ESTUDIO PRELIMINAR DE LA VÍA C-MET EN CÉLULAS DE TUMORES DE ESTROMA GASTROINTESTINAL

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1 Facultad de Ciencias Memoria del Trabajo de Fin de Grado ESTUDIO PRELIMINAR DE LA VÍA C-MET EN CÉLULAS DE TUMORES DE ESTROMA GASTROINTESTINAL Tania García Martínez Grado de Bioquímica Año académico DNI del alumno: B Trabajo tutelado por: Regina Alemany Alonso Departamento de Biología NO se autoriza a la Universidad a incluir mi trabajo en el Repositorio Institucional para su consulta en acceso abierto y difusión en línea, con finalidades exclusivamente académicas y de investigación. Palabras clave del trabajo: Tumor de estroma gastrointestinal, sarcomas de partes blandas, factor de crecimiento de hepatocitos, c-met y PHA

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3 ÍNDICE ABREVIATURAS... 4 RESUMEN INTRODUCCIÓN Tumores de estroma gastrointestinal Receptor KIT y PDGFR- α Tratamiento de GIST Receptor c- MET Estructura del receptor c- MET y del factor de crecimiento de hepatocitos Función y señalización de c- MET C- MET y cáncer Terapia del cáncer dirigida a c- MET HIPÓTESIS Y OBJETIVOS Hipótesis Objetivos MATERIALES Y MÉTODOS Cultivo líneas celulares Expresión de c- MET Estimulación con el factor de crecimiento de hepatocitos Inhibición con el compuesto PHA Inmunodetección y cuantificación de proteínas Análisis de los datos RESULTADOS Y DISCUSIÓN CONCLUSIONES REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

4 ABREVIATURAS GIST: Tumor de estroma gastrointestinal RTK: Receptor tirosina quinasa HGF: Factor de crecimiento de hepatocitos IM: Mesilato de imatinib SM: Malato de sunitinib MAPK: Proteína quinasa activada por mitógenos SH2: Dominio de homología Src 2 PRCC: Carcinoma renal papilar hereditario HNSCC: Carcinoma de células escamosas de cabeza y cuello SPB: Sarcomas de partes blandas FBS: Suero fetal bovino BPE: Extracto de pituitaria bovina 4

5 RESUMEN Introducción: Los tumores del estroma gastrointestinal (GIST) son los tumores mesenquimales más frecuentes del tracto gastrointestinal y se caracterizan por una mutación activadora específica en los genes que codifican para los receptores tirosina quinasa (RTK), c- KIT y PDGFR- α. Aunque los GIST son inicialmente sensibles a imatinib u otros inhibidores de receptores tirosina quinasa, se desarrolla resistencia al fármaco por lo que se requiere nuevas estrategias para la terapia. Los objetivos de este trabajo fueron en primer lugar realizar una búsqueda de los antecedentes bibliográficos sobre la implicación de c- MET en GIST y en sarcomas de partes blandas frente a otro tipo de cánceres. En segundo lugar, evaluar la expresión de c- MET (fosforilado y total) en diferentes líneas de GIST y de sarcomas de partes blandas, así como su activación o inhibición mediante el factor de crecimiento de hepatocitos (HGF) o el inhibidor específico de c- MET PHA , respectivamente. Materiales y métodos: Se utilizaron diferentes líneas celulares de GIST y de sarcomas de partes blandas. Las células fueron estimuladas con diferentes concentraciones de HGF (20 y 40 ng/ml) durante 5 minutos o pretratadas con PHA μm durante 1 hora antes de la activación. La expresión de c- MET activado y total se determinó mediante inmunoblot. Resultados y discusión: Se observó expresión de c- MET en todas las líneas de GIST y sarcomas de partes blandas estudiadas. Los niveles de c- MET activado fueron elevados en la línea de leiomiosarcoma SK- UT- 1 y la línea GIST BI, siendo bajos en el resto de líneas. En las células de fibrosarcoma HT y GIST 48, HGF activó c- MET de manera dependiente de la dosis. La activación paralela de AKT y ERK1/2 por HGF indicaron que la señalización mediada por c- MET estaba activa. Finalmente, la activación de c- MET y de su efector AKT por HGF fue inhibida por el inhibidor de c- MET, PHA en células HT Conclusión: El nivel de activación de c- MET fue muy heterogéneo en las distintas líneas de GIST y sarcomas de partes blandas estudiadas, a pesar de formar parte del mismo subtipo de sarcomas. La activación de c- MET y de su vía de señalización celular en la línea GIST 48 por HGF sugiere su implicación en la supervivencia de este tipo de células tumorales y abre la posibilidad de considerar a los inhibidores específicos de c- MET como una posible estrategia terapéutica en este tipo de tumores. ABSTRACT Introduction. Gastrointestinal stromal tumors (GISTs) are the most frequent mesenchymal tumors of the gastrointestinal tract and are characterized by specific activating mutation in genes coding for the receptor tyrosine kinases (RTKs) c- KIT and PDGFR- α. Although GISTs are often initially sensitive to imatinib or other tyrosine kinase receptor inhibitors, resistance generally develops, necessitating new strategies for therapy. The objectives of this study were first to search for bibliographic records regarding the involvement of c- MET in GIST and soft tissue sarcomas compared to other types of cancers. Secondly, to evaluate the expression of c- MET (phosphorylated and total) in different lines of GIST and soft tissue sarcomas as well as their activation or inhibition by hepatocyte growth factor (HGF) or specific inhibitor of c- MET PHA , respectively. Materials and methods: Different GIST and soft tissue sarcomas cell lines were used. Cells were stimulated with several concentrations of HGF (20 and 40 ng/ml) for 5 minutes or pre- treated with PHA μm for 1 hour prior to activation. The expression of activated and total c- MET was determined by immunoblot. Results and discussion: c- MET expression was observed in all lines of GIST and soft tissue sarcomas studied. The activated c- MET levels were high in SK- UT- 1 leiomyosarcoma and GIST BI lines and low in the remaining lines. In the HT fibrosarcoma and GIST 48 cell lines, HGF activated c- MET dose dependent manner. Parallel activation of AKT and ERK1/2 by HGF indicated that c- MET- mediated signaling was activated. Finally, activation of c- MET and its effector, AKT, by HGF were inhibited by c- MET inhibitor PHA in HT cells. Conclusion: The c- MET activation level was very heterogeneous in the different GIST and soft tissue sarcomas cell lines studied, despite being part of the same subtype of sarcomas. Activation of c- MET and its signaling pathway in GIST 48 line by HGF suggests their involvement in the survival of this type of tumor cells and shows the possibility of considering specific inhibitors of c- MET as a potential therapeutic strategy in this type of tumors. 5

