Licenciatura en Biología. Identificación y Caracterización Inmunomolecular del Gen RON2 en Babesia bigemina. Tesis Individual

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1 UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE QUERÉTARO FACULTAD DE CIENCIAS NATURALES Licenciatura en Biología Identificación y Caracterización Inmunomolecular del Gen RON2 en Babesia bigemina Tesis Individual Que como parte de los requisitos para obtener el grado de Karina Acevedo Whitehouse Licenciado en Biología Presenta: DIANA ALEXANDRA CALVO OLVERA Dirigido por: Juan Joel Mosqueda Gualito SINODALES Presidente Firma Fausto Arellano Carbajal Secretario Firma Joel Quesada Mejorada Vocal Firma Gabriela Aguilar Tipacamú Suplente Firma Centro Universitario Querétaro, Qro 17 de septiembre de 2013 México 0

2 RESUMEN La Babesiosis bovina es una enfermedad infecciosa de importancia económica en la industria ganadera. Los principales agentes etiológicos de la enfermedad en México son Babesia bovis y B. bigemina. Actualmente no existe una vacuna segura para esta, por lo que se exploran estrategias para desarrollar una vacuna antigénica definida con inmunógenos protectores; para esto, es relevante el estudio de proteínas involucradas en el proceso de invasión. En parásitos Apicomplexos como Plasmodium spp., la invasión a las células hospederas se efectúa por un movimiento de unión entre el parásito y la superficie de la célula, donde la interacción entre AMA1 y RON2 es necesaria. La existencia de AMA1 de Babesia spp., ya ha sido reportada, sin embargo, se desconoce si RON2 está presente en protozoarios del género Babesia. Usando B. bigemina como modelo, el objetivo de este trabajo fue identificar y caracterizar el gen que codifica para la proteína RON2 y analizar su transcripción y expresión. La obtención de muestras se realizó inoculando a un bovino con sangre infectada con B. bigemina cepa Chiapas. Cuando la parasitemía alcanzó el 4% se colectó la sangre, la cual se utilizó para preparar frotis sanguíneos y para extraer DNA y RNA. Se realizó una búsqueda bioinformática de una secuencia homóloga del gen ron2, encontrándose una secuencia similar donde se amplificaron por PCR las primeras 913 pb. Se clonó este fragmento mediante transformación de células competentes de E. coli, se purificó el plásmido, se obtuvieron las secuencias y analizaron mediante el programa Bioedit para obtener la secuencia consenso. El análisis de la transcripción del gen se realizó por RT-PCR. La expresión de la proteína se analizó diseñando dos péptidos de la proteína que contenían epítopos B con los valores más altos de antigenicidad. Se inocularon dos conejos Nueva Zelanda en cuatro ocasiones con un intervalo de 15 días. Se extrajo el suero y se realizó la detección de RON2 por Inmunofluorescencia Indirecta. Se observó un patrón de tinción en la parte apical del parásito, confirmando la expresión del gen. Este es el primer reporte de la identificación y expresión de RON2 en B. bigemina. (Palabras clave: gen ron2, Babesia bigemina, babesiosis bovina 1

3 SUMMARY The bovine babesiosis is an infectious disease economically important in the livestock industry. The main etiologic agents of the disease in Mexico are Babesia bovis and B. bigemina. To date, there is not a safe vaccine for this disease, thus novel molecular strategies to develop a defined antigenic vaccine with protective immunogens are being explored; for this, the study of proteins involved in the invasion process is mandatory. In apicomplexan parasites like Plasmodium spp., invasion to host cells is carried out by a moving junction between the parasite and the surface of the host cell, where the interaction between AMA1 and RON2 is necessary. AMA1 has already been reported in Babesia spp., however, it is unknown whether RON2 is present in protozoa of the genus Babesia. Using B. bigemina as model, the aim of this work was to identify and characterize the gene that codifies the protein RON2 and analyze its transcription and expression. To obtain the samples, a bovine was infected with the Chiapas strain of B. bigemina. When the parasitaemia reached 4%, blood was collected and used to prepare blood smears and to extract DNA and RNA. A bioinformatics search for a homologous sequence of the gene ron2 was performed. A highly similar sequence was found and which amplify the first 913pb by PCR. The fragment was cloned by transformation of competent E. coli cells, the plasmid was purified, the sequences were obtained and they were analyzed using the program BioEdit in order to get the consensus sequence. Transcription analysis was performed by RT-PCR. Protein expression was analyzed by designing two peptides on the predicted protein sequence, which contain B epitopes with the highest antigenicity values. Two New Zealand rabbits were inoculated four times at 15 day-intervals. Sera were extracted and used for the detection of RON2 by indirect immunofluorescence. A staining patter of expression in the apical end of intraerythocytic merozoites was observed, confirming expression. This is the first report of the identification and expression of RON2 in B. bigemina. (Key words: ron2 gene, Babesia bigemina, bovine babesiosis) 2

4 DEDICATORIA La presente tesis se la dedico a mi familia por siempre apoyarme en todos mis proyectos por todo su cariño y confianza. A mi padre por guiarme, aconsejarme, procurarme y siempre confiar en mí, porque sin sus sabios consejos y enseñanzas nunca habría llegado hasta aquí, pero sobre todo por su amor. De igual manera a mi madre por siempre apoyarme, escucharme y estar siempre a mi lado, ya que sin su amor y apapachos nunca hubiera tenido el valor. AGRADECIMIENTOS Quiero agradecer a mi máxima casa de estudios, la Universidad Autónoma de Querétaro por brindarme las bases académicas a lo largo de mi carrera. A mi director de tesis el Dr. Juan Joel Mosqueda Gualito por compartir conmigo su conocimiento y brindarme su apoyo tanto académico como personal en todo este tiempo, gracias por permitirme ser parte de su laboratorio y por enseñarme tantas cosas. A mis asesores Karina Acevedo Whitehouse y Fausto Arellano Carbajal por ser unos excelentes profesores y amigos, por enseñarme tantas cosas y por estar al pendiente de mí siempre. A mi tutor y asesor el Dr. Joel Quesada Mejorada porque a lo largo de toda mi carrera fue un gran profesor y amigo, el cual siempre me escucho y aconsejo en cada dilema que tuve en estos 5 años. 3

5 A mi asesora Gabriela Aguilar Tipacamú por su apoyo, consejos y ayuda a lo largo de todo este proyecto. A todos mis profesores por compartir sus conocimientos y experiencias y por siempre creer en mí. A mi familia por su apoyo y cariño, por hacerme un mejor ser humano y por todo su cariño. A mis amigos Mónica Izquierdo por ser mi conciencia y compañera de aventuras en todo este tiempo, a yaris Suhan campusano por ser una excelente roommate y amiga, a Mafer Cruz, Edda Hurtado y Brenda Mena por su linda amistad, por su apoyo, compañía y cariño en todo este tiempo. A todos mis compañeros de clases por enseñarme tantas cosas y por compartir tantas aventuras. A Víctor Manuel Hernández Mérida por todo su amor y apoyo. Por hacerme tan feliz y compartir conmigo todos mis proyectos. 4

6 ÍNDICE Página Resumen.1 Summary.2 Dedicatorias.3 Agradecimientos 4 Índice 5 Índice de cuadros.. 6 Índice de figuras.7 I. INTRODUCCION...9 II. REVISION DE LITERATURA...11 Babesiosis bovina 11 Taxonomía y ciclo de vida de Babesia bigemina...13 Proceso de Invasión.15 Impacto económico.16 Impacto en vida silvestre.17 Vacunas.20 RON2..22 III. JUSTIFICACIÓN...24 IV. HIPÓTESIS 25 V. OBJETIVOS...26 VI. ESTRATEGIA EXPERIMENTAL...27 VII. METODOLOGIA 28 VIII. RESULTADOS..44 IX. DISCUSIONES.60 X. CONCLUSIONES.64 Literatura citada. 65 Anexos

7 ÍNDICE DE CUADROS Cuadro Página Cuadro 1. Iniciadores diseñados para amplificar un fragmento 70 De 913pb del gen ron2 de Babesia bigemina. Cuadro 2. Iniciadores diseñados para amplificar un fragmento 70 De 358pb del gen ron2 de Babesia bigemina. Cuadro 3. Secuencia de péptidos conteniendo los epítopos B 70 seleccionados 6

