Obtención de Secuencias de DNAr ITS y LSU para la Identificación de un Aislado de Nematodo Entomopatógeno Nativo (Rhabditida: Steinernematidae).

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1 Obtención de Secuencias de DNAr ITS y LSU para la Identificación de un Aislado de Nematodo Entomopatógeno Nativo (Rhabditida: Steinernematidae). Mariana del Carmen Orozco Uribe 1, Eva Judith Hueso Guerrero 2, Jalil Fallad Chávez 2, Teodulfo Aquino Bolaños 3, Georgina Vargas Amado 1, Alma Rosa Villalobos Arámbula 1 (avillal@cucba.udg.mx). Departamento Biología Celular y Molecular 1, Centro Universitario Ciencias Biológicas y Agropecuarias; Departamento Producción Agrícola 2, Centro Universitario de la Costa Sur; Universidad de Guadalajara. Centro Interdisciplinario de Investigación para el Desarrollo Regional Oaxaca Instituto Politécnico Nacional (CIIDIR, IPN, Unidad Oaxaca) 3. Introducción Los nematodos entomopatógenos (NEP) están ampliamente distribuidos alrededor del mundo y tienen un amplio rango de insectos hospederos. Son considerados como una alternativa para evitar la aplicación de químicos; la relevancia de estos radica en el control de plagas de insectos debido a su alto potencial reproductivo, además de ser factible la producción en masa y su inocuidad a vertebrados y plantas. Sin embargo, la introducción de NEP como agentes de biocontrol en un sitio particular requiere una identificación apropiada de las especies naturales ya que la introducción de NEP exóticos puede: 1) inducir la exclusión de las poblaciones y/o especies locales, desgastando la diversidad natural y 2) ser ineficiente contra las plagas de insectos locales ya que ellos pueden inadaptarse a las condiciones en ambientes específicos (Emelianoff et al. 2008). Los nematodos del género Steinernema Travassos 1927 (Steinernematidae) son parásitos letales obligados de insectos. Los Steinernemátidos viven en simbiosis con bacteria Xenorhabdus spp., que junto con el nematodo matan al insecto huésped en un lapso de 24 a 48 horas, digieren los tejidos, proporcionando nutrientes adecuados para el crecimiento y desarrollo del nematodo en el cadáver del insecto. Este mutualismo simbiótico nematodo-bacteria es altamente específico, tanto que las especies de nematodos no pueden re-asociarse con especies de bacterias no nativas (Stock et al. 2001; Emelianoff et al. 2008). Las especies de Steinernema están distribuidas ampliamente por el mundo y los aislados muestran diferencias en el comportamiento, rango de huéspedes, infectividad y tolerancias ambientales; esta variabilidad ha estimulado el interés en encontrar nuevas cepas y especies potencialmente útiles para el control biológico (Stock et al. 2001). Actualmente, el género Steinernema comprende 31 especies descritas. Sin embargo, muchos aislados adicionales de diversas localidades geográficas no han sido totalmente caracterizados. Steinernema spp. se han descrito a través de diferentes conceptos de especies, con datos morfológicos y morfométricos; además de pruebas de cruzas de uso común para identificación y diagnóstico diferencial lo que implica una labor intensa y mucho tiempo. La determinación morfológica y morfométrica de NEP en los laboratorios de diagnóstico, resulta complicada, dado el amplio rango de especies existentes. Además la interpretación requiere de expertos para asegurar confiabilidad de 155

