TRABAJO DE GRADO. Requisito parcial para optar al título de Química Industrial. Presentado por: PAOLA XIMENA ERIRA TORRES

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1 ACTIVIDAD ALELOPÁTICA DEL EXTRACTO EN CLOROFORMO DE Henriettella trachyphylla, EN ACETATO DE ETILO DE Miconia coronata (MELASTOMATACEAE), Y LA BIOTRANSFORMACIÓN DE (R)-(-)-CARVONA POR Aspergillus spp. TRABAJO DE GRADO Requisito parcial para optar al título de Química Industrial Presentado por: PAOLA XIMENA ERIRA TORRES UNIVERSIDAD TECNOLÓGICA DE PEREIRA FACULTAD DE TECNOLOGÍA ESCUELA DE QUÍMICA Pereira, Mayo de

2 ACTIVIDAD ALELOPÁTICA DEL EXTRACTO EN CLOROFORMO DE Henriettella trachyphylla, EN ACETATO DE ETILO DE Miconia coronata (MELASTOMATACEAE), Y LA BIOTRANSFORMACIÓN DE (R)-(-)-CARVONA POR Aspergillus spp. TRABAJO DE GRADO Requisito parcial para optar al título de Química Industrial Presentado por: PAOLA XIMENA ERIRA TORRES Director: FRANCISCO JAVIER JIMÉNEZ GONZÁLEZ Asesor: Esp. Microbiología Industrial JOSÉ RAFAEL RODRÍGUEZ UNIVERSIDAD TECNOLÓGICA DE PEREIRA FACULTAD DE TECNOLOGÍA ESCUELA DE QUÍMICA Pereira, Mayo de

3 NOTA DE ACEPTACIÓN DEL TRABAJO DE GRADO ACTIVIDAD ALELOPÁTICA DEL EXTRACTO EN CLOROFORMO DE Henriettella trachyphylla, EN ACETATO DE ETILO DE Miconia coronata (MELASTOMATACEAE), Y LA BIOTRANSFORMACIÓN DE (R)-(-)-CARVONA POR Aspergillus spp. Presentado por: PAOLA XIMENA ERIRA TORRES Los suscritos director y jurado del presente trabajo de grado, una vez revisada la versión escrita y presenciado la sustentación oral, decidimos otorgar la nota de: Con la connotación: Para constanci a firmamos en la ciudad de Pereira hoy. El director: Nombre: Francisco Javier Jiménez González Jurado: Nombre: Dra. Luz Angela Veloza

4 Dedicatoria A DIOS, por estar presente en cada momento de mi vida, por fortalecer mi corazón e iluminar mi mente y por haberme puesto en el camino a aquellas personas que han sido mi soporte y compañía durante el periodo de estudio. A MIS PADRES CLARA ELISA TORRES y ANDRES JULIAN ERIRA, por su inmenso amor, dedicación, por estar a lo largo de mi vida velando por mi bienestar, con sus consejos que me dan ánimos en los momentos que más los he necesitado, no me alcanza la vida para agradecer a Dios, por los padres tan maravillosos que tengo. Este triunfo es de los tres por apoyarme en todo. A MI HERMANO DARIO ANDRES ERIRA (Q.E.P.D) por el apoyo y los consejos que me brindo durante su vida, porque siempre estuvo acompañándome, y sé que desde el cielo siempre estará cuidándome; te quiero mucho hermanito. A MI MEJOR AMIGO CHRISTIAN ENMANUEL PONCE, por estar siempre a mi lado, por comprenderme, dándome mucha fuerzas en los momentos difíciles de mi vida y su apoyo incondicional.

5 Agradecimientos A mi director FRANCISCO JAVIER JIMÉNEZ, por su constante y paciente seguimiento, por sus aportes, conocimientos, comentarios, sugerencias oportunas e inteligentes, por su tiempo dedicado durante el desarrollo de este trabajo, por su valiosa colaboración y por la confianza que me brindo. Al profesor Rafael Rodríguez por su colaboración y asesoría en la parte microbiológica A la doctora Luz Ángela Veloza, Hugo Arias, Diana Patricia Pelaez y a todos los compañeros del grupo Polifenoles A Carlos Humberto Montoya, María Victoria, Javier y Germán por su colaboración. A la Vicerroctoría de Investigación, Innovación y Extensión de la Universidad Tecnológica de Pereira, por la financiación de este proyecto. A los docentes de la Escuela de Química que hicieron parte de mi proceso de aprendizaje especialmente al profesor Jaime Niño.

6 Tabla de contenido Pág. INTRODUCCIÓN... XIV ANTECEDENTES...XV. SURGIMIENTO DEL PROBLEMA...XVIII. FORMULACIÓN DEL PROBLEMA...XVIII. OBJETIVOS...XVIII.. Objetivo general...xviii.. Objetivo específico...xviii. JUSTIFICACIÓN... XIX. MARCO TEÓRICO.... Descripción y distribución de la familia melastomataceae..... Química de la familia melastomataceae..... Farmacognosia de la familia melastomataceae.... Descripción y componentes químicos de los géneros Henriettella y Miconia..... Henriettella Naudin..... Miconia Ruiz & Pav.... Descripción y componentes químicos de las especies Henriettella trachyphylla y Miconia coronata..... Henriettella trachyphylla Triana..... Miconia coronata (BONPL.) DC.... Actividad alelopática..... Efectos de alelopatía..... Indicios de actividad alelopática de Henriettella trachyphylla Triana..... Indicios de actividad alelopática de Miconia coronata (BONPL.) DC..... Especies receptoras..... Aleloquímicos Ácidos grasos... I

7 ... Compuestos aromáticos..... Aleloquímicos como herbicidas naturales Tricetonas.... Biotransformación..... Reacciones de biotransformación Hidroxilación estereoselectiva Sulfoxidación Epoxidación Oxidación de Baeyer Villiger Reducción..... Ventajas de biotransformación..... Biotransformación por microorganismos..... Hongos Hongos del género Aspergillus spp Biotransformación de terpenos..... Terpenos Monoterpenos..... Biotransformación de terpenos por Aspergillus niger..... Carvona.... SECCIÓN EXPERIMENTAL.... Equipos.... Materiales y reactivos.... Material vegetal y microorganismos..... Material vegetal Especie receptora..... Microorganismos.....Obtención del extractos y fracciones..... Obtención del extracto en cloroformo de H. trachyphylla Triana Fracciones del extracto en cloroformo de H. trachyphylla... II

8 ... Separación de las fracciones HtCHF, HtCHF y HtCHF sobre placa TLC preparativa Separación de la fracción HtCHF sobre cartucho ODS Separación de la fracción HtCHFA sobre columna cromatográfica..... Obtención del extracto en acetato de etilo de M. coronata Fraccionamiento del extracto en acetato de etilo de M. coronata.... Bioensayo de actividad alelopática..... Pretratamiento de agua..... Preparación de soluciones blanco y control..... Preparación de soluciones de prueba Preparación de extractos Preparación de fracciones..... Etapas de la actividad alelopática Lavado Germinación Tratamiento con soluciones de prueba, blanco y control..... Determinación de actividad alelopática..... Análisis estadístico.... Evaluación de biotransformación..... Preparación de los medios de cultivo..... Observaciones del hongo Observaciones microscópicas..... Crecimiento de hongo..... Concentración de esporas..... Procedimiento para el cultivo del hongo..... Procedimiento para biotransformación de (R)-(-)-carvona utilizando Aspergillus spp..... Procedimiento de extracción..... Identificación de posibles productos biotransformados.... RESULTADOS Y DISCUCIÓN... III

9 . Fraccionamiento del extracto en cloroformo de Henriettella trachyphylla Triana..... Porcentaje de rendimiento de las fracciones del extracto en cloroformo de H. trachyphylla.... Separación de la fracción HtCHF sobre cartucho ODS Porcentaje de rendimiento de la fracción HtCHF.... Separación de la fracción HtCHFA sobre columna cromatográfica..... Porcentaje de rendimiento de la fracción HtCHFA.... Extracto en cloroformo de H. trachyphylla..... Crecimiento de las plántula de lechuga en presencia del extracto en cloroformo de H. trachyphylla..... Porcentaje de actividad alelopática del extracto en cloroformo de H. trachyphylla.... Evaluación de las fracciones del extracto en cloroformo de H. trachyphylla..... Selección de fracciones..... Fracción FA Crecimiento de las plántulas de lechuga en presencia de la fracción FA Porcentaje de actividad alelopática de fracción FA Posibles compuestos presentes en la fracción FA..... Fracción FA Crecimiento de las plántulas de lechuga en presencia de la fracción FA Porcentaje de actividad alelopática de fracción FA Posibles compuestos presentes en la fracción FA.... Extracto en acetato de etilo de M. coronata..... Crecimiento de la plántula de lechuga en presencia del extracto en acetato de etilo de M. coronata..... Porcentaje de actividad alelopática del extracto en acetato de etilo de M. coronata.... Evaluación de las fracciones del extracto en acetato de etilo de M. coronata..... Selección de fracciones..... Fracción Fr Crecimiento de la plántula de lechuga en presencia de la fracción Fr... IV

10 ... Porcentaje de actividad alelopática de la fracción Fr..... Fracción Fr......Crecimiento de las plántulas de lechuga en presencia de la fracción Fr Porcentaje de actividad alelopática de la fracción Fr..... Fracción Fr Crecimiento de las plántulas de lechuga en presencia de la fracción Fr Porcentaje de actividad alelopática de fracción Fr Posibles compuestos presentes en la fracción Fr..... Fracción Fr Crecimiento de las plántulas de lechuga en presencia de la fracción Fr Porcentaje de actividad alelopática de fracción Fr Posibles compuestos presentes en la fracción Fr.... Posibles estructuras de los compuestos presentes en las fracciones de H. trachyphylla. Biotransformación..... Observación del hongo..... Crecimiento del hongo..... Conservación del hongo Aspergillus spp Recuento de esporas en cámara de Neubauer..... Biotransformación de (R)-(-)-carvona utilizando Aspergillus spp..... Identificación del posible producto biotransformado Posible compuesto obtenido en biotransformación de (R)-(-)-carvona.... CONCLUSIONES... RECOMENDACIONES... BIBLIOGRAFÍA... ANEXOS... V

11 Índice de tablas Pág. Tabla. Algunas enzimas de Hongos.... Tabla. Ejemplos de biotransformación de terpenos utilizando hongos y bacterias.... Tabla. Promedio y desviación estándar de las medidas diarias en mm... Tabla. Análisis de datos (medida diaria en mm)... Tabla. Análisis de datos (promedio y desviaciones estándar)... Tabla. Análisis de datos (Ecuación de inhibición)... Tabla. Valores de Rf de las fracciones HtCHFA... Tabla. Porcentaje de acción alelopática del extracto en cloroformo de H. trachyphylla sobre hipocótilo de plántula de lechuga... Tabla. Porcentaje de acción alelopática del extracto en cloroformo de H. trachyphylla sobre epicótilo de plántula de lechuga... Tabla. Porcentaje de acción alelopática de FA sobre hipocótilo de plántula de lechuga... Tabla. Porcentaje de acción alelopática de FA sobre epicótilo de plántula de lechuga... Tabla. Posibles compuestos presentes en la fracción FA... Tabla. Porcentaje de acción alelopática de FA sobre hipocótilo de plántula de lechuga... Tabla. Porcentaje de acción alelopática de FA sobre epicótilo de plántula de lechuga... Tabla.Posibles compuestos presentes en la fracción FA... Tabla. Porcentaje de acción alelopática del extracto en acetato de etilo de M. coronata sobre hipocótilo de plántula de lechuga... Tabla. Porcentaje de acción alelopática del extracto en acetato de etilo de M. coronata sobre epicótilo de plántula de lechuga... Tabla. Porcentaje de acción alelopática de Fr sobre hipocótilo de plántula de lechuga.. Tabla. Porcentaje de acción alelopática de Fr sobre epicótilo de plántula de lechuga.. VI

12 Tabla. Porcentaje de acción alelopática de Fr sobre hipocótilo de plántula de lechuga.. Tabla. Porcentaje de acción alelopática de Fr sobre epicótilo de plántula de lechuga.. Tabla. Porcentaje de acción alelopática de Fr sobre hipocótilo de plántula de lechuga.. Tabla. Porcentaje de acción alelopática de Fr sobre epicótilo de plántula de lechuga.. Tabla. Posibles compuestos de la fracción Fr... Tabla. Posibles fragmentos de guaiacol... Tabla. Porcentaje de acción alelopática de la fracción Fr sobre hipocótilo en plántula de lechuga... Tabla. Porcentaje de acción alelopática de la fracción Fr sobre epicótilo en plántula de lechuga... Tabla. Posibles compuestos de la fracción Fr... Tabla. Posibles compuestos de las fracciones FA y FD... Tabla. Posibles fragmentos de,,-trimetil--pentadecanona... Tabla. Posibles fragmentos de olean--en--ona... Tabla. Posibles compuestos de las fracciones FB, FC y FD... Tabla. Concentración de esporas en diferentes ensayos... Tabla. Posibles fragmentos de trans-carveol... VII

13 Índice de figuras Pág. Figura. Estructura química de flavona,, --C-arabinósido...XV Figura. Publicaciones en revistas científicas sobre varios tipos de biocatálisis en los últimos años... XVI Figura. Estructura química de tricetonas... Figura. Reacciones de biotransformación... Figura. Biotransformación de (R)-(+)-limoneno por Penicillum... Figura. Aspergillus spp..... Figura. Estructura química de isopreno... Figura. Biotransformación de (R)-(-)-limanolol por A. niger... Figura. Biotransformación de limoneno por A. niger... Figura. Bioconversión de α-pineno por A. niger... Figura. Bioconversión de β-pineno por A. niger... Figura. Bioconversión de β-ionona por A. niger... Figura. Estructura química de carvona... Figura. Bioconversión de carvona... Figura. Biotransformación de (S)-(+)-carvona por P. putida y A. lwoffi... Figura. Biotransformación de (R)-(-)-carvona por P. putida y A. lwoffi... Figura. Procedimiento de extracción de las hojas secas y molidas H. trachyphylla... Figura. Fraccionamiento realizado al extracto en cloroformo.... Figura. Diagrama de fraccionamiento realizado a la fracción HtCHF... Figura. Separación de la fracción HtCHFA sobre columna cromatográfica.... Figura. Procedimiento de la extracción de las hojas secas y molidas M. coronata... Figura. Fraccionamiento del extracto en acetato de etilo de M. coronata... Figura. Bioensayo de actividad alelopática... Figura. Tratamiento para blanco, control, extracto y fracción... Figura. Promedio de medidas diarias.... Figura. Velocidad de crecimiento por día de las plántulas de lechuga... Figura. Promedio de medidas diarias.... VIII

14 Figura. Diagrama de barras, porcentaje de actividad alelopática... Figura. Toma de submuestra a partir de la suspensión madre del hongo Asp. spp.... Figura. Cultivo del hongo.... Figura. Almacenamiento del hongo.... Figura. Proceso de biotransformación... Figura. Porcentaje de rendimiento de las fracciones obtenidas del extracto en cloroformo de H. trachyphylla... Figura. Porcentaje de rendimiento de la fracción HtCHF... Figura. Porcentaje de rendimiento de la fracción HtCHFA... Figura. Medida de crecimiento del extracto en cloroformo de H. trachyphylla, sobre hipocótilo (a.) y epicótilo (b.) de las plántulas de lechuga... Figura. Efecto del ext. en cloroformo de H. trachyphylla en el crecimiento de hipocótilo Figura. Efecto del extracto en cloroformo de H. trachyphylla en el crecimiento de epicótilo... Figura. Medida de crecimiento de la fracción FA, sobre hipocótilo (a.) y epicótilo (b.) de las plántulas de lechuga... Figura. Efecto de la fracción FA en el crecimiento de hipocótilo... Figura. Efecto de la fracción FA en el crecimiento de epicótilo... Figura. Espectro de RMN H de la fracción FA... Figura. Medida de crecimiento de la fracción FA, sobre el hipocótilo (a.) y de epicótilo (b.)de las plántulas de lechuga... Figura. Efecto de la fracción FA en el crecimiento de hipocótilo... Figura. Efecto de la fracción FA en el crecimiento de epicótilo... Figura. Espectro de RMN H de la fracción FA... Figura. Medida de crecimiento del extracto en acetato de etilo de M. coronata, sobre hipocótilo (a.) y epicótilo (b.) de las plántulas de lechuga... Figura. Efecto del extracto en acetato de etilo de M. coronata en el crecimiento de hipocótilo... Figura. Efecto del extracto en acetato de etilo de M. coronata en el crecimiento de epicótilo... Figura. Medida de crecimiento de la fracción de la fracción Fr, sobre hipocótilo (a.) y epicótilo (b.) de las plántulas de lechuga... IX

15 Figura. Efecto de la fracción Fr en el crecimiento de hipocótilo... Figura. Efecto de la fracción Fr en el crecimiento de epicótilo... Figura. Medida de crecimiento de la fracción Fr, sobre hipocótilo (a.) y epicótilo (b.) de las plántulas de lechuga... Figura. Efecto de la fracción Fr en el crecimiento de hipocótilo... Figura. Efecto de la fracción Fr en el crecimiento de epicótilo... Figura. Medida de crecimiento de la fracción Fr, sobre hipocótilo (a.) y epicótilo (b.) de las plántulas de lechuga... Figura. Efecto de la fracción Fr en el crecimiento de hipocótilo... Figura. Efecto de la fracción Fr en el crecimiento de epicótilo... Figura. Posible mecanismo de fragmentación de guaiacol... Figura. Medida de crecimiento de la fracción Fr sobre hipocótilo (a.) y epicótilo (b.) de las plántulas de lechuga... Figura. Efecto de la fracción Fr en el crecimiento de hipocótilo... Figura. Efecto de la fracción Fr en el crecimiento de epicótilo... Figura. Posible fragmentación de,,-trimetil--pentadecanona (a.) vía McLafferty (b.) fragmentación por ruptura homolitica... Figura. Posible fragmentación de fitol... Figura. Posible fragmentación de olean--en--ona... Figura. Aspergillus spp., en medio PDA (a.) en días, (b.) en días... Figura. Aspergillus spp., microscópicamente x... Figura. Aspergillus spp., microscópicamente x... Figura. Crecimiento de Aspergillus spp., em medios: (a.) rosa de bengala, (b.) PDA y (c) sabouraud... Figura. Placa cromatográfica del material de partida (R)-(-)-carvona... Figura. Placa cromatográfica del extracto obtenido en la biotransformación... Figura. Cromatograma del producto biotransformado de (R)-(-)-carvona... Figura. Espectro de masas de la biotransformación de (R)-(-)-carvona... Figura. Posible fragmentación de trans-carveol... Figura. Biotransformación de (R)-(-)-carvona por Aspergillus spp..... X