6 1. INTRODUCCIÓN 1.1 Tumores de estroma gastrointestinal Los tumores de estroma gastrointestinal (GIST) son los tumores mesenquimales más frecuentes del tracto gastrointestinal (GI), 1 representando aproximadamente el 18% de todos los sarcomas y el 1% de todas las neoplasias intestinales. La incidencia anual de GIST según lo determinado por los estudios basados en la población es de aproximadamente 10 casos por millón, 2 afectando mayoritariamente a individuos mayores de 50 años de edad. 3 Consisten en tumores del tejido conectivo del tubo digestivo y estructuras contiguas, que pueden surgir en cualquier punto, desde el estómago hasta el ano. 4 Se encuentran más comúnmente en el estómago (60-70%), seguido por el intestino delgado (20-30%), colon y el recto (5%) y el esófago (<5%). 5 La cavidad abdominal y el hígado son los sitios más comunes de metástasis a distancia. 6 Los GIST presentan tres principales subtipos histológicos: el subtipo fusiforme (70%), el subtipo epiteloide (20%) y un subtipo mixto (10%). 7 Comparten morfología y características inmunofenotípicas con las células intersticiales de Cajal (CIC), unas células del sistema nervioso en la pared intestinal que regulan el peristaltismo. 8 Como los GIST, las CIC tienen músculo liso y funciones neuronales, y tienden a expresar el receptor tirosina quinasa KIT y CD34. Además, se necesita de la señalización de KIT para el correcto desarrollo y diferenciación de las CIC, mientras que la activación constitutiva de KIT causada por una mutación de ganancia de función se asocia con la patogénesis de GIST. Por lo tanto, se propone que los GIST proceden de las CIC o de las células madre que se diferencian en CIC Receptor KIT y PDGFR- α Los GIST se caracterizan por la expresión de dos receptores tirosina quinasa estrechamente relacionados, el receptor KIT (receptor del factor de células madre, CD117) y en menor medida de PDGFR- α (receptor del factor de crecimiento derivado de plaquetas de tipo α). La mayoría de los GIST (alrededor de un 85%) muestran mutaciones oncogénicas en uno de estos dos receptores. Principalmente se han encontrado mutaciones en el exón 9 o 11 del gen KIT (en un 7% o 65% de los casos, respectivamente) o en el exón 18 del gen PDGFR- α (aproximadamente en el 7% de los casos). Estas mutaciones son las responsables de la activación constitutiva de la función quinasa independiente de ligando (Figura 1). 10 Un 10-15% de los GIST, GIST de tipo salvaje (wt- GIST), no tienen mutaciones en KIT y PDGFR- α aunque presentan otro tipo de mutaciones responsables de la tumorigénesis. Por ejemplo, se ha identificado que mutaciones en el gen BRAF no solamente están implicadas en melanoma, cáncer papilar de tiroides o cáncer colonrectal, sino que un 7-15% de los 6