2 la identificación. Debido a estas dificultades, en los últimos años ha obligado a recurrir a diferentes técnicas moleculares con evidencia morfológica para caracterizar a los steinernemátidos. Además los datos de secuencias de nucleótidos se han utilizado para delimitar especies de nematodos e inferir su historia evolutiva (Stock et al. 2001). La secuenciación de la región espaciadora interna transcrita (ITS) y de la subunidad grande (LSU o 28S) del DNA ribosomal (DNAr) nuclear es una de las secuencias más utilizadas en la caracterización molecular de nematodos a nivel de género y de especie (Emelianoff et al. 2008; Nguyen et al. 2008; Mrá ek Z et al. 2006; Mancilla et al. 2004; Stock et al. 2001). Como se muestra en la Figura 1 la región ITS contiene dos regiones (ITS1 e ITS2 e incluye también la región 5.8S) no codificadoras variables dentro de cada repetición de DNAr; y se localizan entre las regiones altamente conservadas de los genes, RNAr 18S (SSU-18S), región 5.8S y los genes que codifican para RNAr de la subunidad grande del ribosoma (LSU-28S) (Vylgalis Lab). Figura 1 Repetición de DNAr con la localización de las regiones ITS, LSU y los cebadores ITS-1, ITS-4, 391 y 501. En este trabajo se pretende obtener la secuencia de dos regiones del DNAr (ITS y LSU) de un aislado de nematodo del género Steinernema y utilizar BLAST para tratar de identificar la especie. Material y Métodos 1. Obtención de la Muestra y Extracción de DNA Un aislado de nematodos fue colectado de adultos de Scyphophorus interstitialis infectados de manera natural (Aquino et al. 2005; 2006); en Oaxaca (CIIDIR, IPN, Unidad Oaxaca). Para la identificación de los nematodos se infectaron larvas de Galleria mellonella de las cuales se colectaron infectivos juveniles (IJ) de las trampas de White (White 1927). Una vez recuperados en agua destilada (Dra. Judith Hueso del Centro Universitario de la Costa Sur, UdeG) se mantuvieron congelados hasta la extracción de DNA (Palomera et al. 2008; Aljanabi et al. 1997). La calidad y cantidad del DNA genómico obtenido se determinó por electroforesis en geles de agarosa al 0.8%; y espectrofotometría 260/280 DO respectivamente (Sambrook et al. 1989). 156

3 2. Amplificación de ITS y LSU Para la amplificación por PCR de la secuencia completa del ITS (~ pb) se utilizó el par de iniciadores universales: ITS1 (5 -TCCGTAGGTGAACCTGCGG) e ITS4 (5 -TCCTCCGTCTATTGATATGC) (Gardes & Bruns 1993); mientras que la región LSU o 28S (~ 1072 pb) se amplificó con los cebadores: 391 (5 -AGCGGAGGAAAAGAAACTAA) y 501 (5 - TCGGAAGGAACCAGCTACTA) (Stock et al. 2001). El volumen total de la reacción de PCR fue de 25 µl por muestra. Con 23 µl de mezcla PCR (PCR 1X, MgCl mm, dntps 200 µm y BSA 0.1 µg/ µl); 1 µl de mezcla iniciador-taqpol (0.5 µl de cada iniciador 5 y 3 10 µm y 0.1 µl de TaqPol 5 U/µl) y 1 µl de DNA. La muestra se amplificó en un termociclador Techne TC-312 con el Programa para ITS: desnaturalización inicial de 3 min a 95ºC 25 ciclos de 95ºC 1 min, 50ºC 45 seg, 72ºC 2 min, después 15 ciclos con un incremento de 5 seg/ciclo para el alineamiento y finalmente una extensión prolongada de 72ºC por 10 min (Gardes & Bruns 1993); y con el programa para LSU: desnaturalización inicial de 3 min a 94ºC 35 ciclos de 94ºC 1 min, 52ºC 1 min, 72ºC 1 min y finalmente una extensión prolongada de 72ºC por 10 min (Stock et al. 2001). Los productos de PCR para ITS y LSU se corrieron en geles de agarosa al 2% con TBE 1X y se tiñeron en una solución de Bromuro de Etidio 0.5 µg/ml (Sambrook et al. 1989). 