16 Índice de Anexos Pag. Anexo. Formato para la toma de datos entre los siete días de la actividad alelopática..... Anexo.Medios de cultivo.... Anexo. Medidas diarias del extracto en cloroformo de H. trachyphylla... Anexo. Medidas diarias de la fracción FA... Anexo. Medidas diarias de la fracción FA... Anexo. Medidas diarias del extracto en acetato de etilo de M. coronata.... Anexo. Medidas diarias de la fracción Fr... Anexo. Medidas diarias de la fracción Fr... Anexo. Medidas diarias de la fracción Fr... Anexo. Espectros UV de Fr y Fr... Anexo. Medidas diarias de la fracción Fr... XI

17 RESUMEN En este estudio, se evaluó la actividad alelopática del extracto en cloroformo de Henriettella trachyphylla Triana, el extracto en acetato de etilo de Miconia coronata (BONPL.) D.C. pertenecientes a la familia melastomataceae y sus respectivas fracciones, frente a plántulas de lechuga (Lactuca sativa L.). El extracto en cloroformo de H. trachyphylla se separó en columna cromatográfica empacada sobre sílicagel, obteniéndose diez fracciones, nombradas como HtCHF hasta HtCHF. Las fracciones HtCHF, HtCHF y HtCHF provenientes del extracto en cloroformo de H. trachyphylla, se separaron por cromatografía preparativa en capa fina sobre sílicagel. Se obtuvieron subfracciones de HtCHF nombradas como (FA, FB, FC, FD, FE), de HtCHF (FA - FD) y subfracciones de HtCHF (FB - FF). Las fracciones FB, FE, FA y FD se identificaron posibles estructuras por medio de CG-EM. Para las fracciones FC y FD se identificó tetracontano y hexacosano respectivamente como posibles estructuras por medio de CG-EM y RMN H. El extracto en cloroformo de H. trachyphylla presento un máximo de actividad alelopática inhibitoria en hipocótilo (-,%), y del,% como promotor de crecimiento en epicótilo para el segundo día del ensayo, mientras que las fracciones FA y FA exhibieron efecto inhibidor, tanto para el hipocótilo como para epicótilo. Las fracciones Fr, Fr, Fr y Fr de M. coronata mostraron actividad alelopática inhibitoria de crecimiento en hipocótilo con máximo de -,% (quinto día), -,% (quinto día), -,% (segundo día), -,% (segundo día), respectivamente; mientras que para epicótilo se observó inhibición de crecimiento al tercer día del -,%, -,%,,% y -,%. También, se realizó en este trabajo la biotransformación de (R)-(-)-carvona utilizando como biocatalizador Asperguillus spp., obteniéndose posiblemente trans-carveol como producto de la Biotransformación, caracterizado por cromatografía de gases acoplada a espectrometría de masas. Palabras Claves: Actividad alelopática, Aspergillus spp., Biotransformación, (R)-(-)carvona, Henriettella trachyphylla, Lactuca sativa, melastomataceae, Miconia coronata XII

18 ABSTRACT In this study, the allelopathic activity of chloroform extract from Henriettella trachyphylla Triana and the ethyl acetate extract from Miconia coronata (BONPL.) D.C., belonging to melastomataceae family was evaluated and its fractions, both against lettuce (Lactuca sativa L.) seedlings. Chloroform extract from H. trachyphylla was fractionated on a silicagel chromatographic column, getting ten fractions named as HtCHF to HtCHF. Fractions HtCHF, HtCHF and HtCHF from the chloroform extract of H. trachyphylla, were developed by preparative thin layer chromatography to obtained subfraction from HtCHF named (FA, FB, FC, FD, FE), from HtCHF (FA - FD) and subfractions from HtCHF (FB - FF). The fractions FB, FE, FA and FD possible structures were identified by GC/MS. The fractions FC and FD were identified hexacosane and tetracontane, respectively, as possible structures by GC-MS and H NMR. The chloroform extract from H. trachyphylla presented the highest inhibitory allelopathic activity (-.%) on hypocotyl and.% as epicotyl growth promoter in the second day. The subfractions FA and FA from the fraction HtCHF showed inhibitory effect on hypocotyl and epicotyl. fractions Fr, Fr, Fr and Fr from M. coronata showed the best inhibitory allelopathic activity in the hypocotyl -.% (five day), -.% (five day), -.% (two day), -.% (two day), respectively; while, for epicotyl showed growth inhibition at the thirt day.%, -.%, -.% and -.%. Also, was performed in this work, the biotransformation of (R)-(-)-carvone using Aspergillus spp as biocatalyst. trans-carveol possibly being obtained as product of the biotransformation, characterized by gas chromatography coupled to mass spectrometry. Key words: Allelopathic activity, Aspergillus spp, biotransformation, (R)-(-)-carvone, Henriettella trachyphylla, Lactuca sativa, melastomataceae, Miconia coronata. XIII

19 INTRODUCCIÓN La actividad alelopática ha sido definida por la Sociedad Internacional de Alelopatia (AIS) como las relaciones de inhibición o estimulación del crecimiento entre plantas, involucrado bacterias, hongos y algas. En la evaluación de la actividad alelopática, se utilizaron extractos de las plantas Henriettella trachyphylla Triana y Miconia coronata Bonpl. D.C., pertenecientes a la familia melastomataceae. Se ha reportado en la literatura que el género Miconia posee propiedad alelopática, antibiótica, antitumoral, analgésica, citotóxica y antimalaria. El género Henriettella no ha sido estudiado ampliamente en cuanto a su química y farmacognosia, aunque se reporta alguna actividad alelopática. Para la realización de este trabajo de investigación se tomó el extracto clorofórmico de H. trachyphylla y el extracto en acetato de etilo de M. coronata para su evaluación frente a semillas germinadas de lechuga (Lactuca Sativa L.) usadas como material de bioensayo. La biotransformación puede ser definida como las transformaciones químicas regioselectiva y estereoespecifica que son catalizadas por sistemas biológicos a través de sus estructuras de enzimas. La biotransformación de los terpenos es de gran interés debido a que conlleva a la producción de compuestos enantioméricamente puros, como es el caso de aromas y fragancias en condiciones suaves de reacción. Los productos biotransformados pueden ser considerados como naturales. El monoterpeno (R)-(-)-carvona presenta actividad antibiótica y propiedades reguladoras del crecimiento de las plantas. Por tal motivo, en este trabajo se evaluó la biocatálisis de (R)-(-)-carvona utilizando Aspergillus spp., en condiciones muy suaves de reacción. Del extracto obtenido fue identificada la posible estructura trans-carveol por cromatografía de gases acoplada a espectrometría de masas. XIV

20 . ANTECEDENTES Durante las dos últimas décadas, la ciencia de la alelopatía ha atraído un gran número de investigadores. Esto ha sido en gran medida, por las perspectivas de que la alelopatía es válida en la agricultura y la calidad en la producción de alimentos para humanos. En reducir los daños ambientales por la dependencia a los herbicidas sintéticos y los riesgos generados, en ocasiones por contaminación cruzada a otros cultivos y ríos cercanos en áreas de actividad agrícola. En reportes internacionales se han encontrado varios estudios, como el realizado sobre la planta Sambucus nigra L., donde se obtuvieron veinticuatro metabolitos de tipo aromático, perteneciente a grupos tales como cianogeninas, lignanos, flavonoides y glicósidos fenólicos. Siendo las cianogeninas las causantes de un efecto inhibidor del crecimiento en en plántulas. Del género Henriettella se tiene el reporte de H. fascicularis (Sw.), de la cual se aislaron ácido palmítico, ácido betulínico, β-sitosterol, (-)-pinoresinol,,,-trihidroxi--dimetilisoflavona y taxifilina. La presencia de taxifilina, un glicósido cianogénico indica la toxicidad potencial de esta planta en herbívoros. Estudios realizados por el Grupo Polifenoles, para el extracto en isopropanol-agua (-) de H. trachyphylla, y sus respectivas fracciones frente a plántulas de lechuga (Lactuca sativa L.), mostraron actividad alelopática tanto inhibitoria como promotora del crecimiento; algunas de sus fracciones activas presentaron compuestos de tipo flavonoide según pruebas de caracterización. Varios estudios realizados sobre extractos de algunas plantas pertenecientes al género Miconia, muestran actividades biológicas potenciales, tales como antibiótica, antitumoral y analgésica; y la presencia de triterpenos, cumarinas y benzoquinonas. Mientras estudios locales suguieren que los extractos butanólico y en acetato de etilo de M. aeruginosa y M. coronata, respectivamente, ejercen actividad alelopática inhibitoria del % frente a plántulas de tomate (Lycopersicum esculetum L.). Resultando el compuesto responsable de esta actividad como flavona,, -trihidroxi--c-arabinósido (fig.). H H H OH HO O OH H H O H H OH H HO OH H O H Figura. Estructura química de flavona,, --C-arabinósido Otro estudio que hace parte de este proyecto de investigación, esta relacionado con los procesos que se involucran biotransformaciones de metabolitos secundarios obtenidos de productos naturales. Estos procesos son cada vez más usados para reemplazar reacciones XV

21 químicas convencionales, y para facilitar la formación de nuevos productos, utilizando como mediadores microorganismos que dan alta especificidad y selectividad a los productos obtenidos. La biotransformación como es el caso de los terpenos es de gran interés porque permite la produccion de compuestos estereoselectivamente puros bajo condiciones suaves que se pueden considerar productos naturales. Monoterpenos como α-pineno, β-pineno y p-cimeno son económicamente disponibles en grandes cantidades, y valiosos compuestos utilizados en la industria de los sabores.. Según estudios internacionales, en los que se describe la biotransformación de terpenos usando como biocatalizadores enzimas, extractos de células, células enteras de bacterias, cianobacterias, levaduras, microalgas, hongos y plantas (Fig. ), sugieren que las células bacterianas y los hongos son los de mayor utilización en biocatálisis,. Figura. Publicaciones en revistas científicas sobre varios tipos de biocatálisis en los últimos años A partir de la bioconversión de los monoterpenos geraniol, nerol y citral se logró obtener metil--hepten--ona por medio de Penicillum digitatum, mientras que por Aspergillus niger se obtuvó linalool y α-terpineol a partir de geraniol y neol. Linalool, α-terpineol y limoneno fueron los principales productos obtenidos de nerol y citral. Trabajos realizados sobre la biotransformación de carvona, un componente muy utilizado en la industria de sabores y fragancias, arrojó dos enantiómeros (-)-(R) y (+) (S) carvona por medio de Pseudomonas putida, se obtuvieron (R,R)-dihidrocarvona y (R-S)dihidrocarvona, respectivamente. Acinetobacter lwoffi reduce a (-)-(R)-carvona en (R, R)-dihidrocarvona y en (R,R,R)-dihidrocarveol. Con la información anterior se pretende realizar un estudio de la actividad alelopática del extracto en cloroformo de H. trachyphylla y el extracto en acetato de etilo de M. coronata, ambas especies pertenecientes a la familia melastomataceae. Como también la biotransformación de (R)-(-)-carvona utilizando como agente biotransformador una cepa Aspergillus spp., recuperado en una práctica de docencia del laboratorio de microbiología. XVI

22 . SURGIMIENTO DEL PROBLEMA En las comunidades vegetales algunas especies regulan a otras produciendo o liberando repelentes, atrayentes, estimulantes o inhibidores químicos. Estas sustancias producidas por las plantas promueven un fenómeno natural que se conoce como alelopatía. Los efectos alelopáticos dañan parcial o totalmente la germinación y el crecimiento de las plantas, o por el contrario pueden generar mayores porcentajes de germinación y crecimiento. Los insectos, microorganismos y malezas son en la mayoría de los casos responsables en la reducción de los rendimientos en cultivos. Estas pérdidas se pueden reducir mediante el uso de plaguicidas sintéticos, sin embargo, el uso indiscriminado de estos productos ocasiona problemas como surgimiento de organismos resistentes a los mísmos, acumulación de residuos tóxicos en productos agrícolas y contaminación al medio ambiente en general. Esto prueba que el uso de compuestos de reconocida actividad alelopática puede ser generadores del desarrollo en la agroquímica, y muy favorables para la actividad agrícola en nuestra eco-región Eje Cafetero. A su vez, desde el punto de la química verde, las biotransformaciones constituyen un método importante en síntesis orgánica. Avances en el desarrollo de nuevos compuestos con alta selectividad se han producido a partir de diferentes sustratos, los cuales, además de presentar importantes actividades biológicas, presentan gran variedad estructural. Lo anterior ha motivado a que el Grupo Polifenoles se interese en la búsqueda de productos alternativos en la protección de cultivos contra la acción de algunos organismos y malezas cuya actividad, selectividad y seguridad ambiental sea adecuada. Utilizando productos naturales menos agresivos para el medio ambiente y que representan una fuente alternativa de plaguicidas naturales en la agricultura. Del mismo modo se buscan productos de origen natural con mejores propiedades biológicas. XVII

23 . FORMULACIÓN DEL PROBLEMA Presentan actividad alelopática el extracto clorofórmico de Henriettella trachyphylla, y el extracto en acetato de etilo de Miconia coronata? Es posible obtener compuestos biotransformados a partir del monoterpeno (R)-(-)-carvona por medio del hongo Aspergillus spp.?. OBJETIVOS.. Objetivo general Determinar la actividad alelopática de algunos extractos y fracciones obtenidos a partir de Henriettella trachyphylla y Miconia coronata (melastomataceae), y evaluar la capacidad biotransformadora del hongo Aspergillus spp., sobre (R)-(-)-carvona... Objetivos específicos... Evaluar la actividad alelopática de algunos extractos y fracciones obtenidos a partir de Henriettella trachyphylla y Miconia coronata (melastomataceae), sobre el crecimiento de plántulas de lechuga (Lactuca sativa L.).... Realizar la biotransformación de la (R)-(-)-carvona utilizando como biocatalizador Aspergillus spp. XVIII

24 . JUSTIFICACIÓN Alelopatía surge de la liberación de sustancias químicas por una especie de planta que afecta a otras especies en sus alrededores, por lo general en su perjuicio. Uno de los principales estudios acerca de la utilización de la alelopatía es la investigación sobre productos naturales para el control de malezas, destinadas a reducir el uso de herbicidas sintéticos, preservando el medio ambiente, y así contribuir a la agricultura sostenible, como una herramienta de trabajo en cultivos. La actividad alelopática ha venido siendo estudiada por parte del Grupo Polifenoles, en los extractos en acetato de etilo de Miconia coronata, en n-butanol y acuoso de Miconia aeruginosa, en acetona % de Miconia prasina, en acetona % de Miconia dolichorryncha, en acetona % de Miconia trinervia, en acetona % de Miconia minutiflora, en i-propanol-agua Henriettella trachyphylla, en i-propanol-agua, en acetona % de Tibouchina multiflora, en i-propanol-agua de Bellucia grossularioides y ipropanol-agua (:) de Bellucia pentámera, en i-propanol-agua (:) de Aciotis purpurascens y Tococa guianensis, con resultados promisorios de promoción e inhibición de crecimiento en plántulas de lechuga (Lactuca sativa L.) y semillas de tomate (Lycopersicum esculentum L.). Por otra parte, los procesos biotransformadores han adquirido importancia a nivel mundial debido a la obtención de moléculas isómeras con propiedades diferentes a los productos de partida, generando nuevos tipos estructurales que posibilitan aún más la adquisición de materias primas para otras posibles síntesis. Por lo tanto, se mejoran las posibilidades y ventajas que ofrece en la obtención de productos de interés comercial, ya sean en síntesis fina, farmacéutica y la agroindustria. Con base en la información aportada anteriormente, se pretende evaluar la actividad alelopática de extractos y fracciones de algunas plantas del género de Henriettella y Miconia pertenecientes a la familia de melastomataceae sobre plántulas de lechuga (Lactuca sativa L.). Así como, obtener productos biotransformados a partir de (-)-carvona por medio de Aspergillus spp. XIX

25 . MARCO TEÓRICO. Descripción y distribución de la familia melastomataceae Melastomataceae Juss, comprende arbustos, trepadoras, leñosas, hierbas y árboles. Es la séptima familia más diversa del planeta con especies en a géneros. Se reconoce fácilmente por el patrón de nerviación de las hojas. Muchas especies se caracterizan por tener flores, siendo estas aprovechas por su importancia como ornamentales,. La familia melastomatácea, se producen en todos los biomas tropicales, particularmente de las regiones del Nuevo Mundo. En Suramérica se encuentran géneros, ninguno de ellos existe en el viejo mundo. Para Colombia se registran aproximadamente especies y géneros, distribuidas en los Andes, Chocó y Amazonía. En la Orinoquía se encuentran géneros y alrededor de especies... Química de la familia melastomataceae La química de las melastomatáceas es poco conocida. Se caracteriza por su contenido de compuestos de tipo triterpenos, escaso en alcaloides y fenólico como taninos y flavonoides. La mayor parte de los constituyentes de las plantas melastomataceae son taninos hidrolizables. Hasta ahora los taninos hidrolizables aislados de especies de malastomataceae son representativos de grupos galotaninos y elagitaninos. La composición de los taninos hidrolizables oligoméricos de Tibouchina multiflora, colectada en Colombia, fueron similares a los de T. semidecandra, incluyendo,,,tetragaloilglucopiranosa, casuarictin, pterocarianin C, pedunculagin, y los nobotaninos AK. Recientemente, se reportaron los cinco nuevos pentámeros denominados melastoflorinos A E aislados de las hojas de Monochaetum multiflorum, junto con nueve nuevos nobotaninos O W, dimeros, trímeros y tetrámeros. Los géneros Lavoisiera, Microlicia, y Trembleya fueron analizados por su composición en flavonoides. Un total de compuestos fueron obtenidos, encontrándose flavonoles y flavonas glicosiladas. Las flavonas más comunes encontradas en el género Lavoisiera (los cuales frecuentemente son metoxiladas), incluyen derivados -oxigenados. Los flavonoles son predominantes en especies del género Microlicia. Se han detectado alcaloides en Clidemia hirta D. Don y Sonerila heterostemon Naudin, pero aún no se han aislado. En la planta Clidemia floribunda Planch, se ha detectado el ácido caféico. Molisch, describió en la presencia de antocianinas en las raíces de algunas especies de melastomataceaes, como centradenia grandiflora Endl. Ex. Walp,