7 wt GIST presentan mutaciones en el gen BRAF. Proteínas BRAF y constituyentes de la vía de señalización MAPK pueden estimular el crecimiento celular independiente de KIT y son una posible causa de la resistencia a los inhibidores quinasa de KIT y PDGFR- α. 11 También contribuyen a la patogénesis de los wtgist mutaciones en la succinato deshidrogenasa, receptor del factor de crecimiento similar a la insulina IGF1R, entre otros. 12,13 Figura 1. Representación de las estructuras esquemáticas de los receptores KIT y PDGFR- α. Los porcentajes indican la frecuencia de mutaciones detectadas en cada exón de los genes que codifican para las proteínas KIT y PDGFR- α. 2 Imagen tomada de: Balachandran, V. P. & Dematteo, R. P. Targeted therapy for cancer: the gastrointestinal stromal tumor model. Surg. Oncol. Clin. N. Am. 22, (2013) Tratamiento de GIST El tratamiento de elección es la escisión quirúrgica aunque a diferencia de los carcinomas, la resección de GIST no requiere de la extirpación del intestino grueso o linfadenectomía ya que estos tumores por lo general no presentan metástasis en los ganglios linfáticos. 14 Sin embargo, a pesar de la resección aparentemente completa, la tasa de recurrencia es alta. Los factores pronóstico de un aumento del riesgo de recurrencia incluyen el tamaño del tumor grande, un elevado índice mitótico y la localización del tumor primario en el intestino delgado, así como la rotura del tumor. 6 Los tumores de estroma gastrointestinal son refractarios a la quimioterapia citotóxica convencional y radioterapia, con una tasa de respuesta inferior al 5% y una supervivencia media de sólo 12 a 19 meses en pacientes con enfermedad no resecable o metastásico. 15 La terapia de diana molecular 7

8 basada en la inhibición del receptor de c- KIT y PDGFR- α con el mesilato de imatinib (IM), una molécula pequeña que mimetiza la acción del ATP inhibiendo al receptor tirosina quinasa, revolucionó el tratamiento de los GIST. Hasta el 80% de los pacientes con GIST metastásico tratados con IM consiguieron responder parcialmente o estabilizar la enfermedad. 16 Hoy en día, el mesilato de imatinib se utiliza como tratamiento de primera línea para los GIST no resecables, metastásicos o recurrentes. 4,17 Sin embargo, el tratamiento con IM rara vez es curativo, y los tumores que inicialmente son sensibles a IM adquieren resistencia al tratamiento antes de los dos años. 16 Por lo que para los pacientes con enfermedad avanzada resistentes o intolerantes a IM se emplea como tratamiento de segunda línea el malato de sunitinib (SM) el cual es capaz de inhibir c- KIT, PDGFR- α y VEGFR. Por último, los pacientes cuyo tumor sigue progresando a pesar del tratamiento con IM y SM se le administra regorafenib, un inhibidor multiquinasa, como tratamiento de tercera línea. 18,19 Se puede visualizar el lugar de acción de los tratamientos descritos en la Figura 2. Figura 2. Posibles objetivos terapéuticos (rojo) y fármacos dirigidos en GIST. 1 En la imagen se muestra un resumen sobre los fármacos dirigidos a posibles dianas terapéuticas, destacando con una flecha los tratamientos de GIST que se dan en primera, segunda y tercera línea (Imatinib, sunitinib y regorafenib, respectivamente). Imagen modificada de: Tornillo, L. Gastrointestinal stromal tumor - an evolving concept. Front. Med. 1, 43 (2014). 8

9 Las terapias dirigidas contra c- KIT en pacientes crónicos tratados con IM o SM conducen al resurgimiento de GIST resistente a estos medicamentos en más de un 50% de los casos entre 6 meses y 3 años con lo que se precisa el estudio en profundidad de los mecanismos genéticos responsables de la resistencia. 20 En la mitad de los casos, la resistencia a IM se debe a una mutación secundaria en el receptor c- KIT, aunque también se ha encontrado en una fracción pequeña de tumores resistentes a IM, la amplificación y la sobreexpresión de c- KIT así como, la ganancia de actividad de otros receptores tirosina quinasa entre los que se encuentra c- MET, AXL e IGF- 1R. 16, Receptor c- MET Estructura del receptor c- MET y del factor de crecimiento de hepatocitos El gen C- MET humano fue descubierto como un oncogén hace dos décadas, está localizado en el cromosoma 7 (7q21- q23) y codifica para el receptor tirosina quinasa que tiene como ligando el factor de crecimiento de hepatocitos (del inglés HGF ). 21 El receptor c- MET es sintetizado como un polipéptido sencillo que tras sufrir glicosilación y un corte proteolítico, genera un heterodímero de dos subunidades unidas por puente disulfuro: la cadena α de 50 kda, es extracelular y altamente glicosidada. La cadena β (145 kda), contiene una región extracelular grande (implicada en la unión del ligando), un segmento transmembrana y una región intracelular que contiene la actividad catalítica. 22 La porción extracelular de c- MET contiene una región de homología con las semaforinas (dominio SEMA, que incluye toda la cadena α y la parte n- terminal de la cadena β de c- MET), el dominio PSI (plexinas, semaforinas e integrinas) rico en cisteínas, seguido de un conjunto de repeticiones que se han encontrado en inmunoglobulinas, plexinas y factores de transcripción (IPT 1- IPT 4) y, finalmente, el dominio transmembrana (TM) 23. La región intracelular de c- MET contiene tres regiones (Figura 3A): Un segmento yuxtamembrana que contiene a) un residuo de serina (Ser 985), que cuando está fosforilado por la proteína quinasa C o por la proteína quinasa dependiente de Ca 2+ /calmodulina regula a la baja la actividad del receptor quinasa; b) una tirosina (tyr 1003) que cuando se une a la ubiquitina ligasa Cbl es responsable de la poliubiquitinación, endocitosis y degradación de c- MET. 24 El dominio tirosina quinasa, que tras la activación del receptor, se somete a trasnfosforilación en Tyr 1234/