8 ÍNDICE DE FIGURAS Figura Página Fig.1 Ciclo de vida de Babesia bigemina Fig.2 Modelo esquematizado de los pasos involucrados en la invasión del merozoito en Plasmodium Fig. 3 Representación esquemática del modelo de organización del movimiento de unión Fig.4 Secuencia de la proteína RON2 de Plasmodium falciparum Fig. 5 Resultado del análisis Blast de la secuencia RON2 de P. falciparum contra B. bigemina Fig. 6 Análisis en ORF Finder Fig. 7 Secuencia nucleotídica encontrada Fig. 8 Secuencia de aminoácidos encontrada Fig.9 Resultados de la Identificación del péptido señal Fig.10 Resultados del análisis de la presencia de dominios Fig.11Resultados de la predicción de hélices transmembranales de la proteína Fig. 12 Resultado del cálculo del punto Isoeléctrico de la proteína Fig. 13 Amplificación de las primeras 913pb del gen ron2 mediante PCR

9 Fig.14 Secuencia consenso del gen ron2 de B. bigemina, obtenida a partir de seis secuencias Fig. 15 Alineamiento de la secuencia consenso y de la secuencia del Instituto Sanger Fig. 16 Análisis de la transcripción del gen ron2 de B. bigemina mediante RT-PCR Fig. 17 Resultado del análisis de la expresión de RON2 en merozoitos Intraeritrocíticos de B. bigemina utilizando el péptido A Fig. 18 Resultado del análisis de la expresión de RON2 en merozoitos Intraeritrocíticos de B. bigemina utilizando el péptido B

10 I.INTRODUCCIÓN Babesia bigemina es un parásito protozoario perteneciente al filo Apicomplexa, este filo comprende varios parásitos causantes de enfermedades humanas y en animales. B. bigemina es causante de la babesiosis bovina, considerada una de las enfermedades infecciosas económicamente más importantes del ganado bovino. Esta enfermedad es trasmitida por las garrapatas Rhipicephalus (Boophilus) annulatus y Rhipicephalus (B.) microplus, y se distribuye principalmente en las regiones tropicales y subtropicales. En México la población de ganado bovino en el 2011 según lo reportado por la SIAP en colaboración con la SAGARPA fue de millones de cabezas aproximadamente, de las cuales, el 75% se distribuyen principalmente en el trópico mexicano (García et al, 2003), por lo que esta enfermedad llega ocasionar pérdidas monetarias en la industria ganadera al causar anemia, hemoglobinuria, fiebre, ictericia, susceptibilidad a otros patógenos y en algunas ocasiones la muerte de los animales (Sirakumar et al, 2012; Cardenas et al., 2011). Estos costos se ven incrementados por los gastos en el control del vector, la detección de enfermedades, la implementación de medidas de prevención y los gastos por tratamientos. Aunque recientemente no se han estimado los costos ocasionados por esta enfermedad, en 1975 se registraron pérdidas económicas de 186 millones de dólares a nivel mundial, la mayoría derivado de la merma de leche y carne (Mosqueda et al, 2012). Estos costos se ven incrementados por las pérdidas económicas debido al retraso en el desarrollo de la industria ganadera generado por la negativa de los productores en introducir ganado de mejor calidad, cuya producción de carne y leche es mayor, pero son más susceptibles a presentar la forma aguda de la enfermedad por proceder de zonas libres de garrapatas (Mosqueda et al, 2012). Actualmente no existe una vacuna segura contra esta enfermedad, la inmunidad proporcionada por vacunas inactivadas no ha sido satisfactoria, por ser demasiado baja al compararse con la inmunidad proporcionada por vacunas vivas atenuadas 9

11 (Mosqueda et al, 2006; Cardenas et al., 2011). En México existe una vacuna mixta atenuada contra B. bovis y B. bigemina creada por el INIFAP a base de parásitos vivos, atenuados, cultivados in vitro; sin embargo, existen muchos inconvenientes de las vacunas vivas atenuadas ya que pueden revertir su virulencia, la vida útil es relativamente corta y en ocasiones los cultivos de microrganismos vivos llegan a ser contaminadas con otros hemoparásitos, bacterias y virus (Mosqueda et al, 2006; Cardenas et al., 2011). A la fecha no existen vacunas recombinantes comerciales de ningún tipo en el mundo, debido a esto, nuestro equipo de investigación explora nuevas estrategias para el desarrollo de una vacuna antigénica definida que contenga sólo inmunógenos protectores, por lo que es necesario el estudio de más antígenos del parásito que permitan la identificación de inmunógenos protectores, principalmente de aquellas proteínas involucradas en el proceso de invasión del protozoario a la célula hospedera. En parásitos Apicomplexos como Toxoplasma gondii y Plasmodium falciparum la invasión de las células hospederas se efectúa a través de un movimiento de unión entre el parásito y la superficie de la célula blanco, comenzando por la inyección de las proteínas del cuello de las roptrías (rhoptry neck proteins ó RONs) donde RON2 atraviesa la membrana funcionando como un receptor del antígeno de la membrana apical 1 (AMA1) (Tonkin et al, 2011; Lamarque et al., 2012; Besteiro et al., 2011). El mecanismo de invasión es altamente conservado en este filo y se ha encontrado que la interacción entre AMA 1 y RON 2 es necesaria en el proceso de invasión de Toxoplasma gondii y Plasmodium falciparum (Srinivasan et al, 2011; Richard et al., 2010; Lamarque et al., 2011). Recientemente se ha publicado la caracterización de un gen ortólogo a AMA1 en B. bigemina, sin embargo a la fecha no se sabe si existe una proteína ortóloga a RON2 en este patógeno. En el presente trabajo se describe por primera vez, la identificación mediante herramientas biotecnológicas y bioinformática del gen RON2 de Babesia bigemina, además se reporta el análisis mediante técnicas inmunomoleculares de su transcripción y expresión en fases eritrocíticas. 10

12 II. REVISIÓN DE LA LITERATURA Babesiosis bovina La babesiosis bovina es una enfermedad causada por un parásito protozoario del género Babesia y es transmitida por garrapatas del género Boophilus, recientemente clasificadas como Rhipicephalus (Longzheng et al, 2013). Existen muchas especies de Babesia que infectan a animales domésticos, silvestres y al hombre. Sin embargo, causan más problemas en la industria ganadera y las especies de mayor incidencia en los bovinos son Babesia bovis, B. bigemina y B. divergens (Mosqueda et al, 2012). Esta enfermedad se reportó por primera vez en 1888 por Viktor Babes, quien en Rumania identificó corpúsculos intraeritrocíticos en la sangre de bovinos infectados, pero no fue hasta 1893 cuando Theobald Smith y Frederick Kilbome en Estados Unidos demostraron por experimentos que las garrapatas Rhipicephalus (Boophilus) eran las responsables de trasmitir la enfermedad conocida como la fiebre de las garrapatas del ganado (CFT), cuya hipótesis fue confirmada por Cooper Curtice quien afirmaba que eliminando la garrapata se eliminaría la enfermedad. A principios del siglo pasado, el gobierno de los Estados Unidos inició una campaña de erradicación de las garrapatas y que culminó en 1943 con la erradicación de la enfermedad en ese país (Mosqueda et al, 2012; Pérez de León et al, 2012). A pesar de que la enfermedad fue reportada desde hace más de un siglo, a la fecha no existen métodos de diagnóstico sensibles, automatizados y confiables, ni vacunas seguras que confieran protección adecuada al ganado, tanto en México como en la mayoría de los países donde esta enfermedad es endémica; solo existen la quimioterapia y pocos métodos de diagnóstico. Una de las estrategias 11

13 de control de la transmisión es la detección de reservorios, ya que estos no presentan síntomas. Los métodos de diagnóstico utilizados son la detección del parásito en frotis sanguíneos teñidos con colorante de giemsa mediante microscopio, sin embargo, este método en portadores sanos es poco confiable y es difícil distinguir entre las especies B. bovis y B. bigemina. Por otro lado, están los métodos moleculares, basados en la detección de DNA de Babesia en sangre por la técnica de PCR, estos proporcionan resultados con alta sensibilidad y especificidad (Longzheng et al, 2013; Mosqueda et al, 2012). La secuenciación casi completa del genoma de Babesia bigemina es una herramienta importante para el estudio de este patógeno, al proporcionar información sobre las características esenciales en la composición, número y tipo de genes, así como, al permitir la comparación de su genoma con el de otros protozoarios apicomplexos. Esta herramienta aunada a programas bioinformáticos han permitido la incorporación de diversos análisis que hacen posible la identificación de nuevos genes o genes ortólogos ya reportados en otras especies, permitiendo así el desarrollo de métodos de diagnóstico o proteínas como candidatos vacunales (Gohil et al, 2012). 12