26 Monochaetum umbellatum Naudin, Tibouchina semidecandra Cogn, Medinillina magnifica Linl, Bertolonia aenea Naudin, B. Marmorata Naudin, y B. vittata... Farmacognosia de la familia melastomataceae Las plantas melastomataceaes han sido usadas para medicina tradicional, especialmente en Asia y Latinoamérica, como astringentes, hemostáticos, como remedios para diarrea, disentería, leucorrea y enfermedades de la piel; contra afecciones respiratorias, malaria, cálculos en la vejiga y otras enfermedades del tracto genitourinario, irritaciones en las encías y como diurético. En Colombia, algunas especies de la familia son usadas como medicina tradicional para el tratamiento de la malaria, infecciones, heridas en la piel, enfermedades respiratorias, cálculos en la vejiga y otras dolencias genitourinarias, como diurético, y como un remedio tópico para irritaciones en la encía. Según información de pobladores en Riosucio Caldas, indican que Tibouchina ciliaris y Monochaetum multiflorum han sido usadas tradicionalmente para el tratamiento de infecciones en heridas de la piel.. Descripción y componentes químicos de los géneros Henriettella y Miconia.. Henriettella Naudin El género Henriettella Naudin, se caracteriza por árboles o arbustos con flores tetrámeras o pentámeras, hojas cartáceas a subcoriáceas, pétalos ovados a lanceolados, obtusamente agudos a obtusos apicalmente, blancos o amarillentos. Este género cuenta con alrededor especies, que se distribuyen desde Guatemala hasta Bolivia y el sur oriente de Brasil. En Colombia se registran especies en las regiones del Chocó, Magdalena Medio, Andes, Sierra Nevada, Orinoquía, las Guayanas y Amazonía, entre los y los metros de altitud. De la fracción en acetato de etilo de Henriettella fascicularis condujo al aislamiento de taxifilina y, -di-o-metil ácido- -β-d-glucósido elágico y ha mostrado potencial toxicidad en los herbívoros. A partir de la fracción en diclorometano de Henriettella fascicularis se registraron el ácido palmítico, β-sitosterol, (-)-pinoresinol,,,-trihidroxi,-dimetilisoflavona y ácido (E,S)--[(R,Z,aS,R,Z,aR)-,,,ª,,,,,,adecahidro--hidroxi-a-,-trimetilciclopentamocicloundecano--il]-.metil-hept-enoico... Miconia Ruiz & Pavon El género Miconia Ruiz & Pav., se caracteriza por arbustos o árboles, raramente trepadoras

27 leñosas, hojas cartáceas a coriáceas, enteras a onduladas, serruladas, o denticuladas. Inflorescencias en panículas o cimas multifloras erectas (raramente péndulas) terminalmente bracteadas, raramente en espigas verticiladas. Flores, típicamente bisexuales o unisexuales. Este es el género más diversificado de la familia con cerca de especies distribuidas en todo el Neotrópico, desde el nivel de mar hasta los páramos. En Colombia se conocen más de especies en todas las ecorregiones, climas y altitudes, excepto ambientes secos. Extractos y compuestos aislados de Miconia han demostrado diferentes actividades biológicas como antibióticas, antitumorales, analgésicas y propiedades contra la malaria. Las sustancias más comúnmente aisladas de estas plantas son del tipo benzoquinona. Del extracto etanólico de las ramas y hojas de Miconia myriantha se obtuvieron matucinol-o-[","-di-o-galoil]-β-d-glucopiranósido, matucinol--o-[","-di-o-(s)-hexahidroxidifenoil]-β-d-glucopiranosido y junto con matucinol--o-β-d-glucopiranósido, ácido elágico,, -di-o-metil ácido--o-β-d-xilopiranósido elagico, y ácido gálico. Los compuestos matucinol--o-[","-di-o-(s)-hexahidroxidi- fenoil]-β-d-glucopiranosido y ácido elagico han presentado efectos inhibitorios contra las proteasas asparticas secretadas (SAPs) de Candida Albicans. Del extracto en acetato de etilo de las hojas de Miconia lepidota se aislaron dos benzoquinonas; -metoxi--pentil-,-benzoquinona (primin) y -metoxi--heptil-,benzoquinona. Ambas quinonas presentaron actividad contra cepas mutantes de la levadura Saccharomyces cerevisiae, indicando una actividad citotóxica y anticancerígena potencial. El fraccionamiento del extracto butanólico de Miconia aeruginosa se encontró una flavona,, -trihidroxi--c-arabinósido, presentando actividad alelopática con un porcentaje de inhibición alrededor del % sobre semillas de tomate (Lycopersicum esculetum L.). El compuesto nonacosano caracteriza el género de Miconia Ruiz & Pav. porque se encuentra en M. aeruginosa Naud, M. coronata (Bonpl) DC, M. dolichoryncha Naud y M. trinervia (Sw), mientras que estigmasterol--en--ona caracterizan a M. aeruginosa Naud; el heptacosano a M. coronata (Bonpl) DC; el,-dimetil--(-metil-ciclohexil)--decen-ol a M. dolichoryncha Naud.; el fitol a M. trinervia (Sw) y es de notable importancia la presencia del flavonoide h--benzopirano--ona-,-dimetoxi--(-metoxifenil) solo en M. trinervia (Sw), siendo este el gran valor quimiotaxonómico. El fraccionamiento guiado por bioensayo del extracto en cloruro de metileno de Miconia fallax DC y Miconia stenostachya DC llevo al aislamiento de cinco triterpenos ácidos. El triterpeno ácido ursólico, ácido oleanólico, ácido gipsogénico, derivados del acetil y metil

28 ester. El fraccionamiento del extracto en etanol de ramas y hojas de Miconia trailii, se obtuvieron dos glicosidos flavononas, mateucinol -O-α-L-arabinosopiranosil( )-β-dglucopiranósido y farrerol -O-β-D-apiofuranosil( )-β-d-glucopiranósido.. Descripción y componentes químicos de las especies Henriettella trachyphylla y Miconia coronata.. Henriettella trachyphylla Triana La especie de H. trachyphylla se caracteriza por árboles - m de altura; ramas y pecíolos densa a moderadamente verrucoso-hirsutos, hojas elípticas a elíptico-obovadas, flores densamente estrigosos, pétalos ovados, glabros en ambas superficies, blancos. El fraccionamiento guiado por bioensayos del extracto en isopropanol agua de Henriettella trachyphylla, sugieren la presencia de isoflavonas y flavonas... Miconia coronata (BONPL.) DC La especie de M. coronata, se caracteriza por ser árboles coposos, con hojas inflorescente, flores pentámeras con pedicelos cortos, estambres levemente desiguales en tamaño, con filamento blanco o rosado, fruto en baya. Esta especie tiene como localidad típica el norte del Quindío y se encuentran distribuidas en las cordilleras central y oriental. En clima templados crece a orillas de los bosques y junto a quebradas de suelos húmedos. El extracto en acetato de etilo de M. coronata, evidencia la naturaleza fenólica de los constituyentes mayoritarios. Las fracciones provenientes del extracto en acetona acuosa de M. coronata, se obtuvieron ácido elágico, kamferol--o--α,β-ramnosido, compuestos de tipo flavonoide, los cuales han mostrado tener actividad antibacterial. A partir de fracciones provenientes del extracto en n-hexano de M. coronata, se identificó mediante pruebas de clasificación y por técnicas espectroscópicas (UV-vis, IR, RMN H y C), el metabolito secundario β-sitosterol que presenta actividad inhibitoria in vitro contra enzimas, actividad inhibitoria moderada contra parásitos, efecto inhibitorio en el crecimiento de las células de cáncer de colon, como componente dietético, propiedades anticancerigenas (cáncer de próstata y de seno), efecto hipocolesterolemico intrínseco y de antifertilidad en ratas, para el control de obesidad, actividad antifungica y antibacterial in

29 vitro, como analgésico, antimutagenica en ratas. actividad antiinflamatoria, antipirética, antelmintica y. Actividad alelopática La alelopatía es oficialmente definida por la Sociedad Internacional de Alelopatía (AIS) como la ciencia que estudia procesos en lo que se involucran, principalmente metabolitos secundarios producidos por plantas, algas, bacterias y hongos, que influyen en el crecimiento, desarrollo en la agricultura y sistemas biológicos, incluyendo efectos positivos y negativos. El término Alelopatia (del griego allelon = una al otro, del griego pathos = sufrir; efecto injurioso de uno sobre otro). Fue utilizado por primera vez por Molisch (). La alelopatía es descrita como la interacción bioquímica beneficiosa o perjudícal entre las plantas y los microorganismos. Rice en define alelopatía como cualquier efecto directo o indirecto de una planta, incluidos los microorganismos, a través de la producción de compuestos químicos que se escapan en el medio ambiente, posteriormente influyen en el crecimiento y el desarrollo de las plantas vecinas. Se incluyen tanto inhibidores y estimulantes. La alelopatía fue considerada inicialmente a ser una rama de las ciencias ecológicas y la investigación se centro en descripciones cualitativas de las especies vegetales predominantes o invasivo. Hoy alelopatía es estudiada por disciplinas relacionadas con el estudio de las plantas en: ecología, bioquímica, química (aislamiento de productos naturales y de síntesis), fisiología vegetal, técnica de agricultura, silvicultura, reproducción genética, estudio de suelos y, más recientemente, la proteómica y genómica,... Efectos de alelopatía A nivel celular, los aleloquímicos afectan a la permeabilidad de la membrana, la concentración de clorofila y las tasas de respiración mitocondrial o causa anormal funcionamiento del ribosoma, lo que reduce la eficiencia de la función celular. A nivel de plantas, los aleloquímicos afectan en: Las raíces: puede cambiar la absorción de nutrientes y la conductividad del agua. Los tallos: El transporte del agua y el carbono puede verse limitado. Las hojas: puede alterarse el potencial fotosintético. La capacidad de germinación de la semilla puede disminuir. A nivel de ecosistema, los aleloquimicos son capaces de inhibir o disminuir las tasas de nitrificación y afectar los microorganismos en los suelos forestales.

30 .. Indicios de actividad alelopática de Henriettella trachyphylla Triana Estudios realizados de actividad alelopática del extractos en isopropanol-agua (:) y fracciones de las hojas de H. trachyphylla, mostraron un efecto inhibidor de crecimiento de acción en hipocótilo, se debe a la presencia de compuestos con acción pesticida y se evidencia un efecto promotor en epicótilo, esto sugiere que los compuestos presentes en H. trachyphylla, son potenciales de crecimiento, y sus productos de degradación actúan como fitohormonas... Indicios de actividad alelopática de Miconia coronata (BONPL.) DC Evaluaciones de actividad alelopática del extracto en acetato de etilo de M. coronata sobre semillas de tomate río grande, exhibió mayor inhibición al segundo día (-,%), esto muestra la influencia de compuestos de carácter herbicida. Para el epicótilo muestra mayor actividad inhibitoria, esto presenta su máximo de inhibición al segundo día (-,%). Mientras para las fracciones de M. coronata presenta mayor inhibición sobre hipocótilo, sugiriendo compuestos de degradación como los responsables de dicha actividad. La actividad sobre epicótilo mostró un valor mínimo a -%, sugiriendo que estas fracciones ejercen efecto inhibidor... Especies receptoras Para la escogencia de la especie receptora en la evaluación de la actividad alelopática, se debe tener en cuenta dos aspectos importantes: Generación del valor más alto de dos parámetros de crecimiento. Los cuales son la longitud del hipocótilo y epicótilo. El menor coeficiente de variación en el crecimiento, al evaluar la longitud del hipocótilo y epicótilo Según estudios realizados teniendo en cuenta el menor coeficiente de variación y los mejores valores de los parámetros de crecimiento, se propone la siguiente jerarquía: Lechuga (L. sativa L.), cebolla (Allium cepa L.), mastuerzo (Tropaeolum majus L.), tomate (Lycopersicon esculentum Mill.), cebada (Hordeum. vulgare L.), zanahoria (Daucus carota L.), trigo (Triticum aestivum L.) y por último maíz (Zea mays L.)... Aleloquímicos Los aleloquimicos son en gran parte clasificados como metabolitos secundarios de las plantas, que juegan un papel importante en interacciones o defensas en las plantas y en mecanismos ecológicos. Los aleloquímicos están presentes prácticamente en todos los tejidos vegetales, incluyendo hojas, flores, frutos, tallos, raíces, rizomas, las semilla y el polen. Pueden ser liberados de las plantas al medio ambiente a través de volatilización,

31 lixiviación, exudación de las raíces, y la descomposición de residuos vegetales. La producción de aleloquímicos en plantas vivas se ve afectada por: factores abióticos, como alta temperatura, modificación en la calidad de luz, características del suelo (ph, estructura, estado de los nutrientes, textura, presencia de contaminantes), la altitud y latitud, factores bióticos, como agentes patógenos, plagas, parásitos o herbívoros. Sin embargo, los efectos de las interacciones planta-planta son menos conocidos,. Con los años se ha demostrado que plantas producen sustancias con propiedades químicas alelopáticas que afectan a algunas especies de plantas. Estas sustancias se distribuyen en diferentes partes de la planta, durante su ciclo de vida. Cuando estas sustancias se liberan en cantidades suficientes, tienen efectos alelopáticos que se puede observar en la germinación, crecimiento y/o el desarrollo de la plantas. Los principales agentes alelopáticos son metabolitos secundarios de naturaleza química muy variada. A medida que avanza las investigaciones en el tema se incorporan nuevos grupos de sustancias a las cuales no se les atribuía esta actividad biológica. Se conocen alrededor de metabolitos secundarios con acción alelopática como esteroides, ácidos grasos de cadenas largas, lactonas, flavonoides, cumarinas, naftoquinonas, antraquinonas, fenoles simples, taninos, terpenoides, aminoácidos,.... Ácidos grasos Existen varios ácidos grasos tantos de plantas terrestres como acuáticas que son inhibitorios de crecimiento vegetal. Se puede citar entre otros el ácido linoléico, mirístico, palmítico, laúrico e hidroxiesteárico. Su rol en alelopatía no está completamente investigado.... Compuestos aromáticos Estos comprenden la más extensa cantidad de agentes alelopáticos. Incluye fenoles, derivados del ácido benzoico, derivado del ácido cinámico, quinonas, cumarinas, flavonoides y taninos... Aleloquímicos como herbicidas naturales Putnam (, ) denomina aleloquímicos como herbicidas naturales. La obtención de herbicidas y agroquímicos basados en fuentes naturales son atractivos por varias razones. Primero, la mayoría de ellos son solubles es agua, y como resultado, es posible que sean activos a muy bajas concentraciones, reduciendo su presencia en el ambiente. Los productos naturales tienen relativamente vida media corta. Algunos productos naturales son explotados comercialmente como herbicidas como tricentonas,.

32 ... Tricetonas Leptospermona (Fig. (a)), es el principal componente del aceite esencial de Leptospermun scoparium planta que se encuentra en Australia y Nueva Zelanda. Tricetonas, como Sulcoltriona (Fig. (b)) y Mesotriona (Fig. (c)), son herbicidas post-emergentes de hoja ancha que inhibe la p- hidroxifenilpiruvato dioxigenasa (HPPD) y la actividad herbicida de estos compuestos se correlaciona con la acidez. O O O O (a) O O O Cl O SOCH O O NO SOCH (c) (b) Figura. Estructura química de tricetonas. Biotransformación En los últimos años, la biotransformación se ha convertido en un método popular en la síntesis de compuestos orgánicos para la producción de compuestos enantiomericamente puros, tiene un gran potencial para generar nuevos productos o para desarrollar productos conocidos de manera más eficiente. La biotransformación se define como el proceso por el cual una sustancia química (sustrato) es modificada a otra por una reacción química por medio de células de plantas, animales, microorganismos o enzimas purificadas como catalizadores,. Los compuestos químicos que pueden sufrir biotransformaciones son de naturaleza muy variada, estos incluyen aromáticos, alcaloides, cumarinas, terpenoides y otras especies moleculares. La biocatálisis se está convirtiendo en un componte clave en la industria química, para la obtención de nuevos productos farmacéuticos, productos intermedios y reacciones para análisis. La mayoría de reacciones biocataliticas se pueden llevar en el marco de cierta seguridad, la salud, ambientales y condiciones económicos,.

33 .. Reacciones de biotransformación Estereoselectivo Hidroxilación Oxidación de Baeyer - Villiger Hongo Sulfoxidación Reducción Epoxidación Biotransformación Figura. Reacciones de biotransformación... Hidroxilación estereoselectiva El proceso de hidroxilación implica la oxidación directa de un enlace C-H para producir un alcohol, estas reacciones pueden tener lugar en diversos puntos de la molécula.... Sulfoxidación En los últimos años, los sulfóxidos quirales se han convertido en importantes bloques de construcción para la síntesis de productos farmacéuticos y compuestos biológicos activos.... Epoxidación Los epoxidos se forman durante la biotransformación de varios terpenoides, más de cepas de hongo han sido probados por su capacidad de biotransformar (R)-(+)- y (S)-(+)limoneno utilizando microextracción en fase sólida como la técnica de monitoreo. Especies de penicillium biotransformaron (R)-(+)-limoneno (Fig. (a)) en trans- y cis-óxido limoneno (Fig. (b) y (c)). O (a) (b) O (c) Figura. Biotransformación de (R)-(+)-limoneno por Penicillum... Oxidación de Baeyer Villiger La oxidación de Baeyer-Villiger de cetonas y cíclicos en sus correspondientes ésteres o lactonas, es una reacción importante en la química orgánica. En la actualidad, para

34 satisfacer la creciente demanda de moléculas biológicas activa quirales, se ha hecho necesario extender los métodos disponibles. Los microorganismos son capaces de llevar a cabo esta reacción con regio y alta enantioselectividad.... Reducción La biotransformación es un método conveniente para preparar alcoholes quirales, particularmente útiles como bloques de construcción para la síntesis de productos farmacéuticos y agroquímicos. El uso de células microbianas enteras es particularmente ventajoso para llevar a cabo la reducción de cetonas, varios hongos y levaduras se han utilizado para la estéreo- y enantioselectiva reducción de cetonas proquirales... Ventajas de la biotransformación Los procesos de biotransformación al ser comparados con los procedimientos químicos, presentan varias ventajas entre las que se destaca: El acortamiento de las vías de síntesis mediante reacción microbiana o mediante acoplamiento de varias reacciones enzimáticas. Preparación de compuestos puros, por la alta especificidad de reacción, regioselectividad y estereoselectividad. Preparación de compuestos ópticamente activos. Condiciones suaves de reacción. Procesos más económicos. Menos contaminantes al medio ambiente. Reducción de la formación de residuos químicos y el reciclaje de disolventes de extracción... Biotransformación por microorganismos Las transformaciones bioquímicas generalmente se realizan utilizando microorganismos, debido a que estos promueven la oxidación de componentes con alta estéreoespecificidad y estéreoselectividad, usualmente en condiciones muy suaves dando lugar a compuestos naturales en lugar de sinteticos. Las reacciones de biotransformación pueden ser llevadas a cabo por microorganismos o a través de reacciones enzimáticas. Hoy en día, los biocatalizadores se usan comúnmente en muchos procesos industriales. La razón principal es que los catalizadores químicos muestran varias desventajas, así como la producción de una amplia gama de subproductos y efluentes tóxicos. El uso de células o enzimas ha sustituido gradualmente muchos catalizadores químicos, debido a su gran selectividad para el sustrato. Además, son biodegradables y obran de acuerdo a las condiciones ambientalmente amigables.