10 La región C- terminal, que comprende dos tirosinas cruciales (Tyr 1349 y Tyr 1356) insertadas en un motivo que representa el sitio de acoplamiento multisustrato capaz de reclutar varios adaptadores corriente abajo que contienen el dominio de homología Src 2 (del inglés SH2 ). El sitio de acoplamiento multifuncional es una característica del receptor c- MET, ya que la mayoría de receptores tirosina quinasas (RTK) utilizan diferentes tirosinas para unirse a moléculas de señalización específicas. Se ha demostrado que las dos tirosinas presentes en el sitio de acoplamiento son necesarias y suficientes para la transducción de señales tanto in vitro como in vivo. 22 Figura 3. A) Estructura del receptor c- MET. Dominio Sema, un dominio rico en cisteína y cuatro dominios de tipo inmunoglobulina en la región extracelular del receptor tirosina quinasa. Los números entre paréntesis indican los límites de aminoácidos de cada dominio. La porción intracelular de c- MET incluye el dominio quinasa y residuos clave de tirosina. B) Vía de señalización HGF/c- MET. La fosforilación de tirosinas crea sitios de acoplamiento para una variedad de sustratos corriente abajo, muchos de los cuales se representan aquí. El reclutamiento de proteínas adaptadoras promueven la supervivencia, la invasión, la migración celular y reordenamientos del citoesqueleto. Además, se representan vías de regulación negativos que resultan en la degradación de c- MET. Por último, la señalización de c- MET puede ser modulada por un número elevado de proteínas, como son RON, EGFR, integrina α6β4, plexin B1, CD44 y FAS C) Estrategias de intervención terapéutica. La actividad de c- MET ha sido bloqueada mediante tres enfoques diferentes. C1) Competidores de MET/HGF. C2) Anticuerpos monoclonales. C3) Inhibidores de quinasa. Imagen modificada de: Lai, A. Z., Abella, J. V & Park, M. Crosstalk in Met receptor oncogenesis. Trends Cell Biol. 19, (2009). 22,26 10

11 El gen para HGF también se localiza en el cromosoma 7 (7q21.1) y abarca 70 kb. Se produce como una molécula inactiva, pro- HGF, que posteriormente se escinde a su forma activa por proteasas tales como el activador del plasminógeno de tipo uroquinasa y el activador del plasminógeno de tipo tisular, y por los factores de coagulación X, XI y XII. La forma madura es un heterodímero α- β unido por puente disulfuro. 27 La cadena α de HGF contiene un péptido señal (SP) seguido de un bucle de horquilla (HL) y cuatro dominios kringle (K1- K4). La cadena β tiene un dominio de serina proteasa desprovisto de actividad proteolítica. 27 HGF es homólogo a la proteína estimulante de macrófagos (MSP) que se une a un receptor altamente homólogo a c- MET nombrado RON, siendo ambos miembros de la subfamilia de tirosina quinasa Función y señalización de c- MET Típicamente, la expresión de c- MET se encuentra en las células epiteliales mientras que HGF se expresa en la mesénquima circundante. El crecimiento invasivo desencadenado por c- MET se produce en condiciones fisiológicas, tanto durante el desarrollo embrionario y la formación de órganos como en la vida adulta. 22 Durante la embriogénesis, se requiere la vía c- MET/HGF para el desarrollo de la placenta, hígado, riñón, sistema nervioso y el músculo esquelético. 29 Además participa en eventos complejos durante el desarrollo, tales como la gastrulación (cuando el epitelio embrionario origina el mesodermo), morfogénesis epitelial, la angiogénesis, la migración de mioblastos y la remodelación ósea. De hecho todos estos eventos requieren la proliferación celular, la migración, la huida de la apoptosis, la invasión de los tejidos circundantes y la reorganización en nuevas estructuras. 30 Durante la vida adulta, la expresión de c- MET desempeña un papel en la hematopoyesis, incluyendo el desarrollo de las células beta durante la selección de antígeno. Además, la señalización de c- MET induce proliferación y supervivencia en el crecimiento y desarrollo del hígado, así como el crecimiento invasivo para la cicatrización de heridas durante la reparación de la lesión aguda. 31,32 A nivel molecular, la unión de HGF a c- MET promueve su dimerización y la trans- fosforilación de los residuos tirosina dentro del bucle de activación quinasa, lo que resulta en la activación del receptor. La inducción de la actividad catalítica de c- MET permite la fosforilación de residuos tirosina en la región C- terminal de c- MET (Y1349 y Y1356), las cuales son esenciales para todas las funciones biológicas del receptor c- MET (Figura 3B). 33 Estas tirosinas crean el sitio de acoplamiento multisustrato el cual se acopla a las proteínas adaptadoras Grb2 y Shc, y a la subunidad p85 de la PI3 quinasa, lo que promueve el acoplamiento de c- MET a la proteína quinasa activada por mitógenos (del inglés MAPK ) y a las vías de AKT, 11