14 Taxonomía y Ciclo de vida de Babesia bigemina B. bigemina es un parásito protozoario intraeritrocítico trasmitido de un bovino a otro por garrapatas. Pertenece al reino Protista, subreino Protozoa, Filo Apicomplexa, clase Sporozoa, subclase Piroplasmia, orden Piroplasmida, suborden piroplasmorina, familia babesiidae, Género Babesia (Levine, 2007). Su ciclo de vida incluye estadios asexuales y sexuales (Mosqueda et al, 2004), que se llevan a cabo dentro de sus dos hospederos; uno vertebrado (bovino) y uno invertebrado (garrapata) (Strickland et al, 1965). El ciclo de vida comienza con la inyección de esporozoítos al bovino por las garrapatas infectadas. Dentro de los eritrocitos se lleva a cabo la replicación asexual donde se convierten en trofozoítos que se dividen por fisión binaria produciendo merozoítos, estos lisan las células e infectan otros eritrocitos. En este momento es cuando el animal empieza a presentar la sintomatología debido a la lisis de los eritrocitos. Los merozoítos son trasmitidos a la garrapata cuando esta ingiere sangre de un animal infectado. Variaciones en factores como temperatura, tensión del oxígeno, y factores que ocurren en el intestino medio de la garrapata inducen el desarrollo de los merozoítos a gametocítos, estos cuentan con proyecciones conocidas como cuerpos radiados o strahlenkorper que ayudan a fusionarse a los gametos dando lugar a un cigoto. Los cigotos se transforman en fases motiles que atraviesan las células intestinales y llegan a la membrana basal donde se trasforman en quinetos. Los quinetos entran en la hemolinfa y se dispersan al resto de los tejidos de la garrapata, tales como fibras musculares, hemocitos, células ováricas y ovocitos. La infección de los ovocitos fecundados por los quinetos da lugar al proceso denominado infección transovárica, que ocurre cuando los vermículos penetran los óvulos del ovario antes de que se forme la cubierta de quitina, e invaden las células del intestino de las larvas, de tal forma que cuando las larvas nacen ya están infectadas. La transformación de los esporoquinetos a sus formas infectivas (esporozoítos) necesita un estímulo de alimentación o tener una temperatura de 37 C, de esta manera la garrapata 13

15 inocula a los parásitos por medio de su saliva al alimentarse del bovino y comienza nuevamente el ciclo. Cabe destacar que babesia bigemina solo puede ser trasmitida en el estadio de ninfa o adulto de la garrapata (Figura 1) (Heekin et al, 2012; Mosqueda et al, 2004; Srinivasan et al, 2011; Strickland et al, 1965). 14

16 Proceso de invasión En algunos parásitos apicomplexos como Toxoplasma gondii y Plasmodium spp., la invasión a las células hospederas se realiza por medio de un movimiento de unión entre el parásito y la superficie de la célula, donde el parásito inyecta un complejo de proteínas del cuello de las roptrias denominadas RONs (Rhoptry neck proteins) que consta de RON 2, 4 y 5 a la célula, este proceso de invasión activa coordinadamente las proteínas de micronemas y de las roptrias. Aquí RON2 atraviesa la membrana y una superficie expuesta de la proteína, denominada ectodominio, sirve como receptor de otro antígeno del parásito llamado antígeno de la membrana apical (AMA1), por lo que el parásito proporciona tanto el ligando como el receptor (Srinivasan et al, 2011; Tyler et al, 2011). Después del contacto inicial del parásito con la célula hospedera ocurre una reorientación resultando en una yuxtaposición directa del polo apical del protozoario, conduciendo a la formación del complejo AMA1-RON que genera una unión móvil que se caracteriza por presentar una estructura anillada, la cual migra de la parte anterior a la posterior del parásito, formando una vacuola parasitófora que envuelve al parásito, ocasionando la fusión de la membrana del eritrocito y la liberación del parásito en la vacuola, la cual funciona como una barrera de difusión para evitar la degradación intracelular del parásito. Se sabe que la interacción AMA1-RON2 es esencial en el proceso de invasión de Toxoplasma gondii y Plasmodium falciparum además de activar la formación de conexiones. Esto explica por qué las proteínas AMA1, RON 2, 4 y 5, que son primordiales en este proceso, son altamente conservadas. A pesar de su relevancia, los eventos moleculares subsecuentes no se conocen a detalle (Figura 2). En Babesia se ha reportado la existencia de AMA1 en B. divergens, B. bovis y recientemente en B. bigemina, pero no se sabe si existen proteínas homólogas a las proteínas RON (Srinivasan et al, 2011; Lamarque et al, 2011). 15

17 Impacto económico La Babesiosis bovina es una enfermedad infecciosa de distribución mundial que ocasiona pérdidas económicas en la industria ganadera, especialmente en las regiones tropicales y subtropicales donde se distribuye mayormente el vector (garrapatas Rhipicephalus (Boophilus) annulatus y Rhipicephalus (B.) microplus) Las especies más importantes son Babesia bovis y Babesia bigemina (Srinivasan et al, 2011). Solo en México la población de ganado bovino en el 2011 según lo reportado por la SIAP en colaboración con la SAGARPA fue de millones de cabezas aproximadamente. De estas, el 75% se distribuye principalmente en el trópico mexicano (García et al, 2003), por lo que esta enfermedad llega a ocasionar grandes pérdidas monetarias en la industria ganadera al causar anemia, hemoglobinuria, fiebre, ictericia, susceptibilidad a otros patógenos y en algunas ocasiones la muerte de los animales (Sirakumar et al, 2012; Cárdenas et al., 2011). Estos costos se ven incrementados por los gastos en el control del vector, la detección de animales enfermos, la prevención y los tratamientos. Aunque recientemente no se han estimado los costos ocasionados por esta enfermedad, en 1975 las pérdidas ascendieron a 186 millones de dólares, la mayoría derivado de la merma de leche y carne (Beltran et al, 1975). Sin embargo estos costos están subestimados si a esto agregamos las pérdidas económicas debido al retraso en el desarrollo de la industria ganadera generado por la negativa de los productores en introducir ganado de mejor calidad cuya producción de carne y leche es mayor, debido a que este tipo de ganado es más susceptible a presentar la forma aguda de la enfermedad por proceder de zonas libres de garrapatas (Mosqueda et al, 2012; Longzheng et al, 2013). 16

18 Impacto de la babesiosis bovina en vida silvestre Cada día cobran más auge los estudios de enfermedades en fauna silvestre, al comprenderse el impacto que estas podrían ocasionar por su participación como reservorios de enfermedades con riesgo para la salud humana y animales domésticos o como posibles enfermedades emergentes (Grenfell & Dobson, 1995). Los reportes de enfermedades zoonóticas emergentes han incrementado en los últimos años debido a la fragmentación y perdida del hábitat, que percute en la dinámica de las poblaciones al modificar la distribución de sus áreas o aumentar las densidades poblacionales, ocasionando brotes epidémicos y epizoóticos. Para poder comprender estas interacciones es necesario dar un enfoque que involucre la ecología, evolución y biogeografía (Hudson et al, 2002; Grenfell & Dobson, 1995). Artrópodos como las garrapatas son un trasporte eficiente de patógenos, se les ha tratado de erradicar con el uso desmedido de compuestos químicos y no químicos, por lo que han generado resistencia a estos, si a esta resistencia aunamos que la epidemiología de las enfermedades transmitidas por garrapatas se ve afectada por acciones antropogénicas y naturales como cambios en el uso del suelo, cambios en el clima, introducción del patógeno a zonas libres de este por movimientos de los animales, esto puede provocar la re-emergencia de la enfermedad en zonas donde no se encuentra (Ojeda-chi et al, 2011). La emergencia de una nueva enfermedad está dada por la introducción del patógeno a una nueva población y la diseminación de este y que logre establecerse, lo cual no es fácil debido a que tiene que encontrar las condiciones óptimas para su establecimiento y sobrevivencia, ya que son sistemas complejos sujetos a cambios en los procesos ecológicos los cuales influyen en la biología de la garrapata y por lo tanto en la epidemiología del patógeno (Hoch et al, 2012; Grenfell & Dobson, 1995). Para poder entender la epidemiologia de la babesiosis bovina debemos tratar de comprender los siguientes aspectos: patrón de distribución del patógeno, coevolución entre el patógeno y hospedero, poblaciones susceptibles, probables 17

