Evaluación de la reacción cruzada entre anticuerpos que reconocen péptidos RAP-1 alfa y RON-2 DE Babesia bigemina y Babesia bovis

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1 Tlamati Sabiduría, Volumen 7 Número Especial 2 (2016) 4 Encuentro de Jóvenes Investigadores CONACYT Acapulco, Guerrero 21, 21 y 23 de septiembre 2016 Memorias Resumen Evaluación de la reacción cruzada entre anticuerpos que reconocen péptidos RAP-1 alfa y RON-2 DE Babesia bigemina y Babesia bovis Aquileo Pineda Betancourt Universidad Autónoma de Guerrero Unidad Académica de Medicina Veterinaria y Zootecnia No. 1 Programa de 3 er Verano de Investigación Científica Jóvenes de la UAGro por la Ciencia aquipinbet@gmail.com Área en la que participa: VI Biotecnología y Ciencias Agropecuarias Dr. Juan Joel Mosqueda Gualito Profesor- Investigador de la Universidad Autónoma de Querétaro joel.mosqueda@uaq.mx La babesiosis bovina es una enfermedad causada por un parásito protozoario del género Babesia y es transmitida por garrapatas del género Rhipicephalus (Boophilus), económicamente más importante en la ganadería. Actualmente no existen vacunas contra babesiosis disponibles comercialmente. Los principales agentes etiológicos de la enfermedad en México son Babesia bovis y B. bigemina, con la secuenciación del genoma se ha logrado identificar péptidos homólogos para estas dos especies en las proteínas RAP-1α y RON-2, que son consideradas candidatas vacúnales debido a su función de contacto, unión e invasión para la penetración del parasito. Sin embargo, se desconoce si los anticuerpos contra los péptidos RAP-1α y RON-2 de B. bigemina reconocen los péptidos homólogos de B. bovis. El objetivo de esta investigación fue evaluar la reacción cruzada de los anticuerpos que reconocen péptidos RAP-1α y RON-2 de B. bigemina y B. bovis. Se incubo los anticuerpos contra epítopos de RAP-1α y RON-2 de B. bigemina en el antígeno de B. bovis, mediante la técnica de inmunofluorescencia indirecta. Los resultados mostraron señales positivas al observar un patrón de tinción intenso y definido que corresponde a la posición de los merozoitos intraeritrocíticos en la parte apical del parasito. Palabras Clave: anticuerpos, RAP-1α, RON-2, Babesia, péptidos.

2 Introducción 4 Encuentro de Jóvenes Investigadores CONACYT Acapulco, Guerrero 21, 22 y 23 de septiembre 2016 La babesiosis bovina es una enfermedad causada por un protozoario intraeritrocítico obligado del género Babesia y es transmitida por garrapatas del género Rhipicephalus (Boophilus), se caracteriza por la presencia de fiebre, anemia, hemoglobinuria, ictericia y muerte. Se considera económicamente más importante en la ganadería en México debido a que se encuentra ampliamente distribuido el vector en zonas tropicales, subtropicales y templadas del país (Mosqueda et al, 2012; Valdez, 2015). A la fecha no existen vacunas recombinantes comerciales de ningún tipo en el mundo, por lo que es necesario el estudio de más antígenos del parasito que permitan la identificación de inmunógenos protectores, principalmente de aquellas proteínas involucradas en el proceso de invasión del protozoario a la célula hospedera. Los principales agentes etiológicos de la enfermedad en México son B. bovis y B. bigemina pertenecen al reino Protista, subreino Protozoa, Filo Apicomplexa, clase Sporozoa, subclase Piroplasmia, orden Piroplasmida, suborden piroplasmorina, familia babesiidae, género Babesia. Dentro del ciclo de vida los merozoitos son transmitidos a la garrapata cuando esta ingiere sangre de un animal infectado (Calvo, 2013; Mosqueda, 2014). Actualmente las herramientas basadas en la tecnología recombinante son una alternativa para la identificación de candidatos vacúnales y así determinar las regiones, péptidos o epítopos conservados que puedan ser usados como inmunógenos que generen anticuerpos específicos que confieran protección contra la babesiosis bovina (Valdez, 2015). Con la secuenciación del genoma se ha logrado identificar péptidos homólogos para B. bovis y B. bigemina en la proteína asociada a roptrías 1 (RAP-1, por sus siglas en ingles) que tiene la función de modificar la membrana de la célula huésped para la penetración del parásito y proteína de cuello de las roptrías (RON-2, por sus siglas en ingles) que tienen la función en el contacto y unión estrecha del parásito con la membrana de la célula huésped, que son consideradas candidatas vacúnales. Las proteínas de las roptrías son los organelos más grandes del complejo apical de Babesia, su número, tamaño y forma varía según la especie, se secretan durante la invasión de los eritrocitos y la formación de la vacuola parasitófora, después de las proteínas de las micronemas (Calvo, 2013; Valdez, 2015). En el presente trabajo de investigación se evalúa por primera vez, la reacción cruzada de los anticuerpos que reconocen péptidos RAP-1α y RON-2 de Babesia bigemina y Babesia bovis,