12 respectivamente. Además, Grb2 recluta indirectamente múltiples proteínas, incluyendo la proteína de acoplamiento Gab1 y las ligasas de ubiquitina C- CBL y Cbl- b, que regulan negativamente la señal de c- MET. 23 Gab1 además de ser reclutado indirectamente por Grb2, es reclutado por c- MET en Y1349 a través de una interacción directa que requiere 13 aminoácidos dentro de Gab1, que comprenden el dominio de unión a c- MET (del inglés MBD ). Esta interacción facilita la asociación directa y robusta entre Gab1 y c- MET, lo que es esencial para una fosforilación mayor y más sostenida de Gab1 en respuesta a HGF. 34,35 La fosforilación de c- MET dependiente de Gab1 crea a su vez, sitios de acoplamiento que reclutan múltiples proteínas de señalización, incluyendo la subunidad p85 de PI3- K, PLCγ, la tirosina fosfatasa SHP- 2, la proteína adaptadora Crk y la serina- treonina Pak4 quinasa. 36 El reclutamiento de PI3- K por Gab1 permite la activación de AKT y sus vías corriente abajo, necesarias para la migración celular y la huida de la apoptosis. 23 El reclutamiento de SHP- 2 por Gab1 y la actividad catalítica de SHP- 2 es esencial para la activación sostenida de MAPK necesaria para el crecimiento invasivo. Gab1 también coordina las vías de modulación del citosqueleto de actina, la adhesión celular y la migración, esto lo realiza mediante la asociación de Crk a Gab1 que permite la activación de Rap1 y Rac. Por último, se requiere el acoplamiento de Pak4 a Gab1 para la invasión celular. 37 Un sitio regulador importante en c- MET es Y1003 que se localiza dentro del dominio yuxtamembrana, ya que recluta a Cbl cuando se fosforila. Cbl es una ligasa E3- ubiquitina que facilita la ubiquitinación del receptor c- MET, dirigiendo de ese modo la internalización, el tráfico a endosomas tardíos y la degradación final del receptor. 21 Las mutaciones en c- MET que provocan el desacoplamiento de Cbl (Y1003) disminuyen la ubiquitinización con lo que se produce una degradación ineficiente del receptor. Esto se traduce en una mayor estabilidad y una señalización más prolongada, especialmente de las vías Ras MAPK y de la activación oncogénica de c- MET. 38 En los organismos multicelulares complejos, la coordinación y organización de las redes de señalización en respuesta a señales extracelulares modulan la proliferación celular, la supervivencia y la migración. Aunque c- MET está implicado en múltiples procesos biológicos, las respuestas que tienen lugar en vivo rara vez son controlados por una señal, por lo que implican interacciones complejas de múltiples vías de señalización. Por lo tanto, la señalización de c- MET puede ser modulada por otras proteínas, incluyendo RON, EGFR, integrina α6β4, plexin B1, CD44 y FAS (Figura 3B)

13 1.2.3 C- MET y cáncer La vía de c- MET es una de las vías que más frecuentemente se encuentran desreguladas en el cáncer humano, y la señalización aberrante de c- MET se ha documentado en la mayoría de tumores sólidos y neoplasias malignas hematológicas. La evidencia principal que une directamente a c- MET con la aparición de cáncer fue el descubrimiento de mutaciones en el gen c- MET de pacientes con carcinoma renal papilar hereditario (del inglés PRCC ). Las mutaciones son de tipo missense y se localizan en el dominio tirosina quinasa, lo que conlleva a una activación constitutiva y una ganancia de función del gen. 22,39 La activación constitutiva de c- MET se puede conseguir de diferentes maneras, como por ejemplo, con el establecimiento de un bucle autocrino entre HGF y c- MET, con la sobreexpresión de c- MET o con la activación por mutaciones puntuales en la secuencia de codificación del receptor. 22 En el primer caso, el establecimiento de un bucle autocrino HGF/MET se asocia a muchos tipos de cánceres, incluyendo melanomas, osteosarcomas, carcinomas de mama y gliomas. La excesiva producción autocrina o paracrina de HGF se relaciona con un comportamiento más agresivo del tumor, pudiendo desempeñar un papel en la conducción de la motilidad celular y la metástasis. 26 Por otro lado, la sobreexpresión de c- MET es el mecanismo más frecuente de activación oncogénica de c- MET en los cánceres humanos. En la mayoría de los casos la sobreexpresión se produce a nivel transcripcional, aunque también es debida al aumento de número de copias de genes. El aumento de la expresión de c- MET ha sido descrito en varios tumores sólidos tales como cánceres gástricos, carcinomas del tracto biliar y cánceres de pulmón, y siempre se correlaciona con un mal pronóstico del tumor. 22,26 Por último, la activación constitutiva del receptor puede ser debida a mutaciones puntuales en el gen MET, tanto de la línea germinal como de la somática. Estas mutaciones se pueden localizar en los distintos dominios del receptor c- MET, por ejemplo, mutaciones en el dominio extracelular se han encontrado en diferentes tumores sólidos (mama, colon, pulmón, ovario y renal). Por otro lado, el splicing alternativo de c- MET como consecuencia de mutaciones en el dominio yuxtamembrana, se produce en aproximadamente el 2% de los tumores de pulmón. 26 Hay variantes de c- MET que poseen una deleción en el dominio yuxtamembrana y carecen del sitio de unión a Cbl, lo que resulta en una proteína c- MET más estable con una mejor señalización y capacidad oncogénica. Finalmente, se ha observado la presencia de mutaciones activadoras en el dominio quinasa MET en los carcinomas de células renales hereditarias y esporádicas, y carcinoma de células escamosas de cabeza y cuello (del inglés HNSCC ). Las mutaciones son más frecuentes en las metástasis que en los 13