19 zonas de riesgo, factores ambientales, determinantes de la dinámica de las enfermedades con influencia de los patrones espaciotemporales (Hudson et al, 2002; Grenfell & Dobson, 1995). Sin embargo esto no es una tarea fácil ya que aún se desconocen muchos aspectos biológicos de este patógeno, solo levine en 1971 reporto 71 especies de babesia de las cuales menos de 15 se conocen sus vectores, los cuales son garrapatas duras de la familia ixodidae y su proceso evolutivo de infección no es fácil de comprender ya que se necesita entender las interacciones entre vector, patógeno y hospedero, además de que la transmisión es trans-estadial y trans-ovárica (Smith, 1978). Estudios sugieren que el grado y porcentaje de infección de garrapatas con Babesia está directamente relacionado con el grado de parasitemia en el bovino y que la viabilidad del vector va a determinar el desarrollo y transmisión de las babesias, lo que nos llevaría a concluir que el patógeno no debería provocar daños al vector, sin embargo se sabe que las especies de Babesia pueden ser patógenas no solo para el huésped sino también para el vector, estudios realizados demostraron que con una parasitemia mayor al 5% con B. bovis y 20% con B. bigemina hubo un alto porcentaje de hembras muertas por la perforación del epitelio intestinal ocasionado por la babesia, por lo que la parasitemia tendría que ser menor a estos porcentajes para poder seguir transmitiéndose, estos nos habla de una coevolución entre vector-patógeno que ha permitido que ambas especies sigan coexistiendo en una constante lucha evolutiva entre ambas (Ramírez et al, 1997). En el caso particular de la babesiosis bovina en la zona fronteriza de México y Estados Unidos se ha reportado que además de bovinos otros ungulados como el venado cola blanca (Odocoileus virginianus), ovejas (Ovis aries), antílope nilgai (Boselaphus Tragocamelus) son especies portadoras, estos parásitos también se encontraron presentes en algunas especies exóticas como el ciervo negro (antílope cervicapara), ñus azules (Connochaetes taurinus), cebras (Equus zebra) y la jirafa (Giraffa camelopardalis) estas especies no presentan la enfermedad, 18

20 pero sirven de reservorios del parasito lo que impide que se erradique la enfermedad de esta zona (Cárdenas et al, 2011). 19

21 Vacunas Actualmente no existe una vacuna segura contra la babesiosis bovina, la inmunidad proporcionada por vacunas inactivadas no ha sido satisfactoria, por ser demasiado baja al compararse con la inmunidad proporcionada por vacunas vivas atenuadas. En México existe una vacuna experimental mixta atenuada contra B. bovis y B. bigemina creada por el INIFAP, sin embargo, existen muchos inconvenientes de las vacunas vivas atenuadas ya que puede revertir su virulencia, la vida útil es relativamente corta y necesitan estar en refrigeración y en ocasiones llegan a ser contaminadas con otros hemoparásitos, bacterias y virus (Mosqueda et al, 2006; Cárdenas et al., 2011). Debido a esto, nuestro equipo de investigación explora nuevas estrategias para el desarrollo de alternativas más seguras como una vacuna antigénica definida que contenga sólo inmunógenos protectores, por lo que es relevante el estudio de proteínas expuestas, conservadas e involucradas en procesos específicos como la invasión del protozoario a la célula hospedera, la adhesión, la reproducción sexual y asexual (Terkawi et al, 2011; Shkap et al, 2007; Borgonio, 2007). Para poder determinar estas subunidades con potencial antigénico es necesario conocer el rol de estas moléculas, la biología del parásito y los mecanismos de la respuesta inmune ocasionada en el hospedero y en el vector por el patógeno, sin embargo, aún se desconocen mucho de estos procesos (Suarez & Nohn, 2011). Algunas de las proteínas que se han identificado recientemente como candidatos vacunales contra la babesiosis bovina ocasionada por B. bigemina incluyen proteasas, proteínas de las roptrias y micronemas, y antígenos de las fases sexuales, de las asexuales y las proteínas de la membrana la cubierta de superficie. Las herramientas moleculares y bioinformáticas han sentado las bases para estas investigaciones donde se tienen caracterizadas hasta la fecha proteínas tales como: RAP-1, GP45, AMA-1, SPB-1, 2, 3 y 4, HSP-20 (Terkawi et al, 2011; Mosqueda et al, 2004; Figueroa & Álvarez, 2003; Petrigh, 2010; Mesplet et al, 2010; Borgonio, 2007; Vichido et al, 2008). Sin embargo aún faltan muchas 20

22 proteínas aun por caracterizar en Babesia, las cuales pueden ser importantes para el desarrollo de vacunas exitosas. 21

23 RON2 En algunos parásitos intracelulares obligados pertenecientes al filo apicomplexa el mecanismo de invasión es similar e implica una interacción entre la célula huésped y la superficie del parásito conocida como unión móvil, donde se forma una estructura de unión entre ambos, el parásito secreta un complejo de proteínas del cuello de las roptrias (RON), liberado de unos organelos llamados roptrias conformado por RON2, 4 y 5 a la célula, RON2 migra a la membrana y sirve como correceptor de AMA-1 una proteína secretada por los micronemas del parásito que se fija en la superficie del parásito (Figura 3) (Besteiro et al, 2011). En algunas especies de Plasmodium se conoce que la unión entre AMA-1 y RON2 es esencial en el proceso de invasión del parasito a la célula hospedera y que estas son altamente conservadas, todos estos descubrimientos se han realizado por medio de herramientas moleculares y bioinformáticas (Srinivasan et al, 2011).Estudios recientes mediante análisis de secuenciación mostraron una inserción de dos aminoácidos en la cisteína del bucle pf/pvron2, aunque esta región es importante para la interacción inicial entre el parásito y la superficie de la célula hospedera no se mostró una repercusión en la invasión, así mismo, estudios mutagénicos sugieren que un anticuerpo se une al bucle pfama1 DII, si esta unión se interrumpe no permite cambios conformacionales en RON2 (Tonkin et al, 2011). Mediante estudios in vitro en Toxoplasma gondii y Plasmodium falciparum se ha demostrado que RON2 se inserta como proteína integral de membrana en la célula huésped uniéndose a AMA-1 y que a pesar de la divergencia entre especies ambas proteínas son altamente conservadas. Otros estudios de inhibición mediante proteínas recombinantes mostraron que esta interacción es fundamental para ambas especies, demostrando así que AMA-1 utiliza a RON2 como receptor para que el parásito pueda iniciar la invasión (Richard et al, 2010). Estudios realizados por Lamarque y colaboradores en el 2011 demostraron mediante anticuerpos monoclonales unidos a un epítopo de un bucle hidrofóbico 22

24 de pfama-1 que se impedía la unión con el complejo RON (Lamarque et al, 2011). Todo esto demuestra que tanto AMA1 como RON2 son importantes durante el proceso de invasión y que son altamente conservados en parásitos apicomplexos. 23

25 III. Justificación La babesisosis bovina es una enfermedad infecciosa que genera pérdidas económicas en la industria ganadera, especialmente en las regiones tropicales y subtropicales; los principales agentes etiológicos de la enfermedad son Babesia bovis y Babesia bigemina trasmitidas por garrapatas. En la actualidad no existe una vacuna recombinante para esta enfermedad, debido a esto, se exploran nuevas técnicas moleculares para el desarrollo de una vacuna antigénica definida que contenga sólo inmunógenos protectores, por lo que es relevante el estudio de proteínas involucradas en el proceso de invasión del protozoario a la célula hospedera. En algunos parásitos Apicomplexos como Toxoplasma gondii y Plasmodium falciparum la invasión de las células hospederas se efectúa a través de un movimiento de unión entre el parásito y la superficie de la célula blanco donde la proteína RON2 atraviesa la membrana funcionando como un receptor del antígeno de la membrana apical 1, se sabe que este mecanismo de invasión es altamente conservado en este filo y que la interacción entre AMA1 y RON2 es necesaria en el proceso de invasión, sin embargo a la fecha no se sabe si existe una proteína homóloga a RON2 en este patógeno por lo que en el presente trabajo se estudiará dicha proteína. 24

26 IV. Hipótesis Existe un homólogo al gen ron2 en el genoma de Babesia bigemina que se transcribe y traduce a proteína. 25

27 V. Objetivos Objetivo general Identificar y caracterizar el gen que codifica para la proteína RON2 en Babesia bigemina y analizar su expresión. Objetivos específicos o Identificar mediante herramientas bioinformáticas una secuencia homóloga al gen ron2 en el genoma de Babesia bigemina o Evaluar la trascripción del gen o Analizar la expresión de la proteína 26

28 VI. Estrategia experimental Objetivo 1. Identificar una secuencia homóloga al gen ron2 en el genoma de Babesia bigemina en fases eritrocíticas. Identificación bioinformática de la secuencia de ron2 de Babesia bigemina Obtención de las muestras biológicas Diseño de iniciadores específicos para el gen ron2 Extracción de DNA Amplificación del gen mediante PCR Clonación del gen mediante trasformación de células competentes Purificación del plásmido Secuenciación del gen ron2 Análisis de la secuencia 27