3 Tlamati Sabiduría Volumen 7 Número Especial 2 (2016) mediante el análisis por la técnica de Inmunofluorescencia Indirecta (IFI) y tinción de los núcleos con DAPI (4,6-diamino-2-fenilindol) para su observación en microscopio de fluorescencia. Materiales y Métodos El presente trabajo se realizó en el Laboratorio de Inmunología y Vacunas de la Facultad de Ciencias Naturales de la Universidad Autónoma de Querétaro. Se realizó un alineamiento de los péptidos de RAP-1α y RON-2 para Babesia bigemina seleccionando los péptidos con secuencias de aminoácidos conservados en Babesia bovis, obteniendo como anticuerpo primario para RAP-1α el péptido 4 (SSHGDYHHFVVSLLKKNVVRD) obtenido tras la inmunización del conejo 24 y 25, almacenado a -20 C; para RON-2 el péptido A (IPSVNPLYTRMTPDERKVEFQQ) obtenido por inmunización en el conejo 30 y 32, almacenado a -20 C. Como antígeno se utilizaron frotis con eritrocitos infectados con Babesia bovis almacenados a -20 C, también se utilizó un control negativo con suero del conejo 9 pre inmunización y un control positivo con suero del conejo 7 péptido AMA-1-3, asimismo como anticuerpo secundario anti-igg de conejo conjugado con Alexa Flúor 488 (Jackson InmunoResearch, USA) almacenados a -20 C. Además se utilizó colorante nuclear para teñir DNA de doble cadena el producto Invitrogen DAPI (4',6-Diamidino- 2-Phenylindole, Dihydrochloride) a dilución 1:1000. Todo el material antes mencionado fue proporcionado por el laboratorio. Inmunofluorescencia indirecta Mediante la técnica de Inmunofluorescencia indirecta se evaluó la reacción cruzada de los anticuerpos que reconocen péptidos RAP-1α y RON-2 de Babesia bigemina y Babesia bovis. La realización de la técnica fue la siguiente: Como antígeno se utilizaron frotis con eritrocitos infectados con Babesia bovis, que se encontraban almacenados a -20 C. Se descongelaron e inmediatamente se secaron las laminillas conteniendo el antígeno en una campana de flujo laminar durante 30 minutos. Posteriormente se permeabilizo las membranas de los eritrocitos sumergiendo las laminillas en acetona a 4 C durante 30 minutos dentro de un vaso de coplin.

4 4 Encuentro de Jóvenes Investigadores CONACYT Acapulco, Guerrero 21, 22 y 23 de septiembre 2016 Después de ese tiempo se dejaron secar nuevamente y se realizó el enmarcado circular con esmalte de uñas de los pozos donde se depositaran los sueros. El anticuerpo primario para los péptidos RAP-1α y RON-2, así como los sueros como control positivo y negativo se diluyeron 1:20. El anticuerpo secundario anti- IgG de conejo conjugado con Alexa Flúor 488 (Jackson InmunoResarch, USA) fue utilizado a una dilución de 1:100 en solución de bloqueo. El colorante nuclear para teñir DNA de doble cadena el producto Invitrogen DAPI (4',6-Diamidino-2- Phenylindole, Dihydrochloride) a dilución 1:1000. Se agregaron 30µl de la dilución 1:20 a cada pozo de los sueros. Se incubaron las laminillas en una cámara húmeda a 37 C por 30 minutos. Después se realizan tres lavados con PBS 1X Tween 0.01% (18.8 mm KH2PO4, 67.1 mm NaHPO4, 150 mm NaCl, Tween %) por 5 minutos cada uno en un agitador a 240 rpm (IKA KS 130 Basic). Se secaron nuevamente las laminillas y se agregaron 30µl de anticuerpo secundario diluido 1:100 y se incubo nuevamente en la cámara húmeda a 37 C por 30 minutos. Se realizaron tres lavados con PBS 1X Tween 0.01% por 5 minutos cada uno en un agitador a 240 rpm. Se dejaron secar nuevamente las laminillas y se agregaron 30µl de colorante nuclear Invitrogen DAPI a dilución de 1:1000 y se incubo en cámara húmeda a 37 C por 15 minutos. Se lavó una vez con PBS 1X Tween 0.01% por 5 minutos en un agitador a 240 rpm y finalmente se dejaron secar las laminillas. Para la lectura se agregó glicerina fosfatada (1:9 Glicerina:PBS 1X) en cada uno de los pozos. Se observó en un microscopio de fluorescencia de la marca Leica modelo DM2500 con objetivo de 100x.

5 Tlamati Sabiduría Volumen 7 Número Especial 2 (2016) Resultados Se identificaron las proteínas en merozoitos de Babesia bovis mediante los anticuerpos generados contra Babesia bigemina en cada uno de los péptidos utilizados, observándose así el anticuerpo secundario unido a un fluorocromo. Esto se detalla a continuación: A B C D Figura 1: Los anticuerpos contra el péptido RAP-1α del conejo 24 y 25 para Babesia bigemina reaccionan de manera cruzada reconociendo los merozoitos de Babesia bovis intraeritrocíticos mediante inmunofluorescencia indirecta. A) Suero con péptido 4 del conejo 24 con tinción DAPI. B) Suero con péptido 4 del conejo 24 con fluorocromo Alexa. C) Suero con péptido 4 del conejo 25 con tinción DAPI. D) Suero con péptido 4 del conejo 25 con fluorocromo Alexa. Objetivo 100x.