14 tumores primarios HNSCC, lo que sugiere una ventaja selectiva para las células metastásicas con c- MET mutado Terapia del cáncer dirigida a c- MET La invasión tumoral y la metástasis son la principal causa de muerte en pacientes con cáncer. Por lo tanto, se estudian los enfoques terapéuticos dirigidos a menoscabar la propagación metastásica. Desde esta perspectiva, tanto c- MET como HGF son buenos objetivos terapéuticos. Se han desarrollado tres estrategias principales para bloquear de manera eficiente la actividad de c- MET como son el uso de competidores de c- MET/HGF, anticuerpos monoclonales anti- MET o HGF e Inhibidores de la quinasa de c- MET. Desde un punto de vista clínico, estos dos últimos enfoques son los más prometedores. De hecho, compuestos análogos, utilizados para otras RTK ya están disponibles y están proporcionando resultados prometedores en el ámbito clínico. 41 i. Competidores c- MET/HGF Uno de los competidores más prometedores es NK4, una variante de HGF que comprende el extremo n- terminal y los posteriores cuatro dominios kingle de la cadena α. NK4 se une a c- MET sin inducir la activación del receptor y por lo tanto se comporta como un antagonista completo (Figura 3. C1). 41 Además como consecuencia de su similitud estructural tiene actividad anti- angiogénica pudiendo de esta forma inhibir la proliferación y la migración de células endoteliales por el factor básico de crecimiento de fibroblastos (del inglés bfgf ) y por el factor de crecimiento endotelial vascular (del inglés VEGF ), así como por HGF. 42 Esta acción bifuncional de NK4 sobre las células tumorales y el entorno vascular resulta en la inhibición del crecimiento del tumor, invasión y diseminación metastásica en modelos de ratón. Su limitación radica en la incapacidad de interferir en el desarrollo de tumores en los que c- MET se activa por HGF de manera independiente. 43 Otro mecanismo para evitar la unión de HGF a su receptor c- MET es mediante el uso de un pro- HGF no escindible debido a una mutación única que consiste en la sustitución de un aminoácido (marcado con un asterisco en la Figura 3. C1). Esta mutación impide la maduración de la molécula. 44 Pro- HGF no escindible es capaz de bloquear todas las respuestas biológicas inducidas por c- MET al unirse al receptor con alta afinidad desplazando la unión de HGF maduro y deteriorando de esta manera, la activación del receptor. Además, pro- HGF no escindible compite con HGF de tipo salvaje por el dominio catalítico de las proteasas encargado de escindir los precursores, esto provoca que la cantidad de HGF maduro disminuya. Pro- HGF inhibe el crecimiento del tumor y, lo más importante, 14

15 evita la colonización metastásica. La limitación, como en el anterior caso, es que sólo bloquean la activación del receptor dependiente de ligando. 44 Otra molécula con un gran potencial terapéutico es una forma soluble de c- MET (llamada cebo de c- MET, del inglés decoy MET), y consiste en una proteína recombinante correspondiente a todo el dominio extracelular de c- MET. Actúa tanto en c- MET como en HGF, ya que bloquea la dimerización del receptor además de secuestrar la molécula de HGF circulante. Desde el punto de vista bioquímico, tiene varias ventajas respecto NK4 ya que tiene mayor afinidad por el receptor y tiene la capacidad de bloquear la activación de c- MET tanto dependiente como independiente de ligando. 45 ii. Anticuerpos monoclonales Se han obtenido estudios prometedores tanto en el uso de anticuerpos anti- HGF como anticuerpos anti- cmet. Inicialmente, se probaron anticuerpos neutralizantes anti- HGF en combinación, y se demostró que al menos se necesitaban tres anticuerpos, actuando en diferentes epítopos de HGF, para evitar la activación de la tirosina quinasa de MET. 46 Recientemente se ha demostrado que anticuerpos monoclonales completamente humanos pueden unirse individualmente y neutralizar HGF humano. In vitro, inhiben la fosforilación de c- MET mediada por HGF, la supervivencia, la proliferación celular y la invasión. In vivo, conducen a la inhibición, incluso a la regresión de tumores en modelos de ratones. 41,47 Encontramos diferentes anticuerpos monoclonales anti- HGF como TAK701, L2G7, AMG102 (rilotumumab) y SCH (también conocido como AV299) los cuales suprimen potentemente el crecimiento de xenoinjertos de tumores en ratones (Figura 3. C2). 48 Finalmente, el anticuerpo monoclonal DN30 regula negativamente el receptor c- MET a través de un mecanismo molecular que implica la escisión proteolítica de la porción extracelular que conduce a la generación por un lado, de una molécula similar al ya mencionado competidor cebo de c- MET (parte extracelular) y por otro lado a un dominio intracelular que es rápidamente degradado. 49 El tratamiento crónico de líneas celulares de carcinoma con este anticuerpo monoclonal dio como resultado, in vitro, el deterioro de la transducción de señales inducida por HGF, el crecimiento independiente de anclaje y la invasividad, mientras que in vivo, la administración de DN30 inhibió el crecimiento del tumor y la diseminación metastásica en el pulmón de células neoplásicas