29 Objetivo 2. Evaluar la trascripción del gen Diseño de iniciadores específicos Extracción de RNA Análisis de la transcripción del gen mediante RT-PCR 28

30 Objetivo 3. Analizar la expresión de la proteína Diseño de péptidos sintéticos Generación de anticuerpos anti ron2 Inmunolocalización de ron2 mediante inmunofluorescencia 29

31 VII. METODOLOGÍA El presente trabajo se realizó en el laboratorio de Microbiología del Cuerpo Académico de Salud Animal y Microbiología Ambiental de la Facultad de Ciencias Naturales de la Universidad Autónoma de Querétaro. Obtención de las muestras biológicas Los parásitos se obtuvieron, mediante la inoculación de 7 ml de sangre infectada con Babesia bigemina cepa Chiapas, a un bovino macho raza Holstein, previamente esplenectomizado el cual se monitoreó diariamente a partir del día 5 post-inoculación. Una vez que la parasitemia alcanzó el 4%, determinada por el conteo de eritrocitos infectados teñidos con colorante Giemsa, se colectó la sangre infectada, la cual se usó en los distintos experimentos. Identificación Bioinformática de la secuencia de ron2 de Babesia bigemina La secuencia de la proteína ron2 de Plasmodium falciparum obtenida en la base de datos NCBI (GI: BAH ) se utilizó para hacer una búsqueda BLAST contra todo el genoma de Babesia bigemina ( para detectar una secuencia con elevada similitud. La secuencia seleccionada se analizó mediante programas bioinformáticos para realizar los siguientes análisis: a) encontrar los marcos de lectura abiertos en ORF Finder ( b) determinar el péptido señal en SignalP ( c) localizar el dominio de la proteína en pfam ( d) predecir las hélices transmembranales de la proteína en TMHMM ( e) la determinación del punto isoeléctrico en Isoelectric Point Calculator ( y f) el peso molecular de la proteína en protein molecular weight calculator ( 30

32 Extracción de DNA La sangre de bovino infectada con B. bigemina se desfibrinó con perlas de vidrio en un matraz estéril, posteriormente se centrifugó a 9000g por 20 minutos a 4 C, se retiró el suero y se lavó 3 veces con medio 199 por centrifugación a 9000g por 20 minutos a 4 C. La extracción de DNA se realizó mediante el kit Illustra blood genomic Prep Mini Spin, (GE Healthcare, País: Europa) como se describe a continuación. A 200 μl de eritrocitos infectados se adicionaron 20 μl de proteinasa K y 400 μl de búfer de lisis, se mezcló bien, se incubó a temperatura ambiente por 10 minutos con vortexeo intermitente y se centrifugó brevemente para bajar la muestra. En una columna se colocó la muestra, se centrifugó por un minuto a 11000g y se retiró el líquido de desecho, nuevamente se adicionaron 500μl de búfer de lisis a la columna, se centrifugó durante un minuto a 11000g y se retiró el líquido de desecho. Para el lavado se añadieron 500μl de búfer de lavado a la columna, se centrifugó por tres minutos a 11000g y se desechó el tubo colector y el líquido de desecho, con esto el DNA quedó en la matriz de silica el cual se transfirió a un tubo nuevo con 200μl de búfer de elución precalentado a 70 C y se incubó durante un minuto a temperatura ambiente, finalmente se eluyó centrifugando por un minuto a 11000g y se almacenó a -20 C hasta su uso. 31

33 Diseño de iniciadores y amplificación del gen mediante PCR Con base a la secuencia seleccionada se diseñaron en el programa Oligoanalyzer ( dos iniciadores, uno sentido (F) y uno antisentido (R) (tabla1) que amplifican un fragmento del gen total equivalente a 913 pb. Los criterios para su diseño fueron los siguientes: de 17 a 25 pares de bases, la secuencia no terminara en A y T, contenido de GC de 50-60%, que la secuencia no contara con más de 2 G o C seguidas, que la Tm fuera de 58 a 60, que entre las Tm de los oligos seleccionados no existiera más de 5 de diferencia y que estos no se hibridizaran ni formaran homodímeros entre sí. Se procedió a realizar la amplificación de la secuencia mediante PCR utilizando los iniciadores diseñados, el DNA de B. bigemina cepa Chiapas, un master mix (Promega, País: USA) conteniendo Taq polimerasa, dntps, MgCl2 y agua libre de nucleasas, de acuerdo a las cantidades mostradas en la tabla de abajo: Reactivos Muestra 1 Control negativo Master Mix 12.5μl 12.5 μl Primer Forward 1 μl 1 μl Primer reverse Intermedio 1 μl 1 μl Agua libre de nucleasas 7.5μl 10.5μl DNA 3 μl 0 μl Volumen total 25 μl 25μl 32

34 Todos los reactivos se agregaron a un tubo de PCR de 200 μl en el orden que aparecen y se centrifugaron brevemente. Las muestras se metieron a un termociclador BIO-RAD 1000 Thermal Cycler con el siguiente programa de termociclado: 95 C 94 C 94 C 72 c 72 C 72 C 5min 15seg 54 C 15seg 52 C-49 C 1min 30seg 1min 7min 12 c 30seg 1x 10x 20x α 1x Para confirmar la amplificación del gen se preparó un gel de agarosa al 1%. El gel se preparó con: 100ml de TAE EDTA 1 gr de agarosa Se fundió la agarosa con el agua, se mezcló perfectamente y se vertió en el contenedor del gel, se colocó un peine de dientes anchos y se dejó gelificar. 33

35 Para cargar el DNA se preparó la reacción siguiente (las cantidades mostradas son para cada muestra de DNA que se desee correr): Reactivo Muestra 1 Control negativo Escalera Buffer de carga 3μl 3μl 3μl escalera 0 0 2μl Producto de PCR 15μl 15μl 0 Una vez que se realizó la mezcla, se cargó el gel y se corrió en una cámara de electroforesis a 50v por 1hora con amortiguador TAE EDTA. Finalmente se tiñó con bromuro de etidio y se observó en el transiluminador. 34

36 Clonación y secuenciación del gen ron2 Para la reacción de clonación se utilizó un vector de clonación comercial pentrd- TOPO with One Shot Top10 chemically (Invittogen, País: USA) el cual se utilizó con los siguientes materiales, siguiendo las instrucción del fabricante: Material Producto de PCR Solución salina Agua libre de nucleasas Vector PENTR-D Cantidad 3μl 1μl 1μl 1μl Brevemente, se colocaron todos los reactivos en el orden que aparecen en tubos de 1.5 ml y se mezclaron por pipeteo (solo dos veces), la reacción se incubó por 5 minutos a temperatura ambiente y se procedió a la transformación. Para la transformación de células competentes, previamente se calentó el medio SOC a temperatura ambiente y las placas de LB con kanamicina a 37 C por 30 minutos. Posteriormente se añadieron 2μl del vector pentr D TOPO a un vial con células competentes One Shot Top10 Chemically Competent E.coli, (invitrogen, País: USA) se mezcló suavemente con una punta dando vueltas (sin pipetear) y se incubó en hielo por 30 minutos. Inmediatamente se dio un choque térmico por 30 segundos a 42 C, procurando no agitar la reacción, pasando el vial del hielo al baño maría por 30 segundos y en hielo nuevamente. Se agregaron 250 μl de medio SOC al vial y se agitó horizontalmente a 200 rpm a 37 C por una hora. Una vez transcurrido el tiempo se dispersaron 100 μl de solución en una placa y 200 μl en otra, y se incubaron a 37 C durante toda la noche. Al día siguiente se escogieron 15 colonias, las cuales se resembraron en 35

