo de Proteínas de Bence Jones (PBJ) en las muestras de orina Muestra Identificación* BJ κ (17) BJ λ (10) BJκ (11) BJ κ (12) *nº Laboratorios participantes que identifican la PBJ BJκ + IgGκ (2) No detectan (5) No detectan (2) κ ligada (1) cuantificación, adjudican distintos valores a las cadenas ligeras de suero. No se pudieron agrupar los resultados por métodos por el bajo número de participantes (n, 5). El cociente κ/λ es menor de dos en las paraproteinas IgGλ (40301) e IgDλ (40302) y superior a dos en las IgMκ (40303) e IgAκ (40304). Paraproteínas en orina, Proteinas de Bence Jones (PBJ) Los resultados de la identificación de las PBJ en las orinas estudiadas se muestran en la Tabla X. Las muestras 40401, y tenían una banda de CL tipo PBJκ. La tenía una CL tipo PBJλ. En cuanto a la cuantificación de las proteínas de BJ, en las muestras BJκ (40401) y BJλ (40402) se demostró aumento del respectivo tipo de CL. En la muestras los niveles de PBJ son muy bajos y la muestra no ha podido ser detectada por todos los laboratorios participantes, debido al bajo nivel de paraproteína en los especímenes. Los escasos laboratorios (n, 7) que reportan los resultados cuantitativos muestran una gran dispersión debido a las distintas aproximaciones empleadas, lo cual refleja los distintos procedimientos de estandarización, métodos de estudio y antisueros empleados en la cuantificación de CLT o CLL (datos no mostrados). DISCUSIÓN TALLER 2004 Los ejercicios interlaboratorios se han analizado con criterios de la International Organization for Standardization (ISO), European information System on Proficiency Testing Schemes (EPTIS), WHO, FDA, CDC y la Association of Official Analytical Chemistry (AOAC) (5,6) para estudios en colaboración. Los ejercicios de cuantificación de los parámetros inmunoquímicos IgG, IgM, IgA, C3, C4, y PCR, estandarizados por la IFCC, mostraron un alto grado de homogeneidad, 64

9 INMUNOLOGÍA J.J. RODRÍGUEZ MOLINA ET AL. exceptuando tres ejercicios del parámetro IgG, uno de PCR y todos los relativos a C4. La desviación de los parámetros IgG y PCR se corrigió eliminando los valores discrepantes con la aplicación de la prueba estadística de Grubbs (7,8). Esto demuestra que en este caso la falta de homogeneidad se debía a desviaciones puntuales de un reducido grupo de laboratorios. En cuanto al C4 el caso era muy distinto. Se detectó una desviación puntual en la recuperación del valor asignado al control que afectaba reactivos y calibradores de C4 fabricados por uno de los proveedores, situación que no consta se haya detectado previamente con los controles de calidad habituales. Esto demuestra la necesidad de ejercicios interlaboratorios que permitan la detección precoz de estas situaciones. El FR y el ASLO, al no estar estandarizados por la IFCC muestran una menor homogeneidad que mejora al agrupar los resultados por equipos y métodos, aunque el bajo número de participantes impide recoger valoraciones estadísticas mas precisas. En cuanto a las subclases de IgG se observó una alta heterogeneidad en los CV, debida posiblemente a la diversidad en las metodologías empleadas y al bajo número de participantes. En estos parámetros, sería conveniente realizar estudios más amplios de los distintos métodos analíticos. En el Taller 2004, la cuantificación de Igs monoclonales encuentra falta de homogeneidad en algunas muestras, a diferencia de lo observado en las Igs policlonales y en concordancia con lo descrito en la literatura (9,10). En las cuantificaciones de las CLT κ y λ no se pudieron obtener resultados significativos por el bajo número de laboratorios participantes. La evaluación y monitorización del cociente κ/λ es un marcador muy útil de malignidad, aunque esta determinación no está actualmente suficientemente implantada en los laboratorios del GIQ. Datos recientes han puesto de manifiesto el poder pronóstico de los niveles séricos de CL libres en el seguimiento de las denominadas paraproteínas de significado incierto (11-13) por lo que sería interesante aumentar el número de laboratorios que emplean este parámetro clínico. Todos estos datos demuestran que la cuantificación del isotipo y tipo del CM son herramientas muy útiles para la identificación y monitorización de las paraproteínas (14,15). En cuanto a la identificación de las mismas se observó una gran homogeneidad en los resultados obtenidos para tres de las muestras que presentaban paraproteínas IgGλ, IgAκ e IgMκ respectivamente. La incorporación de una muestra IgDλ, permitió abordar el análisis de una paraproteína IgD, de gran interés por la baja prevalencia de estos CM (1,2-1,8 % del total de los mielomas múltiples), y la baja concentración de IgD en el plasma normal (16). Todos los laboratorios identificaron la CL tipo λ, y siete demuestran la asociación con el isotipo IgD. El reconocimiento de una banda monoclonal de CL y la alteración del cociente κ/λ, nos exige estudiar si nos encontramos con la presencia en la muestra de CL libres, o asociadas a los isotipos D o E. La identificación de los componentes monoclonales en orina fue muy homogénea en todos los laboratorios participantes, aunque