16 iii. Inhibidores de la quinasa. Los inhibidores de quinasa son moléculas de bajo peso molecular que evitan la unión de la molécula de ATP a c- MET, lo que inhibe la transactivación del receptor y el reclutamiento de los efectores corriente abajo. Estos inhibidores se pueden clasificar en tipo I y tipo II dependiendo de si se unen a la conformación activa o inactiva de la quinasa, respectivamente. Por lo tanto, los inhibidores de tipo I, que son la gran mayoría, tienen como objetivo el sitio de unión del ATP en la conformación activa, es decir, después de que los residuos de tirosina en el bucle de activación se hayan fosforilado. Como ejemplo de inhibidor de tipo I encontramos SU11274 (IC 50 de 20 nm) y PHA (IC 50 de 9nM) (Figura 3. C3). 48 Los inhibidores de tipo II incluyen aquellos que usan un sitio de unión adicional, inmediatamente adyacente a la región ocupada por ATP, que se hace accesible por una disposición específica del bucle de activación que es característico de dominios quinasas inactivos. Un ejemplo de inhibidor de tipo II sería Tivantinib (ARQ197) (Figura 3. C3). 48 A diferencia de los anticuerpos monoclonales, estos inhibidores cruzan la membrana plasmática e interactúan con el dominio citoplásmico de los receptores de la superficie celular o modulan las moléculas de señalización intracelular. La principal limitación de estas moléculas es que sólo inhiben la activación de MET quinasa dependiente de ligando, además de que ninguno de ellos es totalmente específico para el receptor c- MET lo que provoca un aumento del riesgo de toxicidad asociada a la capacidad de inhibir varias vías de señalización. 50 De todos los compuestos inhibidores de quinasa MET, el utilizado para desarrollar los diferentes experimentos ha sido PHA , un inhibidor altamente selectivo c- MET que inhibe competitivamente la unión de ATP al dominio de la tirosina quinasa de c- MET. 51 In vitro, inhibe la fosforilación de c- MET constitutiva o estimulada por HGF, el crecimiento celular, la motilidad y la migración de diferentes líneas de células tumorales. A concentraciones nanomolares, induce la apoptosis masiva de células de carcinoma gástrico que tienen amplificado c- MET. De hecho se ha demostrado que tumores que albergan amplificaciones de c- MET son fuertemente sensibles al tratamiento con PHA en comparación con los que tienen número normal de copias del gen diploide. In vivo, la administración diaria de PHA en ratones atímicos bloqueó la fosforilación de c- MET y causó la inhibición del crecimiento de xenoinjertos de tumores

17 2. HIPÓTESIS Y OBJETIVOS 2.1 Hipótesis En tumores de estroma gastrointestinal se ha demostrado que la sobreexpresión o activación constitutiva de los receptores oncogénicos tirosina quinasa (RTK) c- KIT y/o PDGFR- α es la causa del tumor, por este motivo se han convertido en dianas terapéuticas eficaces para el mesilato de imatinib. Hay pacientes que desarrollan resistencia a dicho medicamento que puede ser debida a mutaciones secundarias dentro del dominio quinasa c- KIT o bien a mecanismos alternativos de resistencia, como por ejemplo la sobreexpresión o activación de otros receptores tirosina quinasa, entre ellos el receptor c- MET. Esto nos sugiere que en células GIST resistentes a mesilato de imatinib, la activación del receptor c- MET podría favorecer la supervivencia del tumor, manteniendo así la proliferación celular e incluso pudiendo participar en la migración celular y metástasis de dicho tumor. 2.2 Objetivos El primer objetivo seguido en este trabajo fue realizar una búsqueda, mediante el buscador Pubmed en la base de datos Medline, de los antecedentes bibliográficos sobre la implicación de c- MET en GIST y en sarcomas de partes blandas frente a otro tipo de cánceres. El segundo objetivo fue evaluar la expresión de c- MET (fosforilado y total) en diferentes líneas de GIST y sarcomas de partes blandas, así como su activación o inhibición mediante el factor de crecimiento de hepatocitos o el inhibidor específico de c- MET PHA , respectivamente. 17