37 5ml de medio líquido con kanamicina y se incubaron con agitación a 37 C durante toda la noche. La purificación del ADN plasmídico se efectuó mediante el kit Illustra Plasmid Prep mini spin (GE Healthcare, País: Europa), siguiendo las instrucciones del fabricante. Para esto, los tubos con las colonias se centrifugaron a 4000rmp durante diez minutos, se tiró el sobrenadante dejando un poco en el tubo, con el cual se resuspendió la pastilla y se pasó a viales de 1.5ml, los cuales se centrifugaron a 16000xg por 1 minuto y descartó el sobrenadante procurando que no quedara nada de líquido. Una vez realizado esto, se agregaron 175μl de buffer de lisis tipo 7 y resuspendió la pastilla, se añadió 175μl de buffer de lisis tipo 8 y se mezcló por inversión, enseguida se colocó 350μl de lisis de buffer tipo 9 y se mezcló por inversión y se centrifugó a 16000xg por cuatro minutos. Se transfirió el sobrenadante a una columna y centrifugó a 16000xg por un minuto y se retiró el sobrenadante. Se agregaron 400μl de buffer de lisis tipo 9 y centrifugó a 16000xg por un minuto descartando el sobrenadante. Después de esto se añadieron 400μl de buffer de lisis tipo 1 a la columna y centrifugó a 16000xg por un minuto descartando el sobrenadante. Finalmente se transfirió la columna a tubos nuevos y centrifugó a 16000xg por un minuto y agregaron 100μl de buffer de lisis tipo 4, se incubó por 30 segundos a temperatura ambiente y centrifugó a 16000g por 30 segundos para eluir el DNA plasmídico. Éste se almacenó a -20 C hasta su posterior uso. Para conocer la concentración y pureza del ADN plasmídico se cuantificaron las muestras en el Nanodrop. La comprobación se realizó por electroforesis donde las muestras se corrieron en un gel de agarosa al 1% a 50v por una hora. Para la comprobación del inserto se incubaron las muestras con las dos enzimas de restricción NOT1 (Promega, País: USA) y ASC1 (Thermo Scientific, País: USA), donde se colocó en un tubo 5μl de ADN plasmídico, 2μl de NE buffer 4 de ASC1, 1μl de la enzima NOT1, 0.5μl de la enzima ASC1 y 11.5µl de agua libre de nucleasas, se incubó durante una hora a 37 C y se corrió en un gel de agarosa al 1% por una hora a 60v. Se escogieron dos muestras que salieron positivas a la 36

38 presencia del inserto y se mandaron a secuenciar 16μl de la muestra a una concentración de 700ngcon el método de dideoxinucleótidos marcados, en el Instituto Potosino de Investigación Científica y Tecnológica A.C. (IPICYT). El secuenciador utilizado fue 3130 Genetic Analyzer (Applied Biosystems). 37

39 Extracción de ARN Se extrajo ARN de parásitos eritrocíticos mediante el método de Trizol de sangre infectada con B. bigemina Las muestras guardadas en trizol 1:10 a -80C se descongelaron en hielo y se incubaron durante cinco minutos a temperatura ambiente procurando mezclar perfectamente. Se agregaron 200µl de cloroformo, se mezcló brevemente y se incubó a temperatura ambiente por tres minutos. Se centrifugaron las muestras a 12000g a 3 C durante veinte minutos colectando la fase acuosa a un tubo nuevo y se adicionaron 500µl de isopropanol, se mezcló suavemente e incubó a temperatura ambiente durante diez minutos seguido de una centrifugación a 12000g por diez minutos a 3 C. Se descartó el sobrenadante y se hizo un lavado con 1ml de etanol al 75%, después las muestras se centrifugaron a 7500g durante diez minutos a temperatura ambiente. Se decantó el sobrenadante y dejó secar el pellet en la campana por diez minutos, finalmente se adicionaron 80µl de agua para resuspender perfectamente el pellet. La concentración se determinó en el nanodrop. Posteriormente se le dio un tratamiento con DNAsa (Invitrogen, País: Europa) para lo que se agregaron los siguientes reactivos: Material Cantidad DNAsa 3µl Buffer 1µl RNA 5µl Agua libre de nucleasas 1µl Volumen final 10µl La mezcla se incubó a 37 C por 60 minutos y una vez trascurrido este tiempo se agregó 1µl de solución de paro a cada muestra y se incubó a 65 C veinte minutos. El RNA se utilizó inmediatamente para el análisis de transcripción. 38

40 Análisis de la transcripción del gen ron2 mediante RT-PCR El análisis de transcripción se hizo sobre RNA total. Se agregaron los siguientes reactivos para cada reacción a un tubo de PCR: Material Cantidad Oligo dt 1µl RNA 5 µl DNTP 2 µl Agua libre de nucleasas 4 µl Volumen final 12 µl Las muestras se calentaron a 65 C por cinco minutos. En otro tubo se colocaron los siguientes reactivos: Material Rt+ Rt- Buffer 5x 4 µl 4 µl Dtt 1 µl 1 µl RNAsa out 1 µl 1 µl Agua libre de nucleasas 1 µl 1 µl Polimerasa 0 µl 1 µl Super script II 1 µl 0 µl 39

41 Se agregó la segunda reacción a la primera y se colocó en el termociclador a 50 C por 60 minutos seguido de 5 minutos a 85 C. Finalizado esto, se procedió con la siguiente reacción colocando los siguientes reactivos en un tubo nuevo: Material Rt+ Rt- Master mix 25µl 25 µl Primer forward 1 µl 1 µl Primer reverse 1 µl 1 µl Agua libre de nucleasas 13 µl 13 µl cdna 10 µl 10 µl Volumen final 50 µl 50 µl Las muestras se procesaron con el siguiente protocolo de termociclado: 95 C 94 C 72 C 72 C 5 50 C C 1x 30x 1x Para comprobar la amplificación, las muestras se corrieron en un gel de agarosa al 1.8% a 75v por 45 minutos teñido con bromuro de etidio. Los primers usados para la amplificación aparecen en la tabla 2. 40

42 Diseño de péptidos sintéticos Para el diseño de los péptidos, se eliminó el péptido señal de la secuencia predicha de proteína y ésta se analizó mediante tres programas bioinformáticos: ABCpred ( BCEpred ( y antibody epitope prediction ( con la finalidad de identificar epítopos de la proteína. De estas predicciones se seleccionaron dos secuencias peptídicas (tabla 3) tomando en cuenta la localización de regiones hidrofílicas, expuestas, los valores más altos de antigenicidad y que fueran predichas en los tres programas. Finalmente se mandaron a sintetizar comercialmente los dos péptidos que contuvieran MAPs 8 (péptido antigénico múltiple con 8 ramificaciones), al Instituto GL Biochem en Shanghai China. 41

43 Generación de anticuerpos anti-ron2 de Babesia bigemina Anticuerpos anti-ron2 fueron generados en conejos. Para esto se utilizaron 4 conejos machos Nueva Zelanda de dos meses de edad. Dos conejos fueron inmunizados con uno de los dos péptidos de la proteína RON2 (tabla 2). Primero se tomó una muestra de sangre (aproximadamente 1ml) pre-inoculación, la cual se obtuvo de la vena marginal de la oreja de cada conejo y se almacenó en vacutainers sin anticoagulante. Una vez coaguladas, las muestras se centrifugaron a 4000rpm durante 10 minutos y se extrajo el suero obtenido, el cual se almacenó a -20 C hasta su posterior uso. Para las inoculaciones, cada conejo se inoculado por vía subcutánea con un preparado de 0.5ml de péptido [100µg] diluido en PBS y mezclado con 0.5ml del adyuvante Montanide ISA 50 V2 (Seppic, País: USA), cerca de los ganglios linfáticos iliacos, una vez transcurridos 15 días se tomó una muestra de sangre de la vena marginal de la oreja de cada conejo y se procesó según los pasos citados anteriormente. Se realizaron cuatro inoculaciones con un intervalo de 15 días entre cada una. Diez días después de la última inoculación se realizó el sangrado final para obtener el suero post-inoculación. 42

44 Expresión de la proteína RON2 en parásitos eritrocíticos Para evaluar la expresión de RON2, se realizaron frotis sanguíneos de eritrocitos infectados con B. bigemina los cuales se fijaron con acetona al 100% durante 10 minutos y se dejaron secar en la campana de flujo laminar por 15 minutos. Una vez secas las laminillas se cuadricularon sobre ellas pozos con ayuda de un esmalte de uñas. Posteriormente se añadió una gota (aproximadamente 20µl) de anticuerpo primario anti-ron2 de cada conejo o bien el control negativo (suero preinmunización) en una dilución 1:50. Se incubaron las lamillas a 37 C por 30 minutos en una cámara húmeda. Transcurrido este tiempo se colocaron las laminillas en una caja de Coplin y se realizaron dos lavados con PBS 1x y uno con agua destilada con agitación durante 10 minutos. Posteriormente se dejaron secar a 37 C por 15 minutos, se agregaron 20µl de anticuerpo secundario Dylight-488 (Inmuno Research, País: USA) de burro anti IgG de conejo en una concentración 1:200 y se incubaron durante 30 minutos a 37 C en una cámara húmeda. Finalmente se realizaron en una caja coplin dos lavados con PBS 1x y uno con agua destilada con agitación durante 10 minutos y se dejaron secar con luz baja. Una vez que las laminillas estaban secas se procedió a examinarlas en un microscopio de fluorescencia Marca Leica Modelo DM 2500 B. con objetivo 100x usando glicerina/pbs 2x en una concentración 1:1 y con un filtro específico para Dylight-488. Las imágenes fueron obtenidas en una cámara digital modelo MOD DFC 450C, marca Leica y procesadas en un software Firewire BB. 43