3. Secuenciación de ITS y LSU Los productos de PCR se purificaron con el kit GFX TM PCR Amersham Biosciences siguiendo las instrucciones del productor. Las reacciones de secuenciación se llevaron a cabo con BigDye TM Terminator 3.1 Cycle Sequencing (Applied Biosystem) con los mismos cebadores que se utilizaron en la PCR. El volumen total de la reacción de PCR fue de 20 µl por muestra (con 4 µl de BigDye, 2 µl de buffer de secuenciación 5X, 50 ng de DNA, 0.5 µl de iniciador y ajustando el volumen con agua desionizada). El programa de PCR consistió en 25 ciclos de 96ºC 30 seg, 50ºC 15 seg y 60ºC 4 min en un termociclador PTC-100 MJ Research, Inc. La reacción fue purificada con columnas Autoseq TM G-50. Finalmente se añadieron 18 µl de formamida y los tubos se colocaron inmediatamente en hielo hasta su uso. Las secuencias se obtuvieron por electroforesis capilar en un secuenciador automático ABI-Prism 310 Genetic Analyzer (Applied Biosystem). 4. Análisis de secuencias ITS y LSU Las secuencias fueron editadas con Chromas ver 1.45 (McCarthy ) y sometidas a BLAST del GenBank (National Center of Biotechnology Information). Resultados y Discusión Los fragmentos esperados para las regiones del DNAr ITS y LSU de acuerdo a Stock et al corresponden a un producto de PCR de ~860 pb y ~1072 pb respectivamente. Como puede observarse en la Figura 2, se obtuvieron bandas de menor tamaño (~850 pb para ITS y ~ 900 pb para LSU). Los resultados obtenidos muestran que los dos protocolos de extracción de DNA permitieron obtener suficiente DNA para la 157

4 reacción de PCR; y que tanto las secuencias de iniciadores como las condiciones de PCR utilizadas para amplificar ITS y LSU fueron las adecuadas cuando se trabaja con muestras de nematodos extraídos de adultos (Rivera et al. 2007) M 1 2 M Figura 2 - Corrimiento electroforético de los productos de PCR de las muestras de DNA obtenidas del aislado de Steinernema spp. En la línea 1 banda ITS, línea 2 banda para LSU. En la línea M se encuentra el marcador de DNA de 100 pb con fragmentos intensos de 2072, 1500 y 600 pb. En cuanto al análisis de las dos secuencias de DNAr obtenidas del aislado del nemátodo, al compararse con secuencias de DNA del GenBank utilizando búsqueda BLAST del National Center for Biotechnology Information (NCBI), los resultados con la secuencia ITS mostraron que el aislado pertenece a la especie Steinernema carpocapsae con un porcentaje de congruencia del 97-98% (Cuadro I). A diferencia de los resultados con la región LSU, donde el análisis muestra un porcentaje de similitud del 97% con las secuencias disponibles para la especie Steinernema websteri (Cuadro I). Cuadro I. Resultados del análisis de secuencias ITS y LSU con BLAST. Iniciador Región ITS 1 ITS 1 + ITS 2 # nt Blast 656 % Región Accesión Especie congruencia 97% ITS1 parcial, 5.8 S ITS 2 parcial DQ % ITS1 AF19298 parcial, S Steinernema carpocapsae Steinernema carpocapsae 98% ITS1 AF0369 Steinernema 158

5 391 LSU 28S parcial, 5.8 S % 28S RNAr parcial 47 carpocapsae AY Steinernema websteri Es importante mencionar que en México sólo ha sido descrita la cepa Mexicana S. carpocapsae, a partir de características morfológicas (Salas- Luévano et al. 2001). Así, los datos hasta ahora muestran diferencia entre las secuencias ITS y LSU en la identificación de la especie, por lo que será necesario sesiones de trabajo con los expertos e incluir datos morfológicos y de prueba de cruzas para corroborar la congruencia con los datos moleculares. Agradecimientos Proyectos UdeG P3E (2008), PIFI 3.3 P/CA ( ) y Fondo COECyTJal UdeG Sub-programa 2. Impulso al Talento e Incorporación Temprana a la