algunos no pudieron detectar las CLL en dos muestras que presentaban muy bajos niveles de paraproteína. En la cuantificación de las CLL de orina, se emplean distintos métodos y antisueros, por lo que no se pudieron realizar estudios estadísticos. Además, en las cuantificaciones de las PBJ por métodos nefelométricos, pueden influir factores tales como son el exceso de antígeno, la posible dimerización de las CLL, la corta vida media y la rápida degradación de las CL en orina, lo que hace aún mas difícil la realización de ejercicios interlaboratorios. Finalmente, en este Taller concluimos que los ejercicios de inter-comparación son una excelente herramienta en los procesos de aseguramiento de la calidad en nuestros laboratorios. Además sirven para la asegurar la correcta implantación de nuevas técnicas y la elaboración de protocolos de trabajo consensuados. AGRADECIMIENTOS A todo el personal técnico de los centros participantes por su colaboración en la realización del estudio y a los laboratorios Izasa /Beckman/Coulter por el soporte logístico en la distribución de las muestras. CORRESPONDENCIA: Juan José Rodríguez Molina Servicio de Inmunología. Hospital General Universitario Gregorio Marañón. c/ Dr. Esquerdo nº Madrid. Tfn: Fax: jrodriguezmo.hgugm@salud.madrid.org J. Sequí Navarro: jsequi.hciii@salud.madrid.org L.M. Villar Guimerans: lvillar.hrc@salud.madrid.org BIBLIOGRAFÍA 1. Wichmann I, Julia MR, Fernández A, Escobar D. Resultados del Taller de Autoinmunidad, Córdoba Results from XIX Spanish Autoimmunity Workshop (Córdoba 2005). Inmunología 2005; 24: López Santalla M, Martín Villa JM. Informe sobre el ejercicio de estandarización de inmunofluorescencia indirecta (IFI) para la detección de anticuerpos antinucleares (ANA). Taller de 65

10 ANÁLISIS DE PARÁMETROS INMUNOQUÍMICOS Y PARAPROTEÍNAS... VOL. 25 NUM. 1/ 2006 autoinmunidad, Santander 2004 Report on the indirect immunofluorescence (IFI) standarisation assay for the detection of antinuclear antibodies (ANA). Workshop of Autoimmunity, Santander Inmunología 2004; 23: Fig: http//www. inmunologia.org/revista/tallerdeautoinmunidad2004.htm. 3. Sequí Navarro J. El Taller Nacional de Autoinmunidad (1989). Inmunología 1990; 9: Minguela Puras A, Muro Amador M, Torio Ruiz A, García Calatayud MC, Sanchis Morell MJ, García Alonso AM, Álvarez-López MR. Resultados del XVII Taller Nacional de Histocompatibilidad Estudio serológico. Inmunología 1995; 14 : Nakamura RM. National and International Reference. Preparations for the Clinical Diagnostic Immunology Laboratory. En: Nakamura R, Burek L,Cook L, Folds JD, Sever JL, editores. Clinical and Diagnostic Immunology. Protocols in Quality Assurance and Standarization. Blackwell Science; Chapter 7, p Association of Official Analytical Chemistry. Official Methods of Analysis AOAC INTERNATIONAL. OMA Program Manual. Method Validation Programs. Part 6. Guidelines for Collaborative Study Procedures To Validate Characteristic of a Method of Analysis. Appendix D of OMA. p.1-12: January <htpp:// [Consulta: 15 de julio de 2004]. 7. Grubbs F. Procedures for Detecting Outlying Observations in Samples. Technometrics 1969;11: ENGINEERING STATISTICS HANDBOOK. NIST/SEMATECH e-handbook of Statistical Methods. Chapter 1. Exploratory Data Analysis. EDA Techniques. Quantitative Techniques. Grubbs Test for Outliers : September 11,2005 < gov/div898/handbook/eda/section3/eda 35 h.htm > [Consulta :17 de enero de 2006]. 9. Berth M, Delanghe J. Protein precipitation as a possible important pitfall in the clinical chemistry analysis of blood samples containing monoclonal immunoglobulins: 2 case reports and a review of the literature. Acta Clin Belg 2004; 59: Attaelmannan M, Levinson SS. Understanding and Identifying Monoclonal Gammopathies. Clin Chem 2000; 46: Rajkumar SV, Kyle RA, Therneau TM, Melton LJ 3rd, Bradwell AR, Clark RJ, Larson DR, Plevak MF, Dispenzieri A, Katzmann JA. Serum free light chain ratio is an independent risk factor for progression in monoclonal gammopathy of undetermined significance. Blood 2005; 106: Rajkumar SV. MGUS and Smoldering Multiple Myeloma: Update on Pathogenesis, Natural History, and Management. Hematology (Am Soc Hematol Edu Programe) Hematology 2005;1: <htpp:// [Consulta: 17 de enero de 2006] 13. Kyle RA, Therneau TM, Rajkumar SV, Larson DR, Plevak MF, Offord JR, Dispenzieri A, Katzmann JA, Melton LJ III. Prevalence of monoclonal gammopathy of undetermined significance. Engl J Med 2006; 354: Sirohi B, Powles R. Multiple myeloma. The Lancet 2004; 363: Durie BG, Kyle RA, Belch A, Bensinger W, Blade J, Boccadoro M, Child JA, Comenzo R, Djulbegovic B, Fantl D, Gahrton G, Harousseau JL, Hungria V, Joshua D, Ludwig H, Mehta J, Morales AR, Morgan G, Nouel A, Oken M, Powles R, Roodman D, San Miguel J, Shimizu K, Singhal S, Sirohi B, Sonneveld P, Tricot G, Van Ness B; Scientific Advisors of the International Myeloma Foundation. Myeloma management guidelines: a consensus report from the Scientific Advisors of the International Myeloma Foundation. Hematol J 2003; 4: Vladutiu AO. Immunoglobulin D: properties measurement and clinical relevance. Clin Diagn Lab Immunol 2000; 7: