Departamento de Química-Física, Universidad de Granada. OLM

Transcripción

1 II.3.2. Espectroscopia Ultravioleta/Visible (U/V). II Introducción. La absorción de radiación ultravioleta o visible proviene de la excitación de los electrones enlazantes y como consecuencia, las longitudes de onda de los picos de absorción pueden correlacionarse con los tipos de enlaces que existen en las especies en estudio. La espectroscopia de absorción molecular es por tanto valiosa para la identificación de los grupos funcionales de una molécula. Sin embargo, son más importantes las aplicaciones de la espectroscopia de absorción ultravioleta y visible para la determinación cuantitativa de compuestos que contienen grupos absorbentes o también llamados cromóforos. De hecho la aplicación mas generalizada de relevancia biológica es la medida de concentraciones de proteínas, NADH y ácidos nucleicos, porque en la mayoría de los casos hay una relación directa y simple entre el número de moléculas presentes y la absorción. No obstante, en algunos casos la absorción depende notablemente del entorno molecular; así los cambios en el espectro con cambios de entorno pueden interpretarse en términos de procesos tales como fusión de ácidos nucleicos, interacciones proteína-ligandos (ensayos de actividad enzimática, enzima-cofactor, activador, inhibidor), etc. El espectro UV/V de un biopolímero es una huella dactilar y como tal puede usarse en ocasiones para identificarlo. La gran utilidad de tales medidas radica en la alta sensibilidad, la sencillez de la medida y el hecho de hacerse en disolución; aunque no es posible estas medidas en sistemas biológicos intactos, es decir in vivo, tales como tejidos debido a que esta radiación es fuertemente dispersada. II Parámetros de los espectros electrónicos. Los espectros electrónicos se representan normalmente como una grafica de la absorbancia o densidad óptica, definida en la tabla II.3.2.I, frente a la longitud de onda de la radiación incidente, frecuentemente expresada en nm. Dos parámetros caracterizan una determina da banda espectral, la posición del máximo, λ máx, y su intensidad. En la tabla II.3.2.I se recogen todos los parámetros que se usan en este tipo de espectroscopia. Los nombres de los parámetros en la columna de la izquierda responde a la terminología recomendada por Analytical Chemistry (Anal. Chem., 1990, 62, 91.). En la figura II se representa un esquema que ilustra alguna de las definiciones de la tabla II.3.2.I. 200

2 TABLA II.3.2.I Términos y símbolos de los parámetros más importantes utilizados en la espectroscopia electrónica. Parámetros a Definición Términos alternativos Potencia radiante, P, P 0 Absorbancia, A Energía (en joules) de la radiación incidente en el detector, por m 2 y por s. log P 0 P Intensidad de radiación, I, I 0 Densidad óptica, D; extinción, E Transmitancia, T P log 0 Transmisión, T P Longitud de la trayectoria de la radiación en cm, b l, d Absortividad, a Absortividad molarc, Є A ; c en g.l -1, b en cm bc A ; c en mol.l -1, b en cm bc Coeficiente de extinción, k Coeficiente de extinción molar b P 0 P Disolución conteniendo moléculas absorbentes de la radiación UV/V. Célula espectrofotométrica de cuarzo. Figura II Atenuación de un haz de radiación por una solución absorbente. 201

3 II Fundamentos de la espectroscopia electrónica. Una descripción rigurosa de la espectroscopia de absorción U/V de los estados electrónicos requiere el uso de conceptos mecanocuánticos tales como la especificación de las moléculas mediante funciones de onda y el uso del momento dipolar de transición que determina la probabilidad de transición entre estados electrónicos. No obstante para los propósitos de este curso vamos a optar por una descripción menos teórica, con un enfoque mas aplicado, en definitiva más próximo al usuario no especialista. El primer aspecto a tener en cuenta es el de la comparación del tiempo característico de una transición electrónica con el tiempo característico de una vibración molecular. El principio de Franck-Condon establece que una transición electrónica ocurre tan rápidamente que durante dicha transición los núcleos son estáticos. Puesto que las vibraciones moleculares implican cambios en las distancias internucleares, y éstos no pueden ocurrir en la escala de tiempo de las transiciones electrónicas, se infiere que las transiciones electrónicas no se mezclan o están acompañadas de transiciones vibracionales. Hay que considerar tres tipos de transiciones electrónicas y clasificar las especies absorbentes en base a ellas. Las tres transiciones consideradas implican I: electrones π, σ y n, II: electrones d y f y III: electrones de transferencia de carga. De estos tres tipos de transiciones el tipo I es el más relevante desde un punto de vista biológico. II I: Transiciones electrónicas que implican electrones π, σ y n Los orbitales moleculares asociados a los enlaces sencillos se designan como orbitales sigma, σ, y los electrones correspondientes son los electrones σ. Tal como se muestra en la Figura II a, la distribución de densidad de carga de un orbital sigma es rotacionalmente simétrica alrededor del eje del enlace. Aquí, la densidad de carga negativa promedio que surge de la localización de los dos electrones del enlace alrededor de los dos nucleos positivos se indica por la intensidad del sombreado. El doble enlace en una molécula orgánica contiene dos tipos de orbitales moleculares; un orbital sigma (σ) correspondiente a un par de electrones enlazantes y un orbital molecular pi, π, asociado al otro par. Los orbitales pi se forman por la superposición paralela de orbitales atómicos p. Su distribución de carga se caracteriza por un plano nodal (una región de baja densidad de carga) a lo largo del eje del enlace y una densidad máxima en las regiones por encima y por debajo del plano (ver Figura II b). Además de los orbitales moleculares enlazantes citados existen los orbitales sigma y pi antienlazantes, que se designan por σ* y π*. En las Figuras II c y II d, se muestran las distribuciones de densidad de carga para σ* y π*. Muchos compuestos orgánicos contienen electrones no enlazantes. Estos electrones que no participan en enlaces se designan por el símbolo n. 202

4 Figura II Densidad electrónica de los orbitales σ, π, σ* y π*. Tal como se muestra en la Figura II , las energías de los diferentes tipos de orbitales moleculares difieren significativamente. Generalmente, el nivel de energía de un electrón no enlazante está entre los de los orbitales enlazantes y antienlazantes π y σ. Son posibles cuatro tipos de transiciones: σ σ*, n σ*, n π* y π π*. Transiciones σ σ*. En estas transiciones, un electrón de una molécula en un orbital σ enlazante es excitado al correspondiente orbital antienlazante σ* por absorción de radiación. Respecto a otras posibles transiciones, la energía necesaria para provocar una transición σ σ* es grande y corresponde a radiaciones de frecuencias en la región del ultravioleta de vacío. El máximo de absorción debido a transiciones σ σ* nunca se observa en la región del ultravioleta accesible ordinario; por esta razón, no se tratará este tipo de absorción. Transiciones n σ*. Los compuestos saturados que contienen átomos con pares de electrones no enlazantes son capaces de dar transiciones n σ*. En general, estas transiciones requieren menos energía que las del tipo σ σ* y pueden producirse por radiación de la región entre 150 y 250 nm, apareciendo la mayoría de los picos de absorción por debajo de 200 nm. La energía de tales transiciones dependen en primer lugar del tipo de enlace atómico y en menor extensión de la estructura de la molécula. Las absortividades molares (concepto que explicaremos en breve) asociadas con este tipo de absorción son de baja a intermedia magnitud y el intervalo usual es entre 100 y 3000 L cm -1 mol -1. Los máximos de absorción para estas transiciones tienden a desplazarse hacia longitudes de onda más cortas en presencia de disolventes polares como el agua y el etanol. El número de grupos funcionales orgánicos con picos n σ* en la región ultravioleta fácilmente accesible es relativamente pequeño. 203

5 Figura II Niveles de energía de los orbitales moleculares n, σ, π, σ* y π* y transiciones electrónicas permitidas por las reglas de selección que predice la descripción mecanocuántica. Transiciones n π* y π π*. La mayoría de las aplicaciones de la espectroscopia de absorción a compuestos orgánicos se basa en transiciones de electrones n o π al estado excitado π*, ya que las energías que se requieren para estos procesos conducen a picos en una región espectral conveniente experimentalmente (200 a 700 nm). Ambas transiciones requieren la presencia de un grupo funcional que suministre los orbitales π. Hablando estrictamente, es a estos centros absorbentes insaturados a los que se les aplica el término cromóforo. II II: Transiciones electrónicas que implican electrones d y f La mayoría de los iones de los metales de transición absorben en la región ultravioleta o visible del espectro electromagnético. Para las series de los lantánidos y actínidos, los procesos de absorción resultan de transiciones electrónicas de electrones 4f y 5f; para los elementos de la primera y segunda serie de los metales de transición, los responsables son los electrones 3d y 4d. Desde un punto de vista biológico lo más relevante es la absorción por elementos de la primera y segunda serie de metales de transición. Los iones y complejos de los 20 elementos de las dos primeras series de transición tienden a absorber radiación visible en uno, sino en todos, sus estados de oxidación. Los metales de la series de transición se caracterizan por tener cinco orbitales d parcialmente ocupados (3d en la primera serie y 4d en la segunda), cada uno de ellos capaz de acomodar un par de electrones. Los electrones de estos orbitales no participan, generalmente, en la formación de enlaces; no obstante, está claro que las características espectrales de los metales de transición implican transiciones electrónicas entre los niveles de energía de estos orbitales d. 204

6 Se han propuesto dos teorías para explicar la absorción de radiación de los iones de los metales de transición y la profunda influencia del entorno químico sobre las longitudes de onda correspondientes; a saber, la teoría del campo cristalino, que es la más sencilla y es adecuada desde un punto de vista cualitativo; y el tratamiento más riguroso y complejo a partir de la teoría de orbitales moleculares, que un mejor tratamiento cuantitativo del fenómeno. Ambas teorías se basan en la premisa de que las energías de los orbitales d de los iones de los metales de transición en solución no son idénticas y que la absorción implica la transición de electrones desde un orbital d de baja energía a uno de energía superior. En ausencia de un campo magnético o eléctrico externo (como en el estado gaseoso diluido), las energías de los cinco orbitales d son idénticas y no es necesaria la absorción de la radiación para mover un electrón de un orbital a otro. Por otro lado, cuando tiene lugar la formación de complejos en solución entre el ión metálico y agua o algún otro ligando, tiene lugar la separación de la energía de los orbitales. Este efecto resulta de las fuerzas diferenciales de repulsión electrostática entre el par de electrones del dador y los electrones de los diversos orbitales d del ión metálico central. Esta separación de energías, se explica considerando la distribución espacial de los electrones en los diversos orbitales d; aunque no entramos en detalles en la figura II mostramos el efecto del campo ligando sobre los niveles de energía para la configuración octaédrica de complejos con un número de coordinación 6 y para la configuración tetraédrica y plano-cuadrada de complejos con un número de coordinación 4. Podemos observar que las energías de todos los orbitales d aumenta en presencia de un campo ligando pero, además, que los orbitales d se dividen en niveles que difieren en un de energía que determina lo que se llama fuerza del campo ligando. Figura II Efecto del campo ligando sobre los niveles de energía de los orbitales d. 205