Investigación. Modalidad 2.1 y 2.3 con Dra. Alma Rosa Villalobos Arámbula como investigador responsable. Dr. Aarón Rodríguez Contreras de la Universidad de Guadalajara su apoyo con la infraestructura necesaria para la secuenciación. Bibliografía Aljanabi S.M., I. Martinez Universal and rapid salt-extraction of high quality genomic DNA for PCR- based techniques. Nucleic Acid Research 25: Aquino B.T., V.J. Ruíz, C.M. Iparraguirre Manejo Integrado de Scyphophorus interstitialis con nematodos y hongos entomopatógenos, en agave mezcalero. Jornada Politécnica de Investigación CIIDIR-OAXACA. Aquino B.T., V.J. Ruiz, C.M. Iparraguirre Control biológico del picudo negro (Scyphophorus interstitialis Gyllenhal) con nematodos y hongos entomopatógenos en agave en Oaxaca, México. Revista Científica UDO Agrícola 6 (1): Emelianoff V., N. Le Brun, S. Pagès, S.P. Stock, P. Tailliez, C. Moulia, M. Sicard Isolation and identification of entomopathogenic nematodes and their symbiotic bacteria from Hérault and Gard (Southern France) Journal of Invertebrate Pathology. 98 (2): Gardes M., T.D. Bruns ITS Primers with Enhanced Specificity for Basidiomycetes-Application to the Identification of Mycorrhizae and Rusts. Molecular Ecology 2: Mancilla J.P., A. Abelleiria, C. Pintos, O. Aguin, R. Pérez, B. Loureiro, M.D. Montenegro Método de extracción de ADN en nematodos para su aplicación en el diagnóstico por técnicas moleculares. XX Reunión Anual del Grupo de Trabajo de Laboratorios de Diagnóstico y Prospecciones Fitosanitarias. Pontevedra. McCarthy C Chromas vr (32 bit) Queensland, Australia. Mrá ek Z, K.B. Nguyen, P. Tailliez, N. Boemare, S. Chen Steinernema sichuanense n. sp. (Rhabditida, Steinernematidae), a new species of 159

6 entomopathogenic nematode from the province of Sichuan, east Tibetan Mts., China Journal of Invertebrate Pathology. 93 (3): National Center of Biotechnology Information (Consultado: 08/08/08). Nguyen K.B., V. P ža, Z. Mrá ek Steinernema cholashanense n. sp. (Rhabditida, Steinernematidae) a new species of entomopathogenic nematode from the province of Sichuan, Chola Shan Mountains, China. Journal of Invertebrate Pathology. 97 (3): Palomera V., P. Castro-Félix, A.R. Villalobos-Arámbula High Yield of high Quality DNA from Vegetative and Sexual Tissues of Mexican White Pine (Pinus ayacahuite). African Journal of Biotechnology 7 (1): Rivera-Pérez, L.R., A.C. Rodríguez-Aranda, J.J. Gálvez-Morales, J.J. Ruelas. Medina, R. Romero-Guevara. D.M. Barragán- Reynaga, A.R. Villalobos-Arámbula, G. Vargas-Amado, T. Aquino-Bolaños, E.J. Hueso- Guerrero, J. Fallad-Chávez Estandarización de Protocolos de Extracción de DNA y PCR-ITS para la Identificación de Nematodos Entomopatógenos Nativos (Rhabdtitida: Steinernematidae). XVIII Semana de la Investigación Científica. CUCBA. Salas- Luévano, M.A., M. González R., R. Lezama, O. Rebolledo, J. Molina Existencia de nematodos entomopatógenos (Steinernematidae y Heterorhabditidae) en Agrosistemas del Cañón de Juchipila Zacatecas, México. Jornada de Investigación Universidad Autónoma de Zacatecas. Sambrook J., E.F. Fritsh, T. Maniatis Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor. Stock S.P., J.M. Campbell, S.A. Nadler Phylogeny of Steinernema Travassos, 1927 (Cephalobina: Steinernematidae) inferred from ribosomal DNA sequences and morphological characters. Journal of Parasitology 87 (4): Vilgalys R. S/A. Vilgalys Mycology Lab. (Consultado: 07/08/08). White, G. F A method for obtaining infective nematode larvae from cultures. Science 66,