6 4 Encuentro de Jóvenes Investigadores CONACYT Acapulco, Guerrero 21, 22 y 23 de septiembre 2016 A B C D Figura 2: Los anticuerpos contra el péptido RON-2 del conejo 30 y 32 para Babesia bigemina reaccionan de manera cruzada reconociendo los merozoitos de Babesia bovis intraeritrocíticos mediante inmunofluorescencia indirecta. A) Suero con péptido A del conejo 30 con tinción DAPI. B) Suero con péptido A del conejo 30 con fluorocromo Alexa. C) Suero con péptido A del conejo 32 con tinción DAPI. D) Suero con péptido A del conejo 32 con fluorocromo Alexa. Objetivo 100x.

7 Tlamati Sabiduría Volumen 7 Número Especial 2 (2016) A B C D Figura 3: Los anticuerpos contra el péptido post inmunización del control positivo de Babesia bigemina reaccionan de manera cruzada reconociendo los merozoitos de Babesia bovis intraeritrocíticos mediante inmunofluorescencia indirecta. A) Suero con péptido AMA-1-3 del conejo 7 con tinción DAPI. B) Suero con péptido AMA-1-3 del conejo 7 con fluorocromo Alexa. C) Suero pre inmunización del conejo 9 con tinción DAPI. D) Suero pre inmunización del conejo 9 con fluorocromo Alexa. Objetivo 100x. El patrón de expresión identificado para la proteína RAP-1α y RON-2 con los anticuerpos generados con los péptidos utilizados corresponden con la tinción de las roptrías en los merozoitos que son organelos del complejo apical que se localizan en el extremo apical con la función de invasión del parasito como se ha descrito anteriormente. Por lo tanto los resultados de este trabajo sugieren que los anticuerpos generados reconocen un patrón de tinción consistente con los péptidos de RAP-1α y RON-2 mediante inmunofluorescencia indirecta con los sueros utilizados.

8 Discusión y conclusiones 4 Encuentro de Jóvenes Investigadores CONACYT Acapulco, Guerrero 21, 22 y 23 de septiembre 2016 Actualmente se han identificado proteínas estructurales y funcionales que pueden ser blancos para el desarrollo de métodos de control contra la babesiosis bovina. Estas proteínas son consideradas candidatas vacúnales anticuerpos neutralizantes. contra la Babesia por tener la capacidad de generar Por tal motivo, en este trabajo se planteó como objetivo evaluar la reacción cruzada de los anticuerpos que reconocen péptidos RAP-1α y RON-2 de Babesia bigemina y Babesia bovis, ya que ambas especies presentan regiones de aminoácidos conservadas. En conclusión, los anticuerpos contra los péptidos de RAP-1α y RON-2 de Babesia bigemina reaccionan de manera cruzada con los péptidos homólogos de Babesia bovis expresado en los merozoitos intraeritrocíticos y se inmunolocalizan en el complejo apical del protozoario. Agradecimientos A mis padres y hermanos por contar siempre con su apoyo y confianza para seguir preparándome. Quiero agradecer a mi máxima casa de estudios, la Universidad Autónoma de Guerrero por brindarme su apoyo para lograr realizar este verano de investigación. A la Unidad Académica de Medicina Veterinaria y Zootecnia No. 1 por brindarme su apoyo para la realización de esta investigación. A mi investigador el Dr. Juan Joel Mosqueda Gualito por permitirme ser parte de su laboratorio y todo ese tiempo dedicado, gracias por sus consejos y el conocimiento brindado. A mis compañeros veraniegos por compartir sus experiencias y hacer de este verano de investigación una aventura inolvidable. Quiero agradecer al Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología por el apoyo brindado para la realización de esta investigación. A mis profesores de la Unidad Académica de Medicina Veterinaria y Zootecnia No. 1 por su conocimiento brindado para mi formación profesional.

9 Tlamati Sabiduría Volumen 7 Número Especial 2 (2016) Referencias Calvo, D. (2013). Identificación y caracterización inmunomolecular de gen RON2 en Babesia bigemina.tesis de Licenciatura en Biología, Facultad de Ciencias Naturales, Universidad Autónoma de Querétaro, 9-22p. Mosqueda, J., Falcón, A., Ramos, J., Canto, G. y Camacho, M. (2012). Estrategias genómicas y moleculares para el control de la babesiosis bovina. Revista Mexicana de Ciencias Pecuarias, 3, Mosqueda, J., Paredes, M., Rocha, M. y Camacho, M. (2014). Caracterización inmunomolecular de HAP2; un gen nuevo de Babesia bigemina y su potencial como candidato vacunal. Revista 3, Valdez, U. (2015). Identificación de epítopos conservados en aislados de Babesia bigemina. Tesis de Maestría en Salud y Producción Animal, Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia, Universidad Nacional Autónoma de México, p.