7 II III: Absorción por transferencia de carga. Para que un complejo presente un espectro de transferencia de carga, es necesario que uno de sus componentes tenga características de dador de electrones y el otro componente tenga propiedades de aceptor de electrones. La absorción de la radiación implica entonces la transferencia de un electrón desde el dador hasta un orbital que está muy asociado con el aceptor. En consecuencia, el estado excitado es el producto de un tipo de proceso de oxidación/reducción interno. Este comportamiento difiere del de un cromóforo orgánico, donde el electrón en el estado excitado está en un orbital molecular formado por dos o más átomos. Las especies que presentan absorción por transferencia de carga tienen particular importancia, con fines analíticos, ya que las absortividades molares son muy altas (Є máx > ). Así, estos complejos suministran unos medios de elevadísima sensibilidad para la detección y determinación de especies absorbentes. Muchos complejos inorgánicos presentan absorción por transferencia de carga y se llaman por tanto complejos de transferencia de carga. Los ejemplos comunes de tales complejos incluyen los complejos fenólico y de tiocianato del hierro(iii), el complejo de o-fenantronila del hierro(ii), el complejo de ioduro del iodo molecular y el complejo ferro/ferricianuro responsable del color azul de Prusia. Un ejemplo bien conocido de absorción por transferencia de carga se observa en el complejo hierro(iii)/tiocianato. La absorción de un fotón da lugar a la transferencia de un electrón del tiocianato a un orbital asociado con el hierrro (III). El producto es por tanto una especie excitada que implica predominantemente al ion hierro(ii) y al radical neutro tiocianato SCN. Como con otros tipos de excitación electrónica, el electrón, en condiciones ordinarias, vuelve a su estado original tras un breve período. Ocasionalmente, sin embargo, puede tener lugar la disociación de un complejo excitado, dando productos de oxidación/reducción fotoquímica. Los compuestos orgánicos forman complejos de transferencia de carga muy interesantes. Un ejemplo es la quinidrona (un complejo 1:1 de quinona e hidroquinona), que muestra una fuerte absorción en la región visible. Otros ejemplos incluyen complejos de iodo con las aminas, los compuestos aromáticos y los sulfuros, entre otros. La transferencia de carga es también importante en hemo-proteínas, algunas bandas bastantes intensas del anillo porfirínico de estas proteínas son debidas a procesos de transferencia de carga. II Cromóforos de interés en biopolímeros. La mayoría de los biopolímeros no absorben luz visible; solo algunas proteínas que contienen grupos prostéticos, tales como el grupo hemo, PLP(fosfato de piridoxal), flavinas,etc., o metales tales como Cu y Fe, presentan color. En estos casos la radiación visible es útil para estudiar cambios o reacciones en el entorno del grupo prostético o metal; un ejemplo bien conocido y perfectamente caracterizado es el de oxigenación de la hemoglobina. La mayoría de las aplicaciones en bioquímica usa la región ultravioleta y en lo sucesivo nos vamos a referir a los cromóforos activos en esta región. Podemos clasificar los grupos cromóforos de interés biológico en tres categorías: I. El enlace peptídico y los aminoácidos en proteínas. II. Bases púricas y pirimidinicas en ácidos nucleicos. III. Sistemas altamente conjugados. 206

8 II I. Transiciones del enlace peptídico y los aminoácidos en proteínas. Los electrones π del enlace peptídico, deslocalizados entre los átomos de O, C y N, dan lugar a la transición principal π π* de este grupo molecular, la banda se observa a 190 nm con una absortividad molar de Є 7000 cm 2.mol -1. Otra transición del grupo peptídico observada entre 210 y 220 nm, que corresponde a una transición prohibida por las reglas de selección, y por lo tanto de baja probabilidad, es n π*. Presenta, como es de esperar un coeficiente de extinción molar pequeño, Є 100 cm 2.mol -1. Las cadenas laterales de aminoácidos tales como His, Arg, Glu, Gln, Asn y Asp, tienen transiciones en el entorno de 210 nm. No obstante, estas absorciones no pueden observarse normalmente en proteínas porque están enmascaradas por la absorción más intensa de los grupos amida del esqueleto polipeptídico, mucho mas numerosos. El rango de la radiación UV más útil está por encima de los 230 nm, donde la absorción del grupo peptídico se reduce a valores despreciables. Así en el intervalo nm del la región UV cercana absorben las cadenas laterales de los aminoácidos aromáticos Phe, Tyr y Trp, y de His; también los puentes disulfuro. Ver figura II.3.2.5, y tabla II.3.2.II. Figura II Espectros UV de los aminoácidos Phe, Tyr y Trp a ph neutro. Téngase en cuenta la escala logarítmica usada para Є por razones de conveniencia en la visualización de los tres espectros. Si tenemos en cuenta la escala logarítmica de la figura II se entenderá fácilmente que el triptófano es el cromóforo que presenta con diferencia la mayor absortividad, en el intervalo de λ considerado. Cuando este aminoácido está presente en la secuencia de una determinada proteína es posible determinar con gran exactitud la concentración del 207