45 VIII. Resultados Análisis bioinformático del gen ron2 en Babesia bigemina Los resultados del análisis Blast de la secuencia de la proteína RON2 de Plasmodium falciparum obtenida en la base de datos NCBI (figura 4) contra el genoma de B. bigemina indicaron la presencia de una secuencia en el contig 3449 con un porcentaje de similitud del 58% (figura 5). Se realizó un análisis con el programa ORF Finder para localizar marcos abiertos de lectura y se identificó un ORF en el marco 1 sentido (figura 6). La secuencia seleccionada consta de 4056pb (figura 7) que codifican para 1351aa (figura 8). IKDGYLSESEREYARNKANEIEDKMKKGEYSRKYKNSKSNESGYASKQTSDSDDSDIEANAFYVDNGQEM LIKEKEHYSSDSEYHKEESASIGNLNVFFPAENYHFSTYMGFDRRSFLPSNEIELEKMIGANFSNEVKNY CSRQNVAQKIGDYLNISFEYSRALEELRSEMILDFNKRKHLTNNTDDTILHMIENAEKRKNDPNYKEAYE NKDYANNANIFMNEYSNPLSTKYNKILKEYLCHLFVNNPGTKPLERLYYNSLALGELVEPIRNKFKSLAS STIDFNYEIHMASASNIYLLAHFLVLSLAYLSYNEYFTTGTKSFYSLPTILTANSDNSFFMLNEMCNIHY NPNKNFKKDITFIPIESRPKRTTTFYGERRLTCDLLELVLNAIMLININEINNVFSNNNVDGYENSLSFS HNAIRIFSKVCPKINNDNVLKCEFEESSLYNPKIIKNDTSEKSSQKNLKKAFDLLRTYAEIEGHSAEGST SPYYVSLILDDMKYNDFYKYTLWYEPRELIYGDIRGMQMKKKKKTKYIYNDFMKKSTQLKKKLIKNDLKY NLKSKGLVFLYAMIDKYGSILNKSQKAKVQFLNSTSSIRYYLYLNKVIFKSAKTYLDIMKRVLEELQTST NTPLKFLVRGNYIGNINNIARNDNMFYANLFVLTALSRRDPVKDYYNDKRKMLSATLAEKFANSTSMLIP HKLRKLVVSMKKGLLKKKLLTSLAKVKLLQHIPAHMLENITSSIRFTTHTIATMQIIQNAKYMSKHNFSQ YDSKGMLARQIFTKGGFAEYADNLMAKWFSKGFEEYKREQIENFKMENSIDSELKDSEREDENDSSEESA KKKLQDLQLEEREKMKKENSLLFNQSDKWDQFINKELVRALGLWLEFNDNPTNASSFVYKVVEDSKHLLE NNIDNNIIFSRTVKPTKQTAFRRFFNKILSLGNMLLRKPSFRVEHALWFGATIDIKKAFILLEKVSELHK MLNNQDESWLINEAFIEIVDHVVDLSTYKHVREPFGVARNPGMMAINPKYAELSHENRLRELQNSMCADH CSSVWKVISSFALHHLKNPDSLHTYESKFSKNSFGNKIDDKDFVHNFKMILGGDAVLHYFDNLLPKTMKK DLKAMKYGVSLTSAYSLKLTKIIFSQMQLPYLSQMFYMQAPYFGHFIGKWQKKRQQSRLKEIMSFMTLGS LSAYTLFSAMDITQQAKDIGAGPVASCFTTRMSPPQQICLNSVVNTALSTSTQSAMKCVFSVGLFASIGP YLFAPMAGLAVWNILKSEFKVLQRIDMALKNVFKNMWNKFLSLKGISKLRGIFKRKKAMKKKIIENATRK MNDMKNNPEKAKAHKMALKKINNYSKGSYHYISYAKIRI Figura 4. Secuencia de la proteína RON2 de Plasmodium falciparum. Número de acceso del Genebank:BAH

46 Figura 5. Resultado del análisis Blast de la secuencia RON2 de Plasmodium falciparum con el genoma de Babesia bigemina. 45