35 Enzimas oxidativas como mono, di-oxigenasa o peroxidasas son muy interesantes a la hora de llevar a cabo reacciones de biotransformación, ya que son muy abundantes en la naturaleza y altamente regio- y estereoselectivas. El aislamiento y purificación de la enzima puede ser costoso y difícil. Las células enteras como biocatalizadores pueden ser más barato y más fácil de obtener que las enzimas aisladas. Las bacterias son conocidas por producir enzimas capaces de hidrolizar, además de la abundancia de estas, es bien sabido que las bacterias son agentes de degradación. Las células de los hongos se utilizan en la biotransformación, Aspergillus niger se utilizo en las reacción de hidroxilación con los terpenos, las esporas de hongos de Penicillium digitatum fueron capaces de biotransformar geraniol, nerol y citrol... Hongos Los microbiólogos emplean el termino hongo [del latín fungus, seta] para incluir organismos eucariotas, portadora de esporas con nutrición por absorción, carentes de clorofila, que se reproducen de forma asexual y sexual. Los hongos en general se ven como organismos destructivos que estropean los alimentos, producen los deterioros de las vigas de los edificios y ocasionan infecciones problemáticas. Sin embargo, aunque los hongos con frecuencia son indudablemente perjudiciales para la economía humana, sus actividades beneficiosas sobrepasan con mucho su impacto negativo. Las tecnologías tradicionales emplean el hongo para la producción de alimentos, aromas y para la producción de bioquímicos como el acido cítrico y antibióticos como la penicilina. Los hongos están considerados generalmente como quimioheterótrofos estrictos. Son incapaces de fotosintetizar y por consiguiente necesitan substratos ricos en energía para alcanzar su recubrimiento de energía y biomasa. Los hongos producen una amplia variedad de enzimas extracelulares principalmente oxidasa e hidrolasas. Los hongos generalmente crecen en el laboratorio sobre medio definido que contiene azucares, como glucosa y sacarosa, o sobre polímeros, como celulosa, también crecen en medio agar papa dextrosa y medios basados en vegetales. Otros nutrientes importantes requeridos por los hongos para el máximo rendimiento incluyen fósforo, azufre, potasio y magnesio. Las esporas de los hongos son generalmente consideradas como estructuras durmientes. Sin embargo, cada vez resulta más claro que muchas esporas contienen enzimas que permiten las esporas exhiban un amplio rango de actividades, muchas de las cuales pueden ser usas comercialmente. Por ejemplo las esporas pueden ser usadas para modificar químicamente esteroides, antibióticos y flavonoides. Es posible que puedan ser también utilizadas para transformar químicamente un rango más amplio de compuesto que incluyen hidrocarburos y alcaloides. Las esporas son útiles debido a que son generalmente estables, pueden ser transportadas y luego utilizadas como un conveniente catalizador biológico. También producen suspensiones homogéneas que dan conversiones reproducibles del substrato. Los

36 rendimientos son generalmente altos cuando se utilizan esporas y rara vez se forman productos indeseables. Otra ventaja del uso de este método es que el medio requerido es muy sencillo, consistiendo solamente en tampón con o sin glucosa añadido. Cualquier espora que no germine puede ser utilizada posteriormente. La adición de una fuente de nitrógeno es innecesaria y en cualquier caso solo ayudaría a la contaminación por bacteria. Los hongos producen un amplio conjunto de enzimas que cubren la gama completa de capacidades catalíticas (tabla ). Sin embargo solo un número relativo de estas enzimas se producen a escala industrial. Tabla. Algunas enzimas de hongos Enzima α-amilasa Amiloglucosidasa Proteasa acida Celulasa Invertasa Pectinasa Catalasa Renina Glucosa isomerasa Lipasa Lactasa Fuente Aspergillus oryzae Aspergillus niger Aspergillus awamori Aspergillus niger Aspergillus saitoi Aspergillus oryzae Trichoderma viride Aspergillus niger Levadura spp. Aspergillus oryzae Saccharomyces cerevisiae Aspergillus niger Aspergillus wentii Rhizopus sp Aspergillus niger Mucor spp. Mucor spp. Mucor spp. Penicillium roqueforti Rhizopus delmar Saccharomyces lactis Aspergillus oryzae Fuente: introducción a la biotecnología de los hongos... Hongos del género Aspergillus spp. El Aspergillus (Fig. ) es un grupo de hongos filamentosos, que abarcan mas millones de años de evolución, existen unas doscientas especies de este género, encontradas a través de todo el mundo. Los Aspergillus son miembros ubicuos de la micoflora del aire y por ello

37 se encuentra frecuentemente como contaminante de los medios de cultivo. Muchos Aspergillus contaminan los alimentos produciendo tóxicos. Varias especies crecen también como contaminantes del cuero y la ropa. Las especies Aspergillus son importantes en medicina causando enfermedades de los órganos internos denominadas colectivamente aspergilosis. Aspergillus fumigatus es el responsable de casi todas las infecciones, aunque A. terreus, A. flavus y A. niger también han sido implicados A. flavus infecta los pulmones y producen síntomas no muy diferentes a los de la tuberculosis. Las especies de Aspergillus producen numerosas enzimas exocelulares muchas de las cuales se usan en biotecnología,. Figura. Aspergillus spp Fuente: Barnett y Hunter,.. Biotransformación de terpenos Una amplia investigación se ha dedicado a la producción biotecnológica de sabores y fragancias. La biotransformación de terpenos, permite la producción de sabores puros y fragancias en condiciones suaves de reacción. Los productos fabricados por los procesos de biotransformación pueden ser como natural. En biotransformación de terpenos y terpenoides se han empleado con frecuencia células de hongos y bacterias (tabla ). Las bioconversiones mas efectivas para monoterpenos se han realizados con hongos de los géneros Aspergillus y Penicillum, ya que su característica los hace catalizadores difícilmente superables gracias a su resistencia ambiental y química, abundancia, y poder transformar de sustratos difíciles, con alta selectividad. Tabla. Ejemplos de biotransformación de terpenos utilizando hongos o bacterias Microorganismo Aspergillus niger Escherichia coli Rhodococcus opacus Pseudomonas rhodeseae Artemisia annnua Resultado -β-hidroxi derivados de confirtifolina (-)-carvonea (-)-limoneno trans-carveol y carvona desde limoneno Isonovalal desde oxido de α-pineno Varios terpenoides

38 Penicillium caseifulvum Pseudomonas putida Limoneno, β-cariofileno y otros terpenoides Oxido de α-pineno desde α-pineno.. Terpenos Los terpenos son un gran grupo de productos naturales, que se presenta principalmente en las plantas en forma de metabolitos secundarios. Ofrecen una gran variedad de aromas agradable, más de diferentes compuestos han sido aislados y contiene uno o más unidades de isopreno (fig. ),. Figura. Estructura química de isopreno... Monoterpenos En las últimas décadas, la atención se ha centrado en monoterpenos, en gran parte debido a su importancia en los estudios de variación genética y distinción geográfica, son ampliamente utilizados en la industria de aromatizantes, alimentos y perfumes, a través de las transformaciones que se convierten en sus más valiosos derivados oxigenados. Los monoterpenos comprende gran variedad de compuestos naturales, estudios recientes han demostrado que pueden ser utilizados en la industria farmacéutica como nuevos fármacos y es muy importante para llevar a cabo mas investigación sobre la farmacología de estas moléculas,,. Los monoterpenos forman una clase de compuestos naturales, deriva de dos unidades de isopreno, con esqueletos acíclicos, monocíclicos y bicíclicos de carbono. Estos compuestos representan el principal componente de los aceites esenciales y se producen en diferentes partes de varias plantas... Biotransformación de terpenos por Aspergillus niger En los años ochenta, una cepa de Aspergillus niger fue aislada de la tierra de un jardín, capaz de transformar citronelol, geraniol y linalol a sus respectivos derivados -hidroxi. Esta reacción se denomino ci-hidroxilación. La fermentación de acetato de citronelilo con A. niger resulta la formación de un metabolito principal de -hidrocucitronelol que representa aproximadamente % d los productos de transformación total, acompañada de % de citronelol. La fermentación de acetato de geranilo con A. niger dió geraniol y hidroxigeraniol.

39 La bioconversión de (R)-(-)-linalol con A. niger, produjo una mezcla de trans-óxido de linalol (furanoide) y trans-óxido de linalol (piranoide) (fig. ). HO O (R)-(-)-Linalol HO H A. niger HO HO O O Trans-óxido de L inalol (furanoide) E póxido de Linalol Trans-óxido de L inalol (piranoide) Figura. Biotransformación de (R)-(-)-limanolol por A. niger Biotransformación de limoneno por A. niger (fig. ), este hongo fue capaz de llevar a cabo tres tipo de reordenamiento oxigenativo. OH OH A. niger OH -terpineol Lim oneno cis-carveol Figura. Biotransformación de limoneno por A. niger α-pineno, el más abundante terpeno natural, industrialmente obtenido por destilación fraccionada de turpentina. Una de las recientes publicaciones, describe la biotransformación de α-pineno por A. niger (fig. ). OH -pineno O OH A. niger cis-verbenol O verbenona OH OH trans-sobrerol hidroxicarvotanacetona Figura. Bioconversión de α-pineno por A. niger β-pineno, se encuentra en muchos aceites esenciales, ópticamente activos y racémicos. Bhattacharyya y Ganpathy, indican que los hongos como un A. niger, actúan de forma diferente y más específicamente en los pinenos (fig.).

40 CHOH -pineno O OH A. niger mirtenol pinocarvona pinocarveol Figura. Bioconversión de β-pineno por A. niger β-ionona y sus derivados, están ampliamente distribuidos en la naturaleza y representan componentes importantes de muchos aceites esenciales, se ha reportado la hidroxilación de β-ionona por A. niger (Fig.). O O O HO A. niger (S)--hidroxi- -ionona -ionona OH (R)--hidroxi- -ionona Figura. Bioconversión de β-ionona por A. niger.. Carvona Carvona, se presenta como (+)-carvona, (-)-carvona o carvona racémica (Fig.), es un monoterpeno cetona, se encuentra como el principal componente activo de varios aceites esenciales, tal como hierbabuena (Menhta spicata L.), el eneldo (Anethum graveolens L.), alcaravea (Carum carvi L.) y el jengibre (Zingiber officinale). Se obtiene a través de destilación y se produce naturalmente los enantiómeros (+)- y (-)-carvona. El (R)-(-)carvona presenta similares o las mismas actividades biológicas de (S)-(+)-carvona. Por lo tanto, la actividad fisiológica de dos enantiómeros no siempre es completamente diferente. Ambos enantiómeros de carvona han sido ampliamente utilizadas como materias primas para la síntesis enantioselectiva de productos naturales. O O (+)-carvona (-)-carvona Figura. Estructura química de carvona

41 (S)-(+)- carvona, fue utilizada como sustrato para la bioconversión por cinco bacterias y un hongo (Fig. ). El sustrato fue reducido a ambas dihidrocarvonas y a neoisodihidrocarveol. La sensibilidad de los microorganismos a (S)-(+)-carvona y algunos de los productos impidió rendimientos superiores a.g/l. El hongo Trychoderma pseudokoningii, dio el mayor rendimiento de neo-isodihidrocarveol. O O (S)-(+)-carvona O OH dihidrocarvonas neo-isodihidrocarveol Figura. Bioconversión de carvona En el Cramarossa y sus colaboradores, realizaron la biotransformación de los dos enantiomeros de carvona (S)-(+)- y (R)-(-), por dos bacterias Pseudomonas putida (Fig. ) y Acinetobacter lwoffi (Fig. ), aislados de diferentes ambientes. Los resultados mostraron que estas bacterias son herramientas eficientes en la bioreducción diastereoselectiva de (+)y (-)-carvona. O (S)-(+)-carvona O P. putida A. lwoffy A. lwoffy O R,R-dihidrocarvonas Figura. Biotransformación de (S)-(+)-carvona por P. putida y A. lwoffi O (S)-(+)-carvona O P. putida A. lwoffy O R,S-dihidrocarvonas Figura. Biotransformación de (R)-(-)-carvona por P. putida y A. lwoffi

42 . SECCIÓN EXPERIMENTAL. Equipos Balanza analítica OHAUS Adventure. Rotavaporador Heidolph Laborota -control. Bomba de vacio Heidolph (Rotavac). Ultrasonido Fisher Scientific FSH. Cámara de revelado UV Camag. Balanza OHAUS model LS. Incubadora Velp scientific FOC i. Cámara de Neubauer Biotecna. Microscopio Leica DM. Espectrofotómetro UV-Vis Shimadzu UV- PharmaSpec. Cromatógrafo de gases acoplado a espectrómetro de masas GC/MS-QP Shimadzu equipado con un puerto de inyección Split, autoinyector AOC-i Shimadzu, software CG/MS solution Relase.SU, columna capilar Rtx-SilMS serial de m de largo,. mm de diámetro interno y un espesor de fase estacionaria de.μm, base de datos Wiley, edición,. Equipo de Resonancia Magnética Nuclear de MHz, marca BRUKER.. Materiales y reactivos Cajas de vidrio en forma rectangular de cm x cm, de cm x cm y de x cm. Cajas petri. Cromatoplacas de Sílica gel F y RP- F s marca Merck. Glifosato comercial ( g/l, Roundup Spectra), donado por el Laboratorio de Suelos de la Escuela de Química de la UTP. Dimetil sulfóxido grado analítico (Phyto Technology Laboratories). (R)-(-) carvone, % marca Aldrin Chem. Co. Agar papa-dextrosa (PDA) marca Merck. Medio de cultivo Rosa de bengala (Scharlau Chemie). Medio de cultivo Saboreaud (Merck). Caldo nutritivo (Merck). Solventes n-hexano, acetato de etilo y acetona grado analítico marca MERCK.

43 . Material vegetal y microorganismos.. Material vegetal Henriettella trachyphylla Triana y Miconia coronata (Bonpl.) DC, fueron aportadas por el Grupo Polifenoles,. Según reportes de este grupo, H. trachyphylla, fue colectada en la vereda Laguneta, vía Pereira Armenia (Colombia), e identificada por el Dr. Frank Almeda de la Academia de Ciencias de California, E.U.A. Las hojas de M. coronata fueron colectadas en la vereda la Banadera a orillas del rio Otún cerca de la ciudad de Pereira, Risaralda, Colombia, en junio del, el Dr. Carlos Parra de la Universidad Nacional de Colombia, identificó la planta.... Especie receptora Semillas de lechuga (Lactuca sativa L.) variedad Black Seed Simpson, compradas a Fercon Ltda... Microorganismos Para la biotransformación se empleó una cepa de Aspergillus spp., recuperado en una práctica de docencia del laboratorio de microbiología. El microorganismo fue purificado e identificado según la clave de Barnett y Hunter por el Especialista en Microbiología Industrial José Rafael Rodríguez, el de mayo de.. Obtención de extractos y fracciones.. Obtención del extracto en cloroformo de H. trachyphylla Triana El extracto en cloroformo de H. trachyphylla (Fig. ), fue obtenido a partir de las hojas secas y molidas en trabajos anteriores realizados por el Grupo Polifenoles. Material seco y molido H. trachyphylla ( g) Homogenizado en etanol Filtrar y concentrar Redisolver en EtOH-agua Ext. L-L CHCl Extracto acuoso Extracto en cloroformo (, g) Figura. Procedimiento de extracción de las hojas secas y molidas de H. trachyphylla

44 ... Fraccionamiento del extracto en cloroformo de H. trachyphylla Para el fraccionamiento del extracto en cloroformo de H. trachyphylla se utilizó una columna de vidrio empacada con sílica gel (.-. mm) como fase estacionaria ( cm de altura con diámetro interno:, cm), fase móvil con gradiente por etapas n-hexano, acetato de etilo y acetona (Fig. ). Se colectaron las fracciones en tubos de ensayo con un volumen de ml por fracción, las cuales se monitorearon por TLC en fase normal y se reveló con luz UV a longitudes de onda de nm y nm. Ext. en cloroformo de H. trachyphylla ( mg) CC-sigel n-hex-acoet (; ; ; ; %; acetona) HtCHF,mg F,mg F F F F F,mg,mg,mg,mg,mg F,mg F,mg F,mg Figura. Fraccionamiento realizado al extracto en cloroformo... Separación de las fracciones HtCHF, HtCHF y HtCHF sobre placa de TLC preparativa Según sus perfiles cromatográficos por TLC, fueron elegidas las fracciones HtCHF, HtCHF y HtCHF como promisorias para su posterior separaración por cromatoplaca preparativa en fase normal; utilizando placas de x cm. Una vez sembrada la muestra se eluyó con la mezcla de solventes n-hexano acetato de etilo (:) y se reveló con luz UV de onda corta y larga. De esta separación se obtuvieron fracciones a partir de HtCHF (FA hasta FE), fracciones a partir de HtCHF (FA hasta FD) y fracciones a partir de HtCHF (FA hasta FF). Las fracciones FB, FE, FA, FD, FC y FB fueron inyectadas en CG/EM en las siguientes condiciones: columna Rtx-SilMS, gas de arrastre Helio, modo Split, temperatura de inyección C, rampa de calentamiento ºC por min; ( ºC/min) hasta ºC; ºC/min hasta ºC.

45 ... Separación de la fracción HtCHF sobre Cartucho ODS En la separación de la fracción HtCHF se uso un cartucho de Octadecyl Functionalized sílica gel (ODS) como fase estacionaria (diámetro interno:, cm; altura, cm) y como fase móvil se uso isopropanol-agua (:). Del fraccionamiento de HtCHF se obtuvieron fracciones, las cuales fueron monitoreadas por TLC en fase reversa (RP- Fs MERCK). Por medio del seguimiento por TLC, se reunieron las fracciones que mostraron similitud según su perfil cromatográfico hasta obtener dos fracciones nombradas como HtCHFA y HtCHFB (Fig. ), las cuales se concentraron y determinaron sus masas. HtCHF (, mg) Cartucho ODS i-proh-ho (:) HtCHFA (, mg) HtCHFB (, mg) Figura. Diagrama de fraccionamiento realizado a la fracción HtCHF... Separación de la fracción HtCHFA sobre columna cromatográfica La fracción HtCHFA se separó en columna cromatográfica empacada con sílica gel (diámetro interno:, cm, altura: cm), eluyendo en gradiente por etapas n-hexanoacetato de etilo (:, :, :, :) (Fig. ). Obteniéndose fracciones de ml cada una, las cuales se monitorizaron por TLC. Las fracciones que presentaron similitud se unieron y como resultado se obtuvieron cuatro nuevas fracciones, nombradas como FA, FA, FA y FA. Finalmente, todas las fracciones obtenidas se concentraron en rotavapor hasta sequedad. A las fracciones FA y FA, se les tomó espectro de UV-vis (rango de - nm), Espectro de RMN H y fueron inyectadas en CG/EM.