9 biopolímero midiendo la absorbancia a 280 nm. En aquellas proteínas que no contienen Trp pero contienen Tyr, es posible y fiable determinar concentraciones a través de la absorbancia a 280 nm. La Tyr, aunque con un coeficiente de extinción menor que el de Trp, presenta una absorción importante a esta λ. La absortividad de la Phe es mucho mas pequeña que las de Trp y Tyr, por lo que es prácticamente observar su contribución si cualquiera de los otros dos aminoácidos están presentes. La cadena lateral de la Cys no presenta una banda de absorción útil en proteínas porque su principal transición está sumergida en la región peptídico; no obstante, los puentes disulfuro presentan una absortividad de Є 300 cm 2.mol -1 a 250 nm. Aunque esta absorción no es lo suficientemente fuerte para se útil en medidas de concentración, si tienen aplicación en medidas de actividad óptica (DC y DOR). TABLA II.3.2.II Máximos de absorción y coeficiente de extinción molar de varios aminoácidos a ph neutro Molecula λ máx (nm) Є a λ máx (cm 2.mol -1 ) Triptófano Tirosina Fenilalanina Histidina Cistina II II. Transiciones en ácidos nucleicos. La absorción de ácidos nucleicos también proviene de las transiciones electrónicas n π* y π π*. Los espectros de las bases púricas y pirimidínicas abarcan el intervalo 200 a 300. Los máximos y coeficientes de absorción para estas bases se dan en las tabla II No obstante estos valores se modifican notablemente cuando estas bases forman parte de las cadenas de polinucleotidos debido a que la interacción entre bases produce los fenómenos conocidos como hipocromismo e hipercromismo. El término hipocromismo significa que la intensidad de absorción de una muestra es menor que la suma de sus partes constituyentes. El término hipercromismo justo lo contrario. Una descripción mecanocuántica de estos fenómenos, especificando como la función de onda de un cromóforo se altera por la presencia de otros cromóforos vecinos, es posible (Box 7-3. Theory of Hypochromism. Biophysical Chemistry. PartII, Cantor and chimmel) Cualitativamente estos fenómenos se explican en términos de inducción de dipolos instantáneos; un determinado cromóforo polariza instantáneamente los electrones de un cromóforo vecino induciendo así un momento dipolar instantáneo. Dependiendo del ordenamiento espacial del cromo y de sus vecinos pueden observarse para dicho cromóforo un 208

10 momento dipolar de transición, µ ab, neto mayor o menor, tal como se ilustra en la figura II para dos ordenamientos límites. a) b) Figura II Diagrama representando esquemáticamente el fenómeno del hipocromismo e hipercromismo.a) Ordenamiento paralelo de los dipolos inducidos y del momento dipolar de transición µ ab (color rojo) produciendo hipocromismo. b) Ordenamiento colineal de los dipolos inducidos y del momento dipolar de transición µ ab (color rojo) produciendo hipercromismo. En las hélices con bases apiladas o en las dobles hélices de los ácidos nucleicos los momentos dipolares inducidos y los µ ab de transición se disponen en paralelamente, como consecuencia se produce hipocromismo y el momento dipolar de transición observado es menor del que tendría el cromóforo aislado. II I. Transiciones en sistemas altamente conjugados. En las moléculas que contienen muchos grupos insaturados, todos ellos conjugados, el espectro cae con frecuencia en el intervalo visible del espectro. Esto es consecuencia del alto grado de deslocalización de los electrones y la consiguiente disminución de la energía requerida para una transición electrónica. Un ejemplo bien conocido es el del anillo porfirínico de los grupos hemos, responsable del color de las hemoproteínas (hemoglobinas, hemocianinas, citocromo C, etc.), figura II

11 TABLA II.3.2.III Máximos de absorción y coeficiente de extinción molar de bases púricas y pirimidínicas y sus derivados. Molecula λ máx (nm) Є a λ máx (cm 2.mol -1 ) Adenina Adenosina NADH Guanina Guanosina Citosina Citidina Uracilo Uridina Timina Timidita DNA RNA Figura II Fe-protoporfirina IX o grupo Hemo, un sistema altamente conjugado. 210

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