47 Figura 6. Análisis en ORF Finder ATGACGCGATCGATGAGAGGATGCGTGCGTCTGATCGCCGCAGCCATCTACCTCGCGATCCACTGCGATG TGTATGCCTATAGGGACGTAAAAGGCGGTGGAATTGGCGCCAATGGAGCTGTTTCAGTTCCCGTGGGAGC TGCCGATTACGCGAAACTCAAGTTTCTCGACGCAATCAGCGGCACTAAATCCGAAGAGGAAACTAAAAGC GCGGAATGGATCGAAACACCAGAAGGAATGATCGCAGCACCAAAAGGAGGAGACCAAGAGAACAATCAAA CTGAGGTTGCACCGGAAGGGGACAATGTGCAGGCTGATTCACTTGAGGCAGACTTGTCTGCACAGCCTCT TAGAGATCATGCGGCAGTCGGCAGTGGTGAAAACATCGCAGTGCTCGAACGCAGTGTCGGCATAAAGGGG TTCATGGAGCCCTTTATAAACAGCCTCAGCACCGACCTTCGCTACATGTTACTCAAGCAAACAGGCACCA ACTTCCTTCATGTCTACCGGAAATACGCTCTAAAGCTCGAAACCCTAGAGGCGCCAGTTTACCGGAAGAT GGTGAAACTGGTGGAGGAGAAAGCGGATGCAATCGGCTTTGTTGATTTCAGCGAAAAAAGAAGGAACAAC CTCATGCCAGAGGTCAATCAGGAGGCCATGAAGGTGGCAGGAATAACTTCGCTCCTTCAAATTGGTACCG AGGTAGCCTTTCCCAAGTTGAAAAAGGCTGCGAAGTCAAAGAAAGAAAACAATGTCACAAAGGTGGCAGA GGTCAAGGAACAACCGAAGACCGTCAAGGAGGAACCAAAGACGGTCAACGAACCTCAACCATTACCGGTG TTCGAGCCGTGGAGAAAAAACACAGAGGTGCTTGAAGCGATGCTTATCAAAGTGCTGTTTTTATTGGGAG GAGACAAGCATACACTTGATGTCTCCGATAGGCTGCGCAACATGGCGAGGGCACTAGGGTTCAGGAAAAA GGAAGAATCTGAAAAGAAGGCTGAGAAGAGCTCAACAGCCATGAACCTTGGGATGGAGCTTTTCGCCGCC TGTGGGAACAATCCTTTCCTGCTCGGTCATCTGGCGACGAACATGTTAGCGTATACCCAGTACAAGCTCT TCTTTGATGGTGATCAGGGCAGGCCATTCTACACGTGGTTGGATCTTGTTAAGTCCGGGAACCTCGACAT GCTCGACAGAATGTGTGGTACTATACGGGGGCCCAAATACAAGAGGGATTCCAATGGAGCAGTCACGGTC AACAAAAATAGGAAACGCAAAGACGATCCGCAGCTCAACGCGGATGGTGTCTTTCTATGCAACCTGCTGG AAGTGCTCCTAGTTTCGATTGATGCCTCTATAGACGCCATGGGGCAGTTGCTCAGCCAATACGGTGTGCC GTATGAGCACAGTGTCGGTGCTATCGCGAACGGCAGACGTATGCAGGCATTCGTGTGCTCTGATCCCAGG GAATCGGCAATTGTTGTCAGGTGTGACTTTATGTCTAGCACGCTCAACTCAAGTAAAATATTCGAGGGCA AATCCAAATACGAGGGAGAAGAACTCTGGCAACGACTCCAAGATGCGTTCGATCTCTTTAAGCTCTTGAG TGACGTTAGCCTGGATGGGGAAATACCAACCACCTGGTTAAGGATGATTTCAGACCCTCGCAAGTATGCA ACCGTGTTCGAATACGCAGTCAAATTCGACAATAGGATGTTTGCAGGTAAAAAGAAATCGTGGATGTCGG AGTATAAAAAGGTCGAAGATAAATTTATTTCATCGAACTATAGCGGGAATATCGACCTTAACACAGCCAT GTCGTTGCTGAAAAGCGGAGGACAGAAGGCAAAAACAGGAACGGATGATTCACTCAAAAGGGCATTACTC TATATGTCAGCTTCTGGAATCAAAACGTGGGTGTCGGGCAATCTTGAAGGTCTCCAGAAAAATTTTGGTT TCTCGCCTTCCGTACTGTTGGCAGGGAACTTAGCGCCGTACTTCAGACAGGTTGCGCAAACCACCAGCGG TGGATTGAGCCACATCTTCTTGTACCACATGCTTACCTCTCCGACTCCTGCCTATCATTTCCAATCTGAC CTCAGCAGTTTCAGAGGGGGCAACCTATTGTACAACATTGTAGAGTCGTCGAACATGTTCATACCCGCTA GTCTCAAGAGAGGAATCAAATGGTTGCTCAAAGGAGGACTGGCGAAGGAATTCAGGCGCGAAAAGGCCAA ACACACGTTGTTGCAACTGTTGCCGGTTGAATTGCTGAGGAAGGCTGTAGGTGCCATTACTTTCGTAACT CACTCGCTCGCCGATATGCAAATTAATCAGAACGCACCTATTTGGGGACGCGGTATGATGTCGGCAAAGC AGAGAGAACACAAACATTTCGTTAACGGGGGTTATGTTAATCATGTCGACACAATCATCAAGGAATGGTC AGACGAGGGCTACACGGATGCTATAGCTAAAAAGGTCCAGCATGGAGATGACCTCAACAAAGAAGATCTG AAAAATGCCGATATGCATCACATAGCGCATTCAGAATCTCTGAAGTGGGACAAATACCTGAACGCACGCA TACTAGAAGGTTACAATGCATTCCTTGACATGCCCTCCATGAAGGTGCTTGAGGGAAAGCACTCACTGGT ATACGAAATTGTGAAGGATACCAGGGACAACCTCGAGCAAAACCTAGGCGATACAGTGTTCTTTGGACGC GTGGTGCCACCGCCAGTTTACAACAACAAGTGGAAAAGGTTTTTGCAGAGGGCTAGCAAAGTGAAGAAGA TTGTGTTCCACAGGTCTCTGCAAAACGTCGAGCATGCTGTTTGGTTTGGCATCAAACTCAATTATAAGCA CGTCGTGGAGGTGGTCGAGGAACTCAACAAAATATCAAACCTCATATCGTCCACAGAATCGTACAACCTC CAGGAAGCGTTCGGCCATATCATTGACGACGCTGTCGCCGTTGTTGCGAACGAAGAGTTCAGGCGGCCCA GTGGAACTCAGGAGAACTTTGGAATACCCAGCGTCAACCCGTTGTACACGAGAATGACTCCGGACGAAAG AAAGGTTGAATTCCAGCAAGGTATGTGCGGCCAGCACTGTGGAGCCATCTGGAGGGCTCTATTGGCGTTC ACCATGAACACCATGCGGAGCCCAGCGTCGATTAAGACGTTTGAAAAGTCGCTCAGTCAGAACAACACTC TCCAAGACATGGAAAAACCGGAATTTGTTAACTCAATGAGGTTTATTCTCAAGGGTGATGCGATGCTTCA CATGTACGACAGTATGCTGCCGAAGAAAATGAAGAACGAACTCAGGGCCATAAAATATGGAAAGGCCTTC TACTTCGCAAACATTATGAAAGTGGCCTCTAATGTGCTGGGCATCCTGGGTTACAGGTACACGTCCAACA TGCTACGAATACAGGCGCCCTACTTCGGCAACTTCGTTGTTCAGTGGGATAGGGAGAGGGAAAAGTCGAG GTCGAAAGCCATATTTGCTTACCTGTCCATAGGAACAATGGCCGCGTACTCTGTCATGCAGTGTGCGGAG ATCACGCAGCACGCAGCGGACGTTGGTCAGGGGCCAGTGGAGTCGTGCTTCATGCTCATCAAGCCTCCAA GGATGCACTGTTTGCTCCAACCAGCCGAAACAATTGTGAAGACGGCACTGTCCATTGGGGTGCAGGATGC CCTCTCCGTCACTGTCATGGCGGTTATAGGACCCTACTTCTTCTTGCCCATGGCGGCGTACGCCTCGTGG CAGATTCTCAAGCACCACTTCAAGGTCATACACCGCTTAGATATCGCTCTGTCAAACACTTTCAAACGGA TGTGGAGCAAGATCTCCGCCTCGTCTATCGGTAAAAAACTCACTGCGTGGTTCAAGAAGCGCCGTGAGCA TCGCAAGGACATCGAATCCAAGGGATTGTTAGCCATGAAAAACCAGCAGCCCACCAACGAAGAATCGGGC GCTGTTGCGGTGGCGGACGAGATGCTTAAGTCGGACGACTACTTCTCGTACACTAGCTTCGGCTGA Figura 7. Secuencia nucleotídica encontrada mediante el programa ORF Finder. 46

48 MTRSMRGCVRLIAAAIYLAIHCDVYAYRDVKGGGIGANGAVSVPVGAADYAKLKFLDAISGTKSEEETKS AEWIETPEGMIAAPKGGDQENNQTEVAPEGDNVQADSLEADLSAQPLRDHAAVGSGENIAVLERSVGIKG FMEPFINSLSTDLRYMLLKQTGTNFLHVYRKYALKLETLEAPVYRKMVKLVEEKADAIGFVDFSEKRRNN LMPEVNQEAMKVAGITSLLQIGTEVAFPKLKKAAKSKKENNVTKVAEVKEQPKTVKEEPKTVNEPQPLPV FEPWRKNTEVLEAMLIKVLFLLGGDKHTLDVSDRLRNMARALGFRKKEESEKKAEKSSTAMNLGMELFAA CGNNPFLLGHLATNMLAYTQYKLFFDGDQGRPFYTWLDLVKSGNLDMLDRMCGTIRGPKYKRDSNGAVTV NKNRKRKDDPQLNADGVFLCNLLEVLLVSIDASIDAMGQLLSQYGVPYEHSVGAIANGRRMQAFVCSDPR ESAIVVRCDFMSSTLNSSKIFEGKSKYEGEELWQRLQDAFDLFKLLSDVSLDGEIPTTWLRMISDPRKYA TVFEYAVKFDNRMFAGKKKSWMSEYKKVEDKFISSNYSGNIDLNTAMSLLKSGGQKAKTGTDDSLKRALL YMSASGIKTWVSGNLEGLQKNFGFSPSVLLAGNLAPYFRQVAQTTSGGLSHIFLYHMLTSPTPAYHFQSD LSSFRGGNLLYNIVESSNMFIPASLKRGIKWLLKGGLAKEFRREKAKHTLLQLLPVELLRKAVGAITFVT HSLADMQINQNAPIWGRGMMSAKQREHKHFVNGGYVNHVDTIIKEWSDEGYTDAIAKKVQHGDDLNKEDL KNADMHHIAHSESLKWDKYLNARILEGYNAFLDMPSMKVLEGKHSLVYEIVKDTRDNLEQNLGDTVFFGR VVPPPVYNNKWKRFLQRASKVKKIVFHRSLQNVEHAVWFGIKLNYKHVVEVVEELNKISNLISSTESYNL QEAFGHIIDDAVAVVANEEFRRPSGTQENFGIPSVNPLYTRMTPDERKVEFQQGMCGQHCGAIWRALLAF TMNTMRSPASIKTFEKSLSQNNTLQDMEKPEFVNSMRFILKGDAMLHMYDSMLPKKMKNELRAIKYGKAF YFANIMKVASNVLGILGYRYTSNMLRIQAPYFGNFVVQWDREREKSRSKAIFAYLSIGTMAAYSVMQCAE ITQHAADVGQGPVESCFMLIKPPRMHCLLQPAETIVKTALSIGVQDALSVTVMAVIGPYFFLPMAAYASW QILKHHFKVIHRLDIALSNTFKRMWSKISASSIGKKLTAWFKKRREHRKDIESKGLLAMKNQQPTNEESG AVAVADEMLKSDDYFSYTSFG Figura 8. Secuencia de aminoácidos encontrada mediante el programa ORF Finder. 47

49 El análisis de la presencia de un péptido señal mediante el programa SignalP mostró un péptido señal de 26 aminoácidos (Figura 9). Figura 9. Resultados de la identificación del péptido señal, mediante el programa SIGNAL P. 48

50 Los resultados del análisis de dominios de la proteína mediante en el programa bioinformático pfam indicaron la existencia de cuatro dominios (figura 10); un dominio significativo denominado CLAG que abarca del aminoácido del 688 al 1154 y tres dominios con valor no significativo denominados: Ferritin2 del aminoácido 143 al 236, CLAG del aminoácido 220 al 509 y DUF454 del aminoácido 1121 al Figura 10. Resultados del análisis de la presencia de dominios mediante el programa pfam. 49