46 HtCHFA (, mg) CC-sigel n-hex-acoet (; ; ; %) FA, mg FA, mg FA, mg FA, mg Figura. Separación de la fracción HtCHFA sobre columna cromatográfica.. Obtención del extracto en acetato de etilo de Miconia coronata La obtención del extracto en acetato de etilo de las hojas secas y molidas de M. coronata (Fig.), fue realizado en trabajos anteriores por el Grupo Polifenoles. Material seco y molido M. coronata (, g) Homogenizado en n-hexano, cloruro de metileno y acetona acuosa al % Filtrar y concentrar a presión reducida Homogenizado en n-hexano Homogenizado en Homogenizado en Cloruro de metileno acetona acuosa % Fraccionado con MeOH Fracción en n-hexano, g Separación L-L Fracción metanólica, g Fracción AcOEt, g Fracción n-buoh, g Fracción acuosa, g Figura. Procedimiento de extracción de las hojas secas y molidas M. coronata... Fraccionamiento del extracto en acetato de etilo de M. coronata El fraccionamiento del extracto en acetato de etilo de M. coronata (Fig. ) por cromatografía en columna empacada con DIAION HP-, fue realizado en el Grupo Polifenoles.

47 Extracto AcOEt Miconia coronata, g DIAION HP- Agua-MeOH (,,,, %) Acetona acuosa % y EtOH % Fr, g Fr, g Fr, g Fr, g Fr, g Fr, g Fr, g Fr, g Fr, g Figura. Fraccionamiento del extracto en acetato de etilo de M. coronata Para las fracciones Fr y Fr, se realizaron pruebas químicas de Shinoda, Zn/HCl y técnicas instrumentales de UV-vis, CG/EM con las siguientes condiciones: columna Rtx-SilMS, gas de arrastre Helio, modo Split, temperatura de inyección C, rampa de calentamiento ºC por min (durante min); ºC/min hasta ºC.. Bioensayo de actividad alelopática.. Pretratamiento del agua Se calienta L de agua potable hasta ebullición por minutos dejando enfriar hasta temperatura ambiente, con el objetivo de eliminar las trazas de cloro residual... Preparación de soluciones blanco y control Se utilizó como control glifosato comercial a una concentración de,x- M. Esta se preparó disolviendo, ml de glifosato comercial en, ml de agua pretratada. Como blanco se utilizó la mezcla de agua-dmso (.%), preparada adicionando, ml de DMSO, en ml de agua pretratada... Preparación de soluciones de prueba... Preparación de extractos Las soluciones se prepararon tomando mg del extracto disueltas en. ml de DMSO, posteriormente se completo a ml con agua pretratada, de esta forma se utilizo un mínimo de muestra a concentración de mg/ml.

48 ... Preparación de fracciones Las soluciones se prepararon tomando mg de fracción disueltos en. ml de DMSO, posteriormente se completo a ml con agua pretratada, de esta forma se utilizo un mínimo de fracción para obtener una concentración final de mg/ml. Para el ensayo alelopático se utilizaron las fracciones FA, FA, Fr, Fr, Fr y Fr... Etapas de la actividad alelopática El bioensayo de actividad alelopática se realizó teniendo en cuenta los siguientes pasos:... Lavado Las semillas se lavan con agua pretratada (Fig. a).... Germinación Las semillas lavadas son transferidas y distribuidas en cajas de petri sobre papel filtro y ml de agua pretratada para su germinación durante horas. Luego, se seleccionaron las semillas germinadas con radícula de mm de longitud, para ser evaluadas frente al blanco, control y muestra de prueba (Fig. b). LAVADO GERMINACIÓN Selección Radicula mm Lavado con agua pretratada a. TRATAMIENTO ml de agua x h c. b. Figura. Bioensayo de actividad alelopática... Tratamiento con soluciones de prueba, blanco y control Las semillas seleccionadas se colocaran sobre las cajas para la evaluación alelopática, haciendo tres hileras de semillas cada una, las cajas contienen en su interior papel de filtro cortando a la medida, de ml para blanco (Fig. a), ml de solución de extracto (Fig. c) y ml para el control (Fig. b). Para fracciones se utilizaron cajas con papel de filtro y semillas (Fig. d). Los ensayos son realizados por triplicado.

49 BLANCO Agua-DMSO,% a. CONTROL Glifosato.x- M EXTRACTO mg/ ml FRACCIÓN mg/ ml b. c. d. Figura. Tratamiento para blanco, control, extractos y fracciones.. Determinación de actividad alelopática Las semillas germinadas son transferidas en cajas para su evaluación (día uno) frente a la solución de prueba que es obtenida a partir de los extractos y sus respectivos fraccionamientos. Los parámetros de crecimiento (hipocótilo y epicótilo) son medidos a partir del segundo día hasta el séptimo día, los cuales son ingresados a una tabla de hoja electrónica (Microsoft Excel. Anexo) con los cuales se obtendrán los valores promedios y desviaciones estándar por día de medida... Análisis estadístico Los valores tomados en milímetros de las medidas de hipocótilo y epicótilo de las plántulas de lechuga por los siete días del ensayo son introducidos en una tabla de hoja electrónica Microsoft Office Excel, que se utilizó como herramienta para el análisis estadístico (Tabla ). De esta forma, se halló el promedio y desviación estándar para cada día. Tabla. Promedio y desviación estándar de las medidas diarias en mm Muestra: Ext. en acetato de etilo de M. coronata Plántula Réplica Réplica Réplica Promedio,,, Promedio Desv. Desv.,,,,, Los promedios diarios calculados en Excel para el blanco, el control y las concentraciones evaluadas fueron representados en un gráfico de dispersión, para determinar el efecto inhibitorio o estimulante de crecimiento de las concentraciones preparadas (Fig.).

50 Figura. Promedio de medidas diarias De la misma manera se graficó la velocidad de crecimiento por día de los extractos, blanco y control (Fig. ), de las plántulas para el hipócotilo y para el epicótilo. Figura. Velocidad de crecimiento por día de las plántulas de lechuga Para las fracciones, se tomas diez datos para las medidas de hipocótilo y epicótilo, representados en la siguiente tabla (tabla ). Tabla. Análisis de datos (medidas diarias en mm) Muestra: FA Plántula Réplica Promedio, Promedio Desv. Desv.,,,

51 Con los anteriores datos se realiza la grafica de crecimiento (Fig. ), tanto para el hipótilo como para el epicótilo. Figura. Promedio de medidas diarias Los datos obtenidos en las plántulas de lechuga son evaluados por medio de la prueba de Dixon que permite rechazar valores extremos anómalos, con una confiabilidad del %. Para calcular el valor de Dixon se utilizan las siguientes relaciones, en un tamaño de muestra de. Si xn es sospechoso: r = (xn-x - xn-) / (xn - x) () r = (x - x) / (xn- - x) () Si x es sospechosa: Si el valor de r calculado es mayor que el valor critico,, se concluye que es un valor atípico. Posteriormente, los valores de los promedios y desviaciones estándar para lo datos por día son introducidos en una tabla como lo muestra la tabla. Tabla. Análisis de datos (Promedio y desviación estándar) Blanco,,,, Control,,,, FA,,,,

52 ,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,, A partir de estos datos se calcula porcentaje de actividad alelopática (% A. A.), por medio de la ecuación () y se construye una tabla (Tabla ), donde el efecto inhibidor de crecimiento es dado en valores negativos, mientras el efecto promotor en valores positivos. %a. a.= ((valor muestra valor control) / (valor blanco valor control) x ) - () El - corresponde al porcentaje de inhibición del control (glifosato). Tabla. Análisis de datos (ecuación de inhibición) Fracción FA, -, -, -, -, -, -, Control Con estos datos, se construyó un gráfico de barras, en el que se mostró la acción potenciadora (porcentaje positivos) o inhibidora (porcentaje negativo) de cada muestra (Fig.). Figura. Diagrama de barras, porcentaje de actividad alelopática

53 . Evaluación de biotransformación.. Preparación de los medios de cultivo Se prepararon cuatro tipos de medios: Rosa de bengala, PDA, sabouraud, medio líquido nutritivo según las especificaciones de cada medio de cultivo (Anexo )... Observaciones del hongo... Observaciones microscópicas Se realizó un doblez de una tira de cinta de cm, con el lado adhesivo hacia fuera y se sostuvo con pinzas. El lado adhesivo se presionó firmemente contra la superficie de la colonia del hongo a estudiar. El micelio aéreo se une a la superficie adhesiva por lo cual es fácilmente separada de la colonia. La tira de cinta con micelio aéreo se colocó en una gota de azul de lactofenol con un portaobjetos y se cubrió con una laminilla, para luego ser observado en el microscopio a y X... Crecimiento del hongo Para el crecimiento de Aspergillus spp., se probaron tres medios sólidos, Rosa de bengala, PDA y Sabouraud. Se inoculó con micropipeta µl en cajas petri con ml de cada medio de siembra masiva, las cajas fueron selladas y mantenidas a temperatura ambiente en oscuridad. Luego de días se observó crecimiento y esporulación... Concentración de esporas La cuantificación de la concentración de esporas permite determinar el número de unidades infectivas por unidad de peso o volúmen existentes en una formulación y sirve de base para establecer la dosificación de un producto. Para la concentración de esporas se tomó una cepa de Aspergillus spp. de un cultivo de doce días y se remueve las esporas con ayuda de una asa adicionando ml de un de agente surfactante tween % previamente esterilizado a psi y ºC durante minutos, de esta forma quedó preparada la suspensión madre de la cual se tomó ml y se depositó en un tubo de ml de ADE, quedando una dilución -, se repite el procedimiento llevando ml de esta dilución (-) a un tubo con ml de ADE, es decir, - y así sucesivamente hasta obtener una dilución -, para estimar el número de esporas por mililitro de la suspensión (Fig. ), en la cámara de Neubauer.

54 ml ml ml A. spp. Solución madre Esporas de A. spp. ml de tween % ml de ADE ml Conteo de esporas Figura. Toma de submuestras a partir de la suspensión madre del Hongo Aspergillus spp... Procedimiento para el cultivo del hongo La inoculación se realizó en erlenmeyer de ml llenados con ml de medio líquido nutritivo, en todos los casos, se adicionaron ml de una suspensión de esporas de concentración - esporas/ml, el ensayo se realizó por cuadruplicado (Fig. ). Medio de cultivo + esporas/ml Blanco medio de cultivo solo Control medio de cultivo solo + Aspergillus spp. Figura. Cultivo de hongo Cada recipiente se cubrió con papel aluminio y se sometió a agitación orbital constante ( rpm) a ºC en una incubadora durante cuatro días (Fig. ). Figura. Almacenamiento del hongo Fuente: Autora

55 .. Procedimiento para biotransformación de (R)-(-)-carvona utilizando Aspergillus spp. A cada ensayo se le adicionó mg (R)-(-)-carvona en ml de metanol, pasados por filtro de nylon, µm para asegurar esterilidad, se selló inmediatamente el erlenmeyer y se sometió a agitación constante ( rpm) a ºC. A partir de este momento se monitoreó por TLC la conversión, extrayendo con acetato de etilo después de,,,,, horas y asi sucesivamente hasta el día quince. Adicionalmente, se realizó el blanco donde se adicionó, (R)-(-)-carvona en solución sin presencia de Aspergillus spp., bajo condiciones idénticas y una vez transcurridos quince días, se realizó la extracción... Procedimiento de extracción Los cultivos se filtraron y al filtrado se le realizó extracciones líquido-líquido con acetato de etilo veces del doble de proporción que el volumen del filtrado. La fase orgánica obtenida se recogió y se concentró hasta sequedad total en rotavapor (Fig. ).

56 m g (R )-(-)-c a rv o n a e n m L d e m e ta n o l m L d e A. s p p. - e s p / m L e n m L c u ltiv o liq u id o n u tr itiv o I n c u b a c ió n a ºC a r p m p o r d ía s S e p a r a c ió n líq - líq con A co E t F a s e o r g á n ic a F ase acuo sa C G /E M Figura. Proceso de biotransformación.. Identificación del posible producto biotransformado Los posibles productos formados fueron identificados por cromatografía de gases acoplado a espectrometría de masas CG/MS-QP, con las siguientes condiciones: columna RtxSilMS, gas de arrastre Helio, modo Split, temperatura de inyección C, rampa de calentamiento ºC por min (durante min); ºC/min hasta ºC.

57 . RESULTADOS Y DISCUSIÓN. Fraccionamiento del extracto en cloroformo de H. trachyphylla Triana El fraccionamiento cromatográfico del extracto en cloroformo de H. trachyphylla ( mg), por medio de columna cromatografica empacada con silica gel (.-. mm), permitió obtener fracciones de ml cada una; las cuales fueron monitoreadas según su perfil cromatográfico por TLC, uniendo las fracciones que mostraron similitud y concentrando al vacio a presión reducida en rotavapor a ºC como máximo hasta sequedad. Se lograron así obtener fracciones nombradas HtCHF hasta HtCHF. A las fracciones obtenidas se les realizó cromatografía en capa fina, utilizando como eluyente nhexano-acetato de etilo (:), para el revelado de la cromatoplaca se empleó lámpara UV... Porcentaje de rendimiento de las fracciones del extracto en cloroformo de H. trachyphylla Según la figura, la fracción HtCHF, obtuvo el porcentaje más alto de rendimiento en masa. Figura. Porcentaje de rendimiento de las fracciones obtenidas del extracto en cloroformo de H. trachyphylla Las fracciones HtCHF, HtCHF y HtCHF, presentaron bandas muy definidas las cuales eran fáciles de separar por medio de cromatografía en capa fina preparativa en fase normal, eluyendo con la mezcla n-hexano-acetato de etilo (:). Apartir de la fracción HtCHF se obtuvieron cinco nuevas fracciones, FA hasta FE. De la fracción HtCHF se logró obtener cuatro fracciones, FA hasta FD; y de la fracción HtCHF se consiguió obtener seis fracciones nombradas desde FA hasta FF. Por el alto porcentaje de rendimiento de la fracción HtCHF, se escogió para la siguiente etapa de separación.

58 . Separación de la fracción HtCHF sobre Cartucho ODS El fraccionamiento de, mg de HtCHF condujo a la obtención de fracciones ( ml cada fracción), se reunieron las fracciones desde hasta y de la fracción hasta la, ya que mostraron similitud según su perfil cromatográfico por TLC en fase reversa. Estas fracciones se concentraron en rotavaporador, logrando fracciones identificadas como HtCHFA y HtCHFB... Porcentaje de rendimiento de las fracciones HtCHF El fraccionamiento de HtCHF, presentó un rendimiento de,% (fig. ). Figura. Porcentaje de rendimiento de las fracciones de HtCHF. Separación de la fracción HtCHFA sobre columna cromatográfica El fraccionamiento en columna de, mg de la fracción HtCHFA, condujo a fracciones de ml cada una, las fracciones que presentaron similitud en TLC en fase normal se unieron y concentraron, logrando obtener cuatro fracciones, nombradas como FA hasta FA. A las fracciones obtenidas se les realizo TLC, utilizando como eluyente n-hexano-acetato de etilo (:), el revelado de la cromatoplaca se realizó empleando lámpara UV determinando los valores de Rf (Tabla ). Tabla. Valores de Rf de las fracciones de HtCHFA Fracción FA FA FA Rf,,,

59 FA,.. Porcentaje de rendimiento de la fracción HtCHFA La separación de la fracción HtCHFA, obtuvo % de rendimiento en masa (Fig. ). Figura. Porcentaje de rendimiento de las fracciones de HtCHFA De acuerdo a la Fig. los porcentajes en masa más altos corresponden a las fracciones FA (,%) y FA (%), se seleccionaron para la evaluación de la actividad alelopática y aproximación estructural por cromatografía de gases acoplada a espectrometría de masas (CG/EM), barrido espectral por UV-vis y resonancia magnética nuclear de proton RMN-H. El barrido espectral UV-vis no mostró picos significativos que ayuden a su identificación.. Extracto en cloroformo de H. trachyphylla.. Crecimiento de las plántulas de lechuga en presencia del extracto en cloroformo de H. trachyphylla El crecimiento de las plántulas de lechuga en presencia del extracto en cloroformo de H. trachyphylla para hipocótilo (Fig. a.), presento un leve efecto inhibidor de crecimiento con referencia al blanco. Para epicótilo (Fig. b.), el crecimiento del blanco y del extracto en cloroformo no presentaron diferencia importante en el bioensayo (Anexo ).

60 a. b. Figura. Medida de crecimiento del extracto en cloroformo de H. trachyphylla, sobre hipocótilo (a.) y epicótilo (b.) de las plántulas de lechuga.. Porcentaje de actividad alelopática del extracto en cloroformo de H. trachyphylla El extracto en cloroformo de las hojas de H. trachyphylla presentó un efecto inhibidor de crecimiento en el hipocótilo de plántula de lechuga a las h con -,%. Sin embargo, a las siguientes horas del bioensayo la acción inhibitoria disminuye (tabla, figura ). Tabla. Porcentaje de acción alelopática del extracto en cloroformo de H. trachyphylla sobre hipocótilo de plántula de lechuga Ext. en cloroformo de H. trachyphylla, -, -, -, -, -, Figura. Efecto del extracto en cloroformo de H. trachyphylla en el crecimiento de hipocótilo

61 La actividad alelopática del extracto en cloroformo de H. trachyphylla, en epicótilo de lechuga presentó una acción variable, al segundo día mostró un leve efecto promotor de crecimiento del,%. Sin embargo, este efecto cambia hacia un efecto inhibitorio los siguientes días del bioensayo, el sexto día se observó el máximo de inhibición (-,%), (tabla, figura ). Tabla. Porcentaje de acción alelopática del extracto en cloroformo de H. trachyphylla sobre epicótilo de plántula de lechuga Ext. en cloroformo de H. trachyphylla,, -, -, -, -, Figura. Efecto del extracto en cloroformo de H. trachyphylla en el crecimiento de epicótilo Las medidas diarias del blanco y extracto en cloroformo de H. trachyphylla, promedio y desviación estándar, figura de velocidad de crecimiento durante el bioensayo y prueba de Q de Dixon están referenciados en Anexo. A partir de la figura y se puede ver que la acción de los metabolitos secundarios que producen la alelopatía, tiene mayor efecto en inhibir el hipocótilo, lo que indica que las plántulas de lechuga son más sensibles en esta zona, al estar en contacto con el extracto en cloroformo de las hojas de H. trachyphylla. La actividad alelopática del extracto en H. trachyphylla tiene un efecto inhibidor de crecimiento en el hipocótilo de -, % y un leve efecto promotor de crecimiento del,%.

62 Este efecto puede ser debido a la gran cantida de metabolitos presentes, teniendo en cuenta el resultado mostrado se tomó el extracto para ser fraccionado.. Evaluación de las fracciones del extracto en cloroformo de H. trachyphylla.. Selección de fracciones La evaluación de actividad alelopática se realizó a las fracciones FA y FA del extracto en cloroformo de H. trachyphylla, debido a los porcentajes en masa más altos. Adicionalmente, se utilizó la técnica de cromatografía de gases acoplada a espectrometría de masas para tener posibles estructuras de los compuestos presentes en estas fracciones... Fracción FA... Crecimiento de las plántulas de lechuga en presencia de la fracción FA En el hipocótilo (Fig. a.) al tercer día en adelante mostró efecto inhibidor constante hasta el día siete del ensayo, mientras el blanco continua creciendo durante los siguientes días del bioensayo. Para el epicótilo (Fig. b.) el crecimiento de la fracción FA y el blanco son similares hasta el día quinto donde la fracción FA se mantiene constante hasta el final del ensayo (Anexo ). a. b. Figura. Medida de crecimiento de la fracción FA, sobre hipocótilo (a.) y epicótilo (b.) de las plántulas de lechuga... Porcentaje de actividad alelopática de fracción FA La actividad alelopática de la fracción FA del extracto en cloroformo de H. trachyphylla, presentó porcentaje inhibitorio de crecimiento de hipocótilo en la plántula de lechuga al segundo día (-,%), al siguiente día este efecto disminuye (-%), sin embargo, a partir del cuarto día se presento un aumento en el porcentaje de inhibición (,%) hasta el séptimo día (-,%) (Tabla, fig. ).

63 Tabla. Porcentaje de acción alelopática de FA sobre hipocótilo de plántula de lechuga. FA, -, -, -, -, -, -, Figura. Efecto de la fracción FA en el crecimiento de hipocótilo La actividad alelopática en epicótilo de la fracción FA, se evidenció un potente efecto inhibitorio al segundo día (-,%), que disminuye considerablemente a los siguientes días hasta el fin del bioensayo, lo que sugiere la presencia de un compuesto alelopático que se degrada al siguiente día (tabla, fig. ). Tabla. Porcentaje de acción alelopática de la fracción FA sobre epicótilo de plántula de lechuga FA, -, -, -, -, -, -,

64 Figura. Efecto de la fracción FA en el crecimiento de epicótilo Las medidas diarias del blanco y la fracción FA, promedio y desviación estándar, figura de velocidad de crecimiento durante el bioensayo y prueba de Q de Dixon están referenciados en Anexo. Según la figura y, la actividad alelopática de la fracción FA, presentó mayor efecto inhibidor en hipocótilo de la plántula de lechuga y una importante acción de inhibición en epicótilo al segundo día que disminuye con el tiempo.... Posibles compuestos presentes en la fracción FA En la tabla se puede observar el posible compuesto presente en la fracción FA, por medio de análisis de cromatografía de gases acoplada a espectrometría de masas y resonancia magnética nuclear de proton (RMN H), comparando con las bases datos WILEYN, National Institute of Standards and Technology (NIST), Spectral Database for Organic Compounds (SDBS). Tabla. Posible compuesto de la fracción FA Nombre Estructura Tiempo de retención (min) Iones espectro de masas (m/z). [M+], (), (), (), () Tetracosano En el espectro de RMN H (fig. ) ilustra señales hacia el campo alto en.,.,. y. ppm se debe a los protones de alcanos, la señal de CH no se desdobla y aparece como un singlete bien definido en δ., Los protones del CH aparece en δ..

65 Figura. Espectro de RMN H de la fracción FA.. Fracción FA... Crecimiento de las plántulas de lechuga en presencia de la fracción FA El crecimiento en hipocótilo (Fig. a.) de la fracción FA es muy lento después del segundo día, debido a que los metabolitos presentes en esta fracción empiezan a inhibir el crecimiento. El crecimiento en epicótilo (Fig. b.) de la fracción FA presentó un efecto inhibitorio en comparación con el blanco. (Anexo ). a. b. Figura. Medida de crecimiento de la fracción FA, sobre el hipocótilo (a.) y de epicótilo (b.) de las plántulas de lechuga... Porcentaje de actividad alelopática de fracción FA La actividad alelopática de la fracción FA del extracto de cloroformo H. trachyphylla, presentó un porcentaje inhibitorio mínimo (-,%) al tercer día y un máximo de -,% al séptimo día, durante el bioensayo. Este comportamiento sugiere que los compuestos

66 alelopáticos ejercen un efecto inhibitorio continuo (tabla, Fig. ). Tabla. Porcentaje de acción alelopática de la fracción FA sobre hipocótilo de plántula de lechuga FA, -, -, -, -, -, -, Figura. Efecto de la fracción FA en el crecimiento de hipocótilo La actividad alelopática en epicótilo, presento un efecto similar al de la fracción FA, sin embargo la acción inhibitoria es mayor, como mínimo de -,% para el quinto día y como máximo -,% para el tercer día (tabla fig. ). Tabla. Porcentaje de acción alelopática de la fracción FA sobre epicótilo de plántula de lechuga FA, -, -, -, -, -, -,

67 Figura. Efecto de la fracción FA en el crecimiento de epicótilo Las medidas diarias del blanco y fracción FA, promedio y desviación estándar, figura de velocidad de crecimiento durante el bioensayo y prueba de Q de Dixon están referenciados en Anexo. Desde las figuras y, se observan un importante efecto inhibidor tanto para hipocótilo como para epicótilo, lo que siguiere que los compuestos presentes en la fracción FA tienen acción herbicida.... Posibles compuestos presentes en la fracción FA En la tabla se puede observar el posible compuesto presente en la fracción FA, por medio de análisis de cromatografía de gases acoplada a espectrometría de masas y resonancia magnética nuclear de protón. El espectro de la fracción FA en la figura, muestra las señales de protones en. y. ppm se debe al grupo de alcanos, el desdoblamiento del triplete implica que el CH es adyacente al CH, por lo tanto nuestra molecula contiene CH y CH. Tabla. Posibles compuestos de la fracción FA Nombre Estructura Heptacosano Tiempo de retención (min) Iones espectro de masas (m/z). [M+], (), (), (), ()

68 Figura. Espectro de RMN H de la fracción FA. Extracto en acetato de etilo de M. coronata.. Crecimiento de las plántulas de lechuga en presencia del extracto en acetato de etilo de M. coronata En el hipocótilo (Fig. a.) y epicótilo (Fig. b.) de la plántula de lechuga en presencia del extracto en acetato de etilo de M. coronata, se observo que creció igual al blanco hasta el segundo día, a partir de este día, mostro un descenso en el crecimiento en el extracto (Anexo ). a. b. Figura. Medida de crecimiento del extracto en acetato de etilo de M. coronata, sobre hipocótilo (a.) y epicótilo (b.) de las plántulas de lechuga.. Porcentaje de actividad alelopática del extracto en acetato de etilo de M. coronata El extracto en acetato de etilo de M coronata inhibe el crecimiento del hipocótilo de las plántulas de lechuga, de acción continua durante los días del bioensayo, con un máximo de -,% para el día cuatro (Tabla, figura ).

69 Tabla. Porcentaje de acción alelopática del extracto en acetato de etilo de M. coronata sobre hipocótilo de plántula de lechuga Ext. acetato de etilo M. coronata, -, -, -, -, -, Figura. Efecto del extracto en acetato de etilo de M. coronata en el crecimiento de hipocótilo La actividad alelopática del extracto en acetato de etilo de M. coronata, presentó una leve estimulación de crecimiento en epicótilo de plántula de L. sativa, a las horas de,% no significativo, sin embargo este efecto es inverso al siguiente día promoviendo la actividad inhibitoria que aumenta a través del paso de tiempo, mayor efecto al día siete del bioensayo con un porcentaje de inhibición del -,%. Por lo que los productos de degradación tiene mayor efecto inhibitorio al a través del tiempo (tabla, figura ). Tabla. Porcentaje de acción alelopática del extracto en acetato de etilo de M. coronata sobre epicótilo de plántula de lechuga Ext. AcOEt M. coronata,, -, -, -, -,

70 Figura. Efecto del extracto en acetato de etilo de M. coronata en el crecimiento de epicótilo Las medidas diarias del blanco y extracto en acetato de etilo de M. coronata en el crecimiento de epicótilo, promedio y desviación estándar, figura de velocidad de crecimiento durante el bioensayo y prueba de Q de Dixon están referenciadas en Anexo. A partir de las figuras y se observó que el extracto en acetato de etilo de las hojas de M. coronata, posee compuestos que inhibe principalmente el crecimiento del hipocótilo de las plántulas de lechuga, lo que puede actuar como regulador de crecimiento.. Evaluación de las fracciones del extracto en acetato de etilo de M. coronata.. Selección de fracciones La evaluación de actividad alelopática se realizó a las fracciones Fr, Fr, Fr y Fr, del extracto en acetato de etilo de M. coronata, debido a que son las fracciones más promisorias para investigaciones farmacológicas, con los más altos rendimientos según reportes del Grupo Polifenoles []. Adicionalmente, se utilizó la técnica de cromatografía de gases acoplada a espectrometría de masas para tener las posibles estructuras de los compuestos presentes en las fracciones Fr y Fr... Fracción Fr... Crecimiento de las plántulas de lechuga en presencia de la fracción Fr El hipocótilo (Fig. a.) crece igual para la fracción Fr y para el blanco hasta el cuarto día desde este día el crecimiento de la fracción es menor comparado con el blanco. Para el epicótilo (Fig. b.) el crecimiento de la fracción Fr con el blanco presentaron poca diferencia (Anexo ).

71 a. b. Figura. Medida de crecimiento de la fracción Fr, sobre hipocótilo (a.) y epicótilo (b.) de las plántulas de lechuga... Porcentaje de actividad alelopática de fracción Fr La actividad alelopática de la fracción Fr de M. coronata, presentó porcentaje de inhibición del -,% después de dos días del bioensayo, pero disminuye al tercer y cuarto día, sin embargo al quinto día presento un aumento de -,% de la acción inhibitoria y se mantuvo constante, debido a que los compuestos alelopáticos que inicialmente inhibían el crecimiento de las plántulas de lechuga que son degradados, los compuestos de degradación presentan influencia inhibitoria a medida que transcurre el tiempo (Tabla, Fig. ). Tabla. Porcentaje de acción alelopática de la fracción Fr sobre hipocótilo de plántula de lechuga Fr, -, -, -, -, -, -,

72 Figura. Efecto de la fracción Fr en el crecimiento de hipocótilo La fracción Fr, presento descenso de inhibición del epicótilo en el periodo de evaluación como exhibiendo mínimo efecto inhibitorio al día quinto del -,% (tabla, fig. ). Tabla. Porcentaje de acción alelopática de la fracción Fr sobre epicótilo de plántula de lechuga. Fr,, -, -, -, -, -,

73 Figura. Efecto de la fracción Fr en el crecimiento de epicótilo Las medidas diarias del blanco y fracción Fr, promedio y desviación estándar, figura de velocidad de crecimiento durante el bioensayo y prueba de Q de Dixon están referenciados en Anexo. Según la figura y se observó que la fracción Fr tuvo efecto inhibitorio tanto para hipocótilo como para epicótilo de las plántulas de lechuga, lo que sugiere presencia de compuestos alelopáticos... Fracción Fr... Crecimiento de las plántulas de lechuga en presencia de la fracción Fr El crecimiento del hipocótilo (Fig. a.) para la fracción Fr, es muy importante porque inhibe desde el primer día el crecimiento de la plántula al sexto día presenta un crecimiento. Para epicótilo (Fig. b.) el crecimiento es lento y variable (Anexo ). a. b. Figura. Medida de crecimiento de la fracción Fr, sobre hipocótilo (a.) y epicótilo (b.) de las plántulas de lechuga

74 ... Porcentaje de actividad alelopática de fracción Fr La actividad alelopática se evidenció un potente efecto inhibitorio con un máximo al tercer día de -,% y un mínimo de,%, la acción inhibitoria de la fracción Fr muestra un efecto de acción constante a través del tiempo, lo que sugiere presencia de compuestos con propiedades de pesticidas (tabla, fig. ). Tabla. Porcentaje de acción alelopática de la fracción Fr sobre hipocótilo de plántula de lechuga Fr, -, -, -, -, -, -, Figura. Efecto de la fracción Fr en el crecimiento de hipocótilo La actividad alelopática en epicótilo presentan un efecto promotor de crecimiento del,% para el segundo día; sin embargo este efecto cambia hacia un efecto inhibitorio al siguiente día del ensayo de -,%, debido a que inicialmente los productos que potencializaban el crecimiento son degradados presentando un efecto inhibitorio que aumenta hasta el cuarto día y disminuye en los siguientes días del ensayo (tabla, fig. ).

75 Tabla. Porcentaje de acción alelopática de la fracción Fr sobre epicótilo de plántula de lechuga Fr,, -, -, -, -, -, Figura. Efecto de la fracción Fr en el crecimiento de epicótilo Las medidas diarias del blanco y fracción Fr, promedio y desviación estándar, figura de velocidad de crecimiento durante el bioensayo y prueba de Q de Dixon, están referenciados en Anexo. La acción alelopática de la fracción Fr tiene un fuerte efecto inhibitorio para el hipocótilo, en cambio para epicótilo tiene un efecto promotor para el segundo día que disminuye con el tiempo... Fracción Fr... Crecimiento de las plántulas de lechuga en presencia de la fracción Fr La fracción Fr en hipocótilo (Fig. a.) crece hasta después de horas, las siguientes horas se mantienen constantes, después de este tiempo el crecimiento se detiene y decrece. Para el epicótilo (Fig. b.) el crecimiento es variable, pero más lento que el blanco (Anexo ).

76 a. b. Figura. Medida de crecimiento de la fracción Fr, sobre hipocótilo (a.) y epicótilo (b.) de las plántulas de lechuga... Porcentaje de actividad alelopática de fracción Fr La acción alelopática para la fracción Fr, presento porcentaje de inhibición del -,% para el segundo día, sin embargo disminuye con el tiempo, manteniéndose constante el efecto inhibitorio (tabla, fig. ). Tabla. Porcentaje de acción alelopática de la fracción Fr sobre hipocótilo de plántula de lechuga Fr, -, -, -, -, -, -,

77 Figura. Efecto de la fracción Fr en el crecimiento de hipocótilo. La actividad alelopática en epicótilo presentó un efecto promotor de crecimiento al segundo día de l,%, sin embargo este efecto cambia al siguiente día del ensayo a -,%, lo que sugiere que el producto alelopático promotor de crecimiento se consume y entran hacer parte de otros compuestos con efecto inhibidor de crecimiento (tabla, fig.). Tabla. Porcentaje de acción alelopática de la fracción Fr sobre epicótilo de plántula de lechuga Fr,, -, -, -, -, -,

78 Figura. Efecto de la fracción Fr en el crecimiento de epicótilo Las medidas diarias del blanco y fracción Fr, promedio y desviación estándar, figura de velocidad de crecimiento durante el bioensayo y prueba de Q de Dixon, están referenciados en Anexo. Se observo en la figura y que la actividad alelopática de la fracción Fr presentó un efecto inhibidor para el hipocótilo, manteniéndose constante después del tercer día, para el epicótilo presento un efecto promotor de crecimiento para el segundo día.... Posibles compuestos presentes en la fracción Fr En la tabla se puede observar los posibles compuestos presentes en la fracción Fr, por medio de análisis de cromatografía de gases acoplada a espectrometría de masas, comparando con las bases datos. Antes de iniciar con el análisis de los los espectros de masas, se realizaron algunas pruebas de identificación de flavonoides que se pueden reconocer mediate diferentes ensayos de coloración como el ensayo de Shinoda y ensayo con Zn/HCl, en las dos pruebas resultó negativa lo cual indica que no hay presencia de flavonoides. También se realizó un barrido espectral (UV-vis) (Anexo ) en el que se determino la presencia del grupo fenilo en nm. Tabla. Posibles compuestos de la fracción Fr Nombre Estructura Eicosano Tiempo de retención (min) Iones espectro de masas (m/z). [M+], (), (), (), (), (), (), (), (), ()

79 OH Guaiacol. [M+], (), (), () OCH Heptadecano. Nonacosano. Tetratetracontano. [M+], (), (), (), (), (), (), (), (), () [M+], (), (), (), (), (), (), (), (), (), () [M+], (), (), (), (), (), (), (), (), (), () En la tabla demuestra los posibles fragmentos de guaiacol y en la figura se observa el posible mecanismo de fragmentación. Tabla. Posibles fragmentos del guaiacol Compuesto Relación (m/z) % de abundancia Fragmento OH O OH Guaiacol OH m/z = H OH O O H e- O O OH O H e- - CO -.CH m/z= m/z = OH OH -CH m/z = Figura. Posible mecanismo de fragmentación de guaiacol

80 .. Fracción Fr... Crecimiento de las plántulas de lechuga en presencia de la fracción Fr El crecimiento de la fracción Fr tanto para hipocótilo (Fig. a.) como para epicótilo (Fig. b.), fue lento y variable comparado con el blanco (Anexo ). a. b. Figura. Medida de crecimiento de la fracción Fr, sobre hipocótilo (a.) y epicótilo (b.) de las plántulas de lechuga... Porcentaje de actividad alelopática de fracción Fr La actividad alelopática de la fracción Fr, mostró un efecto inhibidor de crecimiento de acción continuada en hipocótilo, a partir del segundo día (-,%), (tabla, fig. ). Tabla. Porcentaje de acción alelopática de la fracción Fr sobre hipocótilo de plántula de lechuga Fr, -, -, -, -, -, -,

81 Figura. Efecto de la fracción Fr en el crecimiento de hipocótilo La fracción Fr presentó un efecto estimulante de crecimiento al segundo día del bioensayo del,%; sin embargo, este efecto promotor cambió al tercer día a menos,%, posteriormente esta actividad desciende hasta el último día del bioensayo del -,%, debido a que los compuestos de degradación presenta menor influencia inhibitoria a medida que transcurre los días de prueba (tabla, fig. ). Tabla. Porcentaje de acción alelopática de la fracción Fr sobre epicótilo de plántula de lechuga Fr,, -, -, -, -, -,

82 Figura. Efecto de la fracción Fr en el crecimiento de epicótilo Las medidas diarias del blanco y fracción Fr, promedio y desviación estándar, figura de velocidad de crecimiento durante el bioensayo y prueba de Q de Dixon están referenciados en Anexo. Según la figura y la fracción Fr mostró un potente efecto inhibidor en el hipocótilo mientras que para epicótilo presento un efecto promotor de crecimiento que cambia a efecto inhibidor en el transcurso del tiempo.... Posibles compuestos presentes en la fracción Fr En la tabla, se puede observar los posibles compuestos presentes en la fracción Fr, por medio de análisis de cromatografía de gases acoplada a espectrometría de masas, comparando con las bases datos. Antes de iniciar con el análisis de los los espectros de masas, se realizaron el ensayos de Shinoda y de Zn/HCl, en las dos pruebas resultó negativa lo cual indica que no hay presencia de flavonoides. También se realizó un barrido espectral (UV-vis) (Anexo ) en el que se determino la presencia del grupo fenilo en nm. Tabla. Posibles compuestos de la fracción Fr Nombre Estructura Tiempo de retención (min) Iones espectro de masas (m/z). [M+], (), (), (). [M+], (), (), (), (), () OH Guaiacol OCH Nonacosano

83 . Posibles estructuras de los compuestos presentes en las fracciones de H. trachyphylla Para las fracciones FB, FE, FA, FD, FC y FD, provenientes de las fracciones HtCHF, HtCHF y HtCHF, se les realizó cromatografía de gases acoplada a espectrometría de masas. De las fracciones FB y FE se observo por cromatografía de capa fina en fase normal un Rf de, con color azul fluorescente y Rf de con color café claro, respectivamente a longitud de onda larga. Por medio de CG/EM, se mostraron dos hicrocarburos saturados tetratriacontano y dotriacontano como posibles metabolitos secundarios presentes en FB. En FE se encontró heneicosano como posibles compuestos, por comparación con la librería WILEYN. A partir de la cromatografía preparativa sobre silica gel de la fracción HtCHF se obtuvieron cuatro fracciones nombradas FA hasta FD, La cromatografía en capa fina en fase normal de las cuatro fracciones, reveló que la fracción FA (Rf,) fluorece rosado y la fracción FD (Rf,) fluorece azul en longitud de onda larga ( nm), para identificar posibles compuesto se le realizó CG acoplada a EM a estas dos fracciones (Tabla ). Para el análisis de espectrometría de masas, se identificaron las estructuras por medio de comparación con las bases de datos WILEYN, NIST, SDBS, posibles mecanismos de fragmentación y reseñas bibliográficas,,,,. Tabla. Posibles compuestos de la fracciones FA y FD Fracción FA Nombre Estructura,,-trimetil-pentadecanona O Heneicosanoato de metilo O O Tiempo de retención (min) Iones espectro de masas (m/z). (), (), (), (), (). (), (). (), (). (), (). (), () OH Fitol Hexadecanoato de metilo O O FD Olean--en--ona O

84 Los fragmentos de,,-trimetil--pentadecanona, CHO (Tabla ) indican la presencia de una cetona en una solución saturada por tres grupos metilos, el posible mecanismo de fragmentación se muestran en la figura.,,-trimetil-pentadecanona, sufre la pérdida de un electrón pertenecientes a uno de los pares libres del átomo de oxígeno del grupo carbonilo,,,-trimetil--pentadecanona puede fragmentarse por vía McLafferty (Fig. a.) y fragmentación homolítica en alfa (Fig. b.). Este metabolito ha sido reportado en la familia melastomataceae en las especies de Aciotis purpurascens, Bellucia grossularioides, Miconia aeruginosa. Tabla. Posibles fragmentos de,,-trimetil--pentadecanona Compuesto % de abundancia Relación (m/z),,,,,-trimetil-pentadecanona Fragmento O OH O O O m/z CH e- O O O e- m/z = m/z e- O CH OH H O e- m/z = (a.) m/z CH e- O O O e(b.) m/z = Figura. Posible fragmentación de,, -trimetil--pentadecanona (a.) vía McLafferty, (b.) Fragmentación homolítica Fitol, es un alcohol graso de cadena ramificada se encuentra en abundancia en la naturaleza como parte de la molécula de clorofila. El pico base del espectro es, que se debe a la fragmentación homolítica, como lo muestra el posible mecanismos en la figura.

85 m/z OH OH - e CH m/z OH e- m/z m/z CH m/z OH e- OH OH - e m/z Figura. Posible fragmentación de fitol El triterpeno olean--en--ona se ha islado de Diospyros morrisiana, el extracto en hexano de Adiantum capillus-veneris L. (Adiantaceae) colectada en China y un extracto de la parte aérea de la planta Salvia palaefolia H.B.K. (Labiatae),,. En la tabla y la figura, se demuestran los posibles fragmentos del compuesto olean-en--ona y el posible mecanismo de fragmentación respectivamente. Tabla. Posibles fragmentos de olean--en--ona Compuesto Relación (m/z) % de abundancia Fragmento, O olean--en--ona m/z e- O m/z O e- m/z O O

86 m/z e- Retro Diel-Alder e- O O O m/z Figura. Posible fragmentación de olean--en--ona A partir de la cromatografía preparativa sobre silica gel de la fracción HtCHF se obtuvieron seis fracciones nombradas desde FA hasta FF, La cromatografía en capa fina en fase normal de las seis fracciones, reveló que la fracción FB es azul fluorescente (Rf =.) y la fracción FC de color amarillo (Rf =.), para identificar posibles compuestos se le realizo CG/EM a estas fracciones (tabla ). Tabla. Posibles compuestos de la fracciones FC y FD Fracción Nombre Estructura Tiempo de retención (min) FC tetratetracontano. FD Hexacosano. Iones espectro de masas (m/z) (), (), (), (), () [M+], (), (), (), (). El espectro de RMN H la fracción FC, muestra la absorción de protones en.,. ppm se debe al grupo de alcanos. Para el espectro de RMN H la fracción FD, presentó señales en.,. y., lo que se debe a la presencia de un alcano.

87 . Biotransformación.. Observación del hongo Observaciones macroscópicas (Fig. ): Colonias en PDA a C de color blanco que cambia con el tiempo cambia a negro, colonia densa y textura granular. (a.) (b.) Figura. Aspergillus spp., en medio PDA (a.) en días, (b.) en días Fuente: Autora Observaciones microscópicas (Fig. y ): Conidióforo que soporta la cabeza conidal, la cabeza conidial está formada por vesícula, fialides, y conidias. Figura. Aspergillus spp., microscópicamente X Fuente: Esp. José Rafael Rodríguez Nuñez.

88 Figura. Aspergillus spp., microscópicamente X Fuente: Esp. José Rafael Rodríguez Nuñez... Crecimiento del hongo Asperguillus spp. Presento mayor biomasa y mejores esporulación en medio PDA, por tanto este medio fue seleccionado para el crecimiento en la Figura, se observa el crecimiento entre los medios rosa de bengala, PDA, y sabouraud. (a.) (b.) (c.) Figura. Crecimiento de Aspergillus spp., en medios: (a.) Rosa de bengala, (b.) PDA y (c.) Sabouraud Fuente: Autora.. Conservación del hongo Aspergillus spp. El hongo Asperguillus spp, se conservó haciendo repliques en medio de cultivo PDA, después de sembrar la cepa se dejo durante doce días a temperatura ambiente en ausencia de luz, cumplidos estos días se observó esporulación del hongo, llegado este momento se procedió a encubar en el refrigerador.

89 .. Recuento de esporas en cámara de Neubauer El recuento se determina sumando el total de esporas presente en los cuadrantes centrales de la cámara. A la dilución - se le realiza tres veces este procedimiento para un total de seis lecturas. La concentración (C) de esporas de calcula multiplicando el promedio del número de esporas (N) obtenidos por el inverso de la dilución - y por el inverso del factor de la cámara. En la tabla se observa la concentración de las esporas/ml según la ecuación (), de los cuatro ensayos realizados para la biotransformación. C=N x Dilución empleada x factor de cámara () Tabla. Concentración de esporas en diferentes ensayos Ensayo Concentración (esporas/ml) x x x x.. Biotransformación de (R)-(-) carvona utilizando Aspergillus spp. La biotransformación se realizó en cuatro erlenmeyer de ml de capacidad, cada uno de los cuales contenía ml del medio de cultivo líquido. El proceso de biotransformación de (R)-(-)-carvona, se mantuvo durante días a ºC bajo a agitación constante y protegido de la luz. El seguimiento de la reacción de biotransformación se realizó por cromatografía en capa fina, utilizando como eluente n-hexano-acetato de etilo (:). En la figura, se observa en la cromatoplaca como una mancha verde el sustrato (R)-(-)carvona a una longitud de onda de nm, Rf de.. Después de horas empezó a disminuir la intensidad de la mancha del sustrato en la placa cromatográfica. Este seguimiento se llevó a cabo hasta el último día del ensayo (día ), cada horas. Figura. Placa cromatográfica del material de patida (R)-(-)-carvona Cumplidos los días del ensayo, se realizó la extracción líquido-líquido con acetato de

90 etilo grado analítico, en el extracto obtenido se observó en TLC a longitud de onda de nm, manchas como lo muestra la figura, la primera mancha se encuentra en el punto de siembra, posiblemente se trate de los metabolitos del hongo o del medio de cultivo, la segunda mancha con Rf de. puede ser el compuesto biotransformado y la tercera mancha con Rf de. es el sustrato. Figura. Placa cromatográfica del extracto obtenido de la biotransformación de (R)-(-)-carvona.. Identificación del posible producto biotransformado El producto de la transformación del (R)-(-)-carvona por la cepa de Asperguillus spp, se identificó la posible estructura por medio de CG/EM (Fig. ). Figura. Cromatograma del producto obtenido de biotransformación de (R)-(-)-carvona... Posible compuesto obtenido en la biotransformación de (R)-(-)-carvona El espectro de masas (Fig. ) del tiempo de retención de, min se identificó posiblemente como carveol CHO () por análisis de espectros de masas, por comparación de éstos con la librería WILEYN.

91 OH () Figura. Espectro de masas del posible producto obtenido en la biotransformación de (R)-(-)carvona En la tabla y figura se demuestra los posibles fragmentos de trans-carveol y el mecanismo de fragmentación respectivamente. Tabla. Posibles fragmentos de trans-carveol Compuesto Relación (m/z) % de abundancia,,, Fragmento trans-carveol OH OH,

92 , OH m/z= OH OH OH e- OH e- m/z= m/z= m/z= OH OH e- OH e- m/z= m/z= Figura. Posible fragmentación de trans-carveol El Aspergillus spp., fue capaz de reducir el grupo carbonilo que se encuentra en (R)-(-)carvona, sin reducir los dobles enlaces carbono-carbono (Fig. ) para producir transcarveol, lo que significa que este hongo es regioselectivo. OH O Aspergillus spp. Figura. Biotransformación de (R)-(-)-carvona por Aspergillus spp.

93 . CONCLUSIONES Las fracciones del extracto en cloroformo de Henriettella trachyphylla, posiblemente se encuentran presentes compuestos como:,,-trimetil-pentadecanona, heneicosanoato de metilo, fitol, hexadecanoato de metilo, olean-en--ona, tetratetracontano, hexacosano, tetracontano y heptacosano. Los metabolitos secundarios que presentan actividad alelopática, tiene mayor efecto en inhibir el hipocótilo, lo que indica que las plántulas de lechuga son más sensibles en esta zona, al estar en contacto con el extracto en cloroformo de las hojas de H. trachyphylla. La fracción FA a partir de H. trachyphylla, presentó mayor efecto inhibidor en hipocótilo de la plántula de lechuga y una importante acción de inhibición en epicótilo al segundo día que disminuye con el tiempo. La fracción FA a partir de H. trachyphylla, mostró un efecto inhibidor tanto para hipocótilo como para epicótilo, lo que siguiere que los compuestos presentes en esta fracción tienen acción herbicida. El extracto en acetato de etilo de M. coronata, posee compuestos que inhibe principalmente el crecimiento del hipocótilo de las plántulas de lechuga, lo que puede actuar como regulador de crecimiento. Las fracciones Fr, Fr, Fr y Fr a partir de Miconia coronata, tuvieron efecto inhibitorio tanto para hipocótilo como para epicótilo de las plántulas de lechuga. A partir a (R)-(-)-carvona se puede producir trans-carveol utilizando como biocatalizador Aspergillus spp.

94 RECOMENDACIONES Purificar las fracciones Fr y Fr provenientes del extracto en acetato de etilo de Miconia coronata, para la elucidación de metabolitos presentes en estas fracciones. Evaluar la biotransformación de (R)-(-)-carvona, utilizando otras cepas de hongo y bacterias, como biocatalizador. Realizar el mecanismo de obtención de los productos biotransformados. Efectuar un ensayo alelopático del producto obtenido de biotransformación sobre plántulas de lechuga y de tomate.

95 BIBLIOGRAFÍA. International Allelopathy Society (IAS). Constitutions and Bylaws ; Sitio web: [Acceso octubre ]. Isaza J.H., Jiménez F.J., Galván L.J., Restrepo J.C. Actividad alelopática de algunas especies de los géneros Miconia, Tibouchina, Henriettella, Tococa, Aciotis, y Bellucia (Melastomataceae), Scientia et Technica. ; : p. -. Serpeloni J.M., Mazzaron G.R., Prates M., Yanagui K., Vilegas W., Aparecida E. Citotoxic and mutagenic evaluation of extracts from plant species of the Miconia genus and their influence on doxorubicin-induced mutagenicity: An in vitro analysis, Experimental Toxicology and Pathology, ; : p.-. Isaza J.H., Jiménez F.J., Veloza L.A., Ramírez L.S. Actividad alelopática de Henriettella trachyphylla (Melastomataceae), Actual Biol., ; (Suplemento ): p.-. Banerjee S., Singh S., Rahman L. Biotransformation studies using hairy root cultures A review, Biotechnol Adv.,. Carvalho C., Fonseca M.M. Biotransformation of terpenes, Biotechnology Advances, ; : p.-. Verstegen-Haaksma A.A., Swarts H.J., Jansen J.M., Groot A., Bottema-MacGillavry N., Witholt B. Application of S-(+)-carvone in the synthesis of biologically active natural products using chemical transformations and bioconversions, Industrial Crops and Products. ; : p.-. An M., Liu D.L., Johnson. I.R., Lovett J.V. Mathematical modeling of allelopathy: II. The dynamics of allelochemicals from living plants in the environment, Ecological Modelling. ; : p.-. D Abrosca B, DellaGreca M, Fiorentino A, Monaco P, Previtera L, Simonet AM, Zarelli A. Potencial Allelochemicals from Sambucus nigra, Phytochemistry. ; : p.. Calderon A.I., Terreaux C., Gupta M.P., Hostettmann K. Ocurrence of taxiphyllin and, -di-o-methylellagic acid -β-d-glucoside in Henriettella fascicularis, Biochemical Systematics and Ecology. ; : p.-. Isaza J.H., Jiménez F.J. Actividad alelopática del extracto de isopropanol-agua (:) de Henriettella trachyphylla (Melastomataceae). Tesis de pregrado, Universidad Tecnológica de Pereira, Pereira,

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101 ANEXOS ANEXO. Formato para la toma de datos entre los siete días de la actividad alelopática Lactuca Sativa L. Control Ensayo Fecha de inicio Martes de octubre de Semillas (mm) Caja Caja Caja Caja Caja Caja Caja Caja Caja Caja Caja Caja Caja Caja Caja Caja Caja Caja Caja Caja Caja (mm)

102 ANEXO. Medios de cultivos PDA (Agar de dextrosa y agua) USO: Para cultivo, recuento de hongos y levaduras en productos lácteos, bebidas embotelladas y alimentos. Como medio preparado para la cuenta de hongos y levaduras en líquidos. PRINCIPIO: La infusión de papa como fuente de almidones y la dextrosa con la base para el crecimiento de hongos y levaduras. El bajo ph (.) evita el crecimiento de bacterias. Cuando se va a usar para el recuento de hongos y levaduras, agregar al medio de cultivo una vez esterilizado y enfriado aproximadamente a C, ml de una solución estéril de ácido tartárico al % para obtener un ph aprximado de.. Sembrar el medio de cultivo por estría en la superficie o adicionar la muestra para la técnica de vacio en placa. Incubar hasta días a temperatura ambiente. FORMULA (gramos por litro de agua destilada): agar., dextrosa., infusión de papa., ph. +.. PREPARACIÓN: Rehidratar g del medio en un litro de agua destilada. Reposar a minutos. Calentar agitando frecuentemente hasta el punto de ebullición durante minuto para disolverlo por completo. Esterilizar en autoclave a C ( lbs de presión) durante minutos. Enfriar aproximadamente a C. Vaciar de acuerdo a la técnica a seguir en caja de petri estériles. Cuando se requiera el medio inclinado en tubo, distribuirlo antes de esterilizar. Si se acidifica el medio, no sobrecalentar y fundir solo una vez, para evitar la hidrólisis del agar. Agar dextrosa sabouraud USO: para cultivo y conservación de hongos patógenos y no patógenos, particularmente dermatofitos, levaduras y microorganismos acidúricos a partir de diversas muestras. PRINCIPIO: Las peptonas proporcionan factores de crecimiento y fuente de nitrógeno. La dextrosa en la fuente de energía para el crecimiento de microorganismos. El ph ácido de. favorece el crecimiento de hongos, especialmente dermatofitos y ayuda en la inhibición de flora contaminante. Cuando los materiales en estudio presentan abundantes cotaminantes, el aislamiento mejora si se adicona al medio de cultivo sustancias antimicrobianas selectivas, como lo reporta Georg y Col., que recomienda agregar asépticamente cicloheximida, penicilina y estreptomicina antes de usarlo, inhibiendo de esta forma la flora contaminante que interfiera en el cultivo de hongos. La adición de antibióticos de amplio espectro inhibe una amplia gama de bacterias Gram positivas y Gram negativas.

103 El medio de cultivo se siembra de acuerdo a las indicaciones con la muestra de ensayo. Los hongos desarrollados se examinan micro y macroscópicamente. FORMULA (gramos por litro de agua destilada): Agar., dextrosa., peptona especila., ph. +.. PREPARACIÓN: Rehidratar g del medio en un litro de agua destilada. Reposar a minutos. Calentar agitando frecuentemente hasta el punto de ebullición durante minuto para disolverlo por completo. Esterilizar en autoclave a C ( lbs de presión) durante minutos. Enfriar aproximadamente a C. Vaciar en cajas de petri estériles. Cuando se requiera el medio en tubo de ensayo, distribuir en el medio requerido antes de esterilizar y posteriormente enfriar en posición inclinada. Conservar en refrigeración de a C. Caldo nutritivo USO: Es un medio de cultivo univesal para microorganismos poco exigentes en cuanto a sus necesidades nutritivas con su fórmula original o adicionado de indicadores, carbohidratos, sales, líquidos, organicos, etc. PRINCIPIO: Los ingredientes que contiene la formula constituyen la fuente de nutrientes necesarios para el crecimiento de los microorganismos. El empleo de este medio de cultivo va a depender según los fines requeridos. FORMULA (gramos por litro de agua destilada): Extracto de carne., peptona de gelatina., ph. +.. PREPARACIÓN: Rehidratar g del medio en un litro de agua destilada. Reposar a minutos para disolución completa. Agitar y distribuir en tubos de ensayo. Esterilizar en autoclave a C ( lbs de presión) durante minutos. Conservar en refrigeración de a C.

104 ANEXO. Medidas diarias del extracto en cloroformo de Henriettella trachyphylla Triana Tabla de toma de datos del blanco Lactuca sativa L. Blanco Ensayo Fecha de inicio Martes o de octubre de Semillas (mm) Caja Caja Caja Caja Caja Caja Caja Caja Caja Caja Caja Caja Caja Caja Caja Caja Caja Caja (mm)

105 Tabla de toma de datos del extracto clorofórmico de Henriettella trachyphylla Lactuca sativa L. Extracto clorofórmico de Henriettella trachyphylla Ensayo Fecha de inicio Martes o de octubre de Semillas (mm) (mm) Caja Caja Caja Caja Caja Caja Caja Caja Caja Caja Caja Caja Caja Caja Caja Caja Caja Caja

106 Tabla de promedios y desviación estándar de datos del control, blanco y ext. Clorofórmico de H. trachyphylla Control Desv. Promedio.,,,,,,,,,,, Desv. Promedio,,,,,,,,,, Blanco Desv. Desv. Promedio Promedio.,,,,,,,,,,,,,,,,,,,, Ext. Clorofórmico de Henriettella Trachyphylla Promedio Desv.. Promedio Desv.,,,,,,,,,,,,,,,,,,,, Tabla de promedios y desviación estándar de la velocidad de crecimiento de control, blanco y ext. de H. trachyphylla Control Desv. Desv. Promedio Promedio.,,,,, Blanco Desv. Desv. Promedio Promedio.,,,,,,,,,,,,,,,,, Ext. Clorofórmico de Henriettella trachyphylla Promedio Desv.. Promedio Desv.,,,,,,,,,,,,,,,,,

107 Medida de crecimiento de hipocótilo y epicótilo Tabla Prueba Q de Dixon si Xn es sospechoso para control Ensayo (Xn-Xn-)/(Xn-X) Valor,,,,,,,,,,,, (Xn-Xn-)/(Xn-X) Valor Rechazado Rechazado Rechazado Rechazado Rechazado Rechazado

108 Tabla Prueba Q de Dixon si X es sospechoso para control Ensayo (X-X)/(Xn--X) Valor (X-X)/(Xn--X) Valor Tabla Prueba Q de Dixon si Xn es sospechoso para blanco Ensayo (Xn-Xn-)/(Xn-X) Valor,,,,,,,,,,,,, Rechazado, (Xn-Xn-)/(Xn-X), valor no sospechoso valor no sospechoso,,,,,,,,,,, Valor Rechazado Rechazado

109 Tabla Prueba Q de Dixon si X es sospechoso para blanco Ensayo (X-X)/(Xn--X),,,,,,,,,,,,,,, Valor Rechazado Rechazado (X-X)/(Xn--X) Valor, Rechazado valor no sospechoso valor no sospechoso,,,,,,,,,,,, Tabla Prueba Q de Dixon si Xn es sospechoso para ext. clorofórmico de H. trachyphylla Ensayo (Xn-Xn-)/(Xn-X), Valor (Xn-Xn-)/(Xn-X) Valor,,, Rechazado,,,,,, Rechazado,,,,,,,,,,,,, Rechazado,,,,,,,

110 Tabla Prueba Q de Dixon si X es sospechoso para ext. CHCl de H. trachyphylla Ensayo (X-X)/(Xn--X),,,,,,,,,,,,,,, Valor Rechazado (X-X)/(Xn--X),,,,,,,,,,,,,,, Valor Rechazado Rechazado Tabla de promedios y desviaciones estándar para hipocótilo Blanco,,,,,,,,,,, Control,,,,,,,,,,, Ext. CHCl H. trachyphylla,,,,,,,,,,, Tabla de promedios y desviaciones estándar para epicótilo Blanco,,,,,,,,,, Control,,,,,,,,,, Ext. CHCl H. trachyphylla,,,,,,,,,,

111 ANEXO. Medidas diarias de la fracción FA Tabla de toma de datos blanco Lactuca sativa L. Blanco Ensayo Fecha de inicio (mm) Martes de abril de Semillas (mm) Caja Caja Caja Caja Caja Caja Caja Martes de abril de Semillas (mm) Tabla de toma de datos FA Lactuca sativa L. Fracción FA Ensayo Fecha de inicio (mm) Caja Caja Caja Caja Caja Caja Caja

112 Tabla de promedios y Desv. de datos del control, blanco y fracción FA Control Desv. Desv. Promedio Promedio.,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,, Blanco Desv. Promedio.,,,,,,,,,,,,, Desv. Promedio,,,,,,,,,,,, FA Promedio Desv.. Promedio Desv.,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,, Tabla de promedios y desviación estándar de la velocidad de crecimiento de control, blanco y fracción FA Control Desv. Desv. Promedio Promedio.,,,,, Blanco Desv. Desv. Promedio Promedio.,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,, Fracción HtCHFA Promedio Desv.. Promedio Desv.,,,,,.,,,,,,,,,,,,,,,,,,,

113 Figura de velocidad de crecimiento en hipocótilo y epicótilo Tabla Prueba Q de Dixon si Xn es sospechoso para blanco Ensayo (Xn-Xn-)/(Xn-X),,,,,, Valor (Xn-Xn-)/(Xn-X),,,,,, Valor Tabla Prueba Q de Dixon si X es sospechoso para blanco Ensayo (X-X)/(Xn--X),,,,,, Valor (X-X)/(Xn--X),,,,,, Valor Tabla Prueba Q de Dixon si Xn es sospechoso para fracción FA Ensayo (Xn-Xn-)/(Xn-X),,,,,, Valor (Xn-Xn-)/(Xn-X),,,,,, Valor

114 Tabla Prueba Q de Dixon si X es sospechoso para fracción FA Ensayo (X-X)/(Xn--X),,,,,, Valor (X-X)/(Xn--X),,,,, Tabla de promedios y desviaciones estándar para hipocótilo Blanco Control Fracción FA,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,, Tabla de promedios y desviaciones estándar para epicótilo Blanco Control Fracción FA,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,, Valor Rechazado Rechazado Rechazado Rechazado,,,,,,,.,,,,,

115 ANEXO. Medidas diarias de la fracción FA Tabla de toma de datos blanco Lactuca sativa L. Blanco Ensayo Fecha de inicio (mm) Sábado de septiembre de Semillas (mm) Caja Caja Caja Caja Caja Caja Caja Sábado de septiembre Semillas (mm) Tabla de toma de datos FA Lactuca sativa L. Fracción FA Ensayo Fecha de inicio (mm) Caja Caja Caja Caja Caja Caja Caja

116 Tabla de promedios y Desv. de datos del control, blanco y fracción FA Control Desv. Desv. Promedio Promedio.,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,, Blanco Desv. Promedio.,,,,,,,,,,,,, Desv. Promedio,,,,,,,,,,,, FA Promedio Desv.. Promedio Desv.,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,, Tabla de promedios y Desv. de la velocidad de crecimiento de control, blanco y fracción FA Control Desv. Desv. Promedio Promedio.,,,,, Blanco Desv. Desv. Promedio Promedio.,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,, Fracción FA Promedio Desv.. Promedio Desv.,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,

117 Figura de velocidad de crecimiento en hipocótilo y epicótilo Tabla Prueba Q de Dixon si Xn es sospechoso para blanco Ensayo (Xn-Xn-)/(Xn-X),,,,,, Valor (Xn-Xn-)/(Xn-X),,,,,, Valor Rechazado Rechazado Tabla Prueba Q de Dixon si X es sospechoso para blanco Ensayo (X-X)/(Xn--X),,,,,, Valor (X-X)/(Xn--X),,,,,, Valor Rechazado Rechazado Rechazado Tabla Prueba Q de Dixon si Xn es sospechoso para fracción FA Ensayo (Xn-Xn-)/(Xn-X) Valor, Rechazado,,,,, (Xn-Xn-)/(Xn-X),,,,, Valor Rechazado

118 Tabla Prueba Q de Dixon si X es sospechoso para fracción FA Ensayo (X-X)/(Xn--X),,,,,, Valor (X-X)/(Xn--X),,,,, Valor Tabla de promedios y desviaciones estándar para hipocótilo Blanco,,,,,,,,,,,,, Control,,,,,,,,,,,,, Fracción FA,,,,,,,,,,,,, Tabla de promedios y desviaciones estándar para epicótilo Blanco,,,,,,,,,,,, Control,,,,,,,,,,,, Fracción FA,,,,,,,,,,,,

119 ANEXO. Medidas diarias del extracto en acetato de etilo de Miconia coronata Tabla de toma de datos de blanco Lactuca sativa L. Blanco Ensayo Fecha de inicio Jueves de agosto de Semillas (mm) Caja Caja Caja Caja Caja Caja Caja Caja Caja Caja Caja Caja Caja Caja Caja Caja Caja Caja (mm)

120 Tabla de toma de datos del extracto en acetato de etilo de Miconia coronata Lactuca sativa L. Extracto acetato de etilo de Miconia coronata Ensayo Fecha de inicio Jueves de agosto de Semillas (mm) (mm) Caja Caja Caja Caja Caja Caja Caja Caja Caja Caja Caja Caja Caja Caja Caja Caja Caja Caja

121 Tabla de promedios y Desv. de datos del control, blanco y ext. en AcOEt de M. coronata Control Desv. Desv. Promedio Promedio.,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,, Blanco Desv. Desv. Promedio Promedio.,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,, Ext. Acetato de etilo demiconia coronata Promedio Desv.. Promedio Desv.,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,, Tabla de promedios y Desv. de la velocidad de crecimiento de control, blanco y ext. en AcOEt de M. coronata Blanco Control Desv. Desv. Desv. Desv. Promedio Promedio Promedio Promedio..,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,, Ext. en AcOEt de Miconia coronata Promedio Desv.. Promedio Desv.,,,,,,,,,,,,,,,,,

122 Figura de velocidad de crecimiento en hipocótilo y epicótilo Tabla Prueba Q de Dixon si Xn es sospechoso para blanco Ensayo (Xn-Xn-)/(Xn-X) Valor,,,,,,,,,,,,, Rechazado,, (Xn-Xn-)/(Xn-X),,,,,,,,,,,,,,, Valor Rechazado Rechazado Rechazado Rechazado Rechazado

123 Tabla Prueba Q de Dixon si X es sospechoso para blanco Ensayo (X-X)/(Xn--X) Valor,,,,,,,,,,,,, Rechazado, Rechazado, (X-X)/(Xn--X),,,,,,,,,,,,, Valor Rechazado Tabla Prueba Q de Dixon si Xn es sospechoso para ext. en AcOEt de Miconia coronata Ensayo (Xn-Xn-)/(Xn-X) Valor,, Rechazado,,,,,,,,,,,,, (Xn-Xn-)/(Xn-X),,,,,,,,,,,,,,, Valor Rechazado Rechazado Rechazado

124 Tabla Prueba Q de Dixon si X es sospechoso para ext. en AcOEt de Miconia coronata Ensayo (X-X)/(Xn--X) Valor,, Rechazado,,,,,,,,,,,,, (X-X)/(Xn--X),,,,,,,,,,,,,,, Valor Rechazado Rechazado Rechazado Rechazado Rechazado Tabla de promedios y desviaciones estándar para hipocótilo Blanco,,,,,,,,,,, Control,,,,,,,,,,, Ext. EtOAc M. coronata,,,,,, Tabla de promedios y desviaciones estándar para epicótilo Blanco,,,,,,,,,, Control,,,,,,,,,, Extracto,,,,,,,,,,,,,,,,

125 ANEXO. Medidas diarias de la fracción Fr Tabla de toma de datos blanco Lactuca sativa L. Blanco Ensayo Fecha de inicio Sábado de agosto de Semillas (mm) (mm) Caja Caja Caja Caja Caja Caja Caja Sábado de agosto de Semillas (mm) Tabla de toma de datos Fr Lactuca sativa L. Fracción Fr Ensayo Fecha de inicio (mm) Caja Caja Caja Caja Caja Caja Caja

126 Tabla de promedios y desviación estándar de datos del control, blanco y fracción Fr Control Desv. Desv. Promedio Promedio.,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,, Fr Promedio Desv..,,,,,,,,,,,,, Blanco Desv. Desv. Promedio Promedio.,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,, Promedio Desv.,,,,,,,,,,,, Tabla de promedios y Desv. de la velocidad de crecimiento de control, blanco y fracción Fr Control Desv. Desv. Promedio Promedio.,,,,, Blanco Desv. Desv. Promedio Promedio.,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,, Fracción Fr Promedio Desv.. Promedio Desv.,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,

127 Figura de velocidad de crecimiento en hipocótilo y epicótilo Tabla Prueba Q de Dixon si Xn es sospechoso para blanco Ensayo (Xn-Xn-)/(Xn-X),,,,,, Valor (Xn-Xn-)/(Xn-X),,,,,, Valor Tabla Prueba Q de Dixon si X es sospechoso para blanco Ensayo (X-X)/(Xn--X),,,,,, Valor (X-X)/(Xn--X),,,,,, Valor Tabla Prueba Q de Dixon si Xn es sospechoso para fracción Fr Ensayo (Xn-Xn-)/(Xn-X),,,,,, Valor Rechazado (Xn-Xn-)/(Xn-X),,,,, Valor

128 Tabla Prueba Q de Dixon si X es sospechoso para fracción Fr Ensayo (X-X)/(Xn--X),,,,,, Valor (X-X)/(Xn--X),,,,, Valor Rechazado Tabla de promedios y desviaciones estándar para hipocótilo Blanco,,,,,,,,,,,,, Control,,,,,,,,,,,,, Fracción Fr,,,,,,,.,,,,, Tabla de promedios y desviaciones estándar para epicótilo Blanco,,,,,,,,,,,, Control,,,,,,,,,,,, Fracción Fr,,,,,,,,,,,,

129 ANEXO. Medidas diarias de la fracción Fr Tabla de toma de datos blanco Lactuca sativa L. Blanco Ensayo Fecha de inicio (mm) Sábado de agosto de Semillas (mm) Caja Caja Caja Caja Caja Caja Caja Sábado de agosto de Semillas (mm) Tabla de toma de datos Fr Lactuca sativa L. Fracción Fr Ensayo Fecha de inicio (mm) Caja Caja Caja Caja Caja Caja Caja

130 Tabla de promedios y desviación estándar de datos del control, blanco y fracción Fr Control Desv. Desv. Promedio Promedio.,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,, Fr Promedio Desv..,,,,,,,,,,,,, Blanco Desv. Desv. Promedio Promedio.,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,, Promedio Desv.,,,,,,,,,,,, Tabla de promedios y Desv. de la velocidad de crecimiento de control, blanco y fracción Fr Control Desv. Desv. Promedio Promedio.,,,,, Blanco Desv. Desv. Promedio Promedio.,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,, Fracción Fr Promedio Desv.. Promedio Desv.,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,

131 Figura de velocidad de crecimiento en hipocótilo y epicótilo Tabla Prueba Q de Dixon si Xn es sospechoso para blanco Ensayo (Xn-Xn-)/(Xn-X),,,,,, Valor (Xn-Xn-)/(Xn-X),,,,,, Tabla Prueba Q de Dixon si X es sospechoso para blanco Ensayo (X-X)/(Xn--X) Valor (X-X)/(Xn--X),,,,,,,,,,,, Tabla Prueba Q de Dixon si Xn es sospechoso para fracción Fr Ensayo (Xn-Xn-)/(Xn-X) Valor (Xn-Xn-)/(Xn-X), Rechazado,,,,,,,,, Valor Valor Valor Rechazado

132 Tabla Prueba Q de Dixon si X es sospechoso para fracción Fr Ensayo (X-X)/(Xn--X),,,,, Valor Rechazado (X-X)/(Xn--X) Valor, Rechazado,,,, Tabla de promedios y desviaciones estándar para hipocótilo Blanco,,,,,,,,,,,,, Control,,,,,,,,,,,,, Fracción Fr,,,,,,,,,,,,, Tabla de promedios y desviaciones estándar para epicótilo Blanco,,,,,,,,,,,, Control,,,,,,,,,,,, Fracción Fr,,,,,,,,,,

133 ANEXO. Medidas diarias de la fracción Fr Tabla de toma de datos blanco Lactuca sativa L. Blanco Ensayo Fecha de inicio (mm) Sábado de agosto de Semillas (mm) Caja Caja Caja Caja Caja Caja Caja Tabla de toma de datos Fr Lactuca sativa L. Fracción Fr Ensayo Fecha de inicio (mm) Sábado de agosto de Semillas (mm) Caja Caja Caja Caja Caja Caja Caja

134 Tabla de promedios y desviación estándar de datos del control, blanco y fracción Fr Control Desv. Desv. Promedio Promedio.,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,, Fr Promedio Desv..,,,,,,,,,,,,, Blanco Desv. Desv. Promedio Promedio.,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,, Promedio Desv.,,,,,,,,,,,, Tabla de promedios y Desv. de la velocidad de crecimiento de control, blanco y fracción Fr Control Desv. Desv. Promedio Promedio.,,,,, Blanco Desv. Desv. Promedio Promedio.,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,, Fracción Fr Promedio Desv.. Promedio Desv.,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,

135 igura de velocidad de crecimiento en hipocótilo y epicótilo Tabla Prueba Q de Dixon si Xn es sospechoso para blanco Ensayo (Xn-Xn-)/(Xn-X),,,,,, Valor (Xn-Xn-)/(Xn-X),,,,,, Valor Tabla Prueba Q de Dixon si X es sospechoso para blanco Ensayo (X-X)/(Xn--X),,,,,, Valor (X-X)/(Xn--X),,,,,, Valor Tabla Prueba Q de Dixon si Xn es sospechoso para fracción Fr Ensayo (Xn-Xn-)/(Xn-X),,,,,, Valor Rechazado (Xn-Xn-)/(Xn-X) Valor,, Rechazado,,,,

136 Tabla Prueba Q de Dixon si X es sospechoso para fracción Fr Ensayo (X-X)/(Xn--X),,,,,, Valor Rechazado (X-X)/(Xn--X),,,,,, Valor Rechazado Tabla de promedios y desviaciones estándar para hipocótilo Blanco,,,,,,,,,,,,, Control,,,,,,,,,,,,, Fracción Fr,,,,,,,,,,,,, Tabla de promedios y desviaciones estándar para epicótilo Blanco,,,,,,,,,,,, Control,,,,,,,,,,,, Fracción Fr,,,,,,,,,,,,

137 ANEXO. Espectros UV/vis de Fr y Fr Espectro UV/vis de Fr Espectro UV/VIS de Fr