18 3. MATERIALES Y MÉTODOS 3.1 Cultivo líneas celulares Para realizar el cultivo celular se utilizaron como modelos experimentales diferentes líneas celulares humanas representativas de distintos subtipos de sarcomas de partes blandas (SPB). La línea SK- UT- 1 (leiomiosarcoma) obtenida de la casa comercial ATCC, fue cultivada en medio DMEM (del inglés Dubelco s Modified Essential Medium ) con una elevada concentración de glucosa (4,5g/l) y L- glutamina (2mM) (Biowest, Labclinics) suplementado con 1 mm de piruvato de sodio (Sigma Aldrich) y 1X MEM- non- essential aminoacids (Sigma Aldrich). La línea SW872 (liposarcoma desdiferenciado) fue cultivada en medio Leibovitz s 15 y la línea HT (fibrosarcoma) fue mantenida en medio EMEM (del inglés Eagle s Minimum Essential Medium ) con glucosa (2 g/l) y L- glutamina (2 mm), ambas obtenidas de la casa comercial ATCC. Por otro lado, las líneas celulares correspondientes al liposarcoma Aw y GIST CNIO BI, cedidas amablemente por el Dr. Carnero, y la línea GIST CP0039, obtenida en el Hospital Universitario Son Espases, fueron cultivadas en medio F- 10 Ham (GIBCO) suplementado con un 1% de Ultroser G (Biosepra). 52 Para el cultivo de las líneas celulares descritas anteriormente, fue preciso la suplementación con 10% suero fetal bovino (FBS premium) (Biowest, Labclinics), 100 µg/ml de estreptomicina, 100 unidades/ml de penicilina, 10mM de HEPES (Sigma Aldrich). Finalmente, la línea GIST 48, cedida generosamente por el Dr. Fletcher, fue cultivada en medio F- 10 Ham (GIBCO) con L- glutamina 2 mm, suplementado con FBS (15%), estreptomicina (100 µg/ml), penicilina (100 u/ml), gentamicina (10μg/ml) (Son Espases), fungizona B (1,5 μg/ml) (GIBCO), Mito+ (0,5ml/500ml) (CULTEK) y 25 μg/ml extracto de pituitaria bovina (del inglés BPE ) (GIBCO). La línea GIST48 se estableció a partir de la progresión de un tumor de estroma gastrointestinal resistente a imatinib debido a las mutaciones: V560D en el exón 11 y D820A en el exón 17 del gen que codifica para el receptor c- KIT. 3 Las células se incubaron a 37ºC y 5% de CO 2. Cada cierto tiempo se hicieron subcultivos. 18

19 3.2 Expresión de c- MET Para evaluar la expresión de c- MET (fosforilado y total) en distintas líneas de sarcomas de partes blandas y GIST, las células se sembraron en placas de 6 pocillos (entre y células, dependiendo de la línea) en 2 ml de su correspondiente medio de cultivo completo. Tras 24 h, se retiró el medio, las células se lavaron con PBS (1 ml) y se lisaron con el tampón de lisis (ver más abajo). 3.3 Estimulación con el factor de crecimiento de hepatocitos Para la estimulación de las células con el agonista de c- MET, HGF, se sembraron en placas de 6 pocillos células HT y células GIST 48 en 2 ml de su correspondiente medio de cultivo completo. Tras 24 h, se retiró el medio con suero y se añadió 2 ml de medio sin FBS. En el caso de las células GIST 48 también se eliminó del medio el BPE y el Mito+. Las células se incubaron en estas condiciones overnight (16-18h). A continuación, las células se estimularon con diferentes concentraciones de HGF durante 5 min. Al grupo de células vehículo se añadió medio sin suero con agua, en otro grupo de células se añadió medio sin suero con HGF 20 ng/ml y al último grupo, medio sin suero con 40 ng/ml. Tras los 5 minutos de incubación, se retiró el medio y las células se lavaron con PBS (1ml) y se lisaron con el tampón de lisis (ver más abajo). 3.4 Inhibición con el compuesto PHA Para la inhibición de las células con el inhibidor de c- MET, PHA , se sembraron en placas de 6 pocillos células HT en 2 ml de medio EMEM. Tras 24 h, se retiró el medio con suero y se añadió 2 ml de medio sin FBS. Las células se incubaron en estas condiciones overnight (16-18h). A continuación, a unas células se les añadió medio sin suero con DMSO al 1% (grupo vehículo) y otras fueron tratadas con medio sin suero con 1 μm de PHA en DMSO 1 % durante 1 h. Seguidamente, dentro de cada uno de estos grupos unas células fueron estimuladas con 40 ng/ml de HGF durante 5 min y otras no. 3.5 Inmunodetección y cuantificación de proteínas (Electroforesis y Western- Blot). Las células fueron lisadas con el tampón que contenía tris- Base 10 mm, NaCl 50 mm, MgCl 2 1mM, EDTA 2 mm, con un ph de 7,4, al que se le añadió 1% SDS, yodoacetamida 5 mm, fluoruro de fenilmetilsulfonilo (PMFS) 1 mm e inhibidores de fosfatasas a una concentración de 10 µl/ml (Sigma Aldrich). A continuación, las monocapas celulares se rasparon con una espátula de goma, y el lisado 19

20 se transfirió a tubos Eppendorf de 1,5 ml antes de ser sonicadas tres veces durante 5 segundos a una amplitud del 10% en un sonicador (Braun Labsonic T). 53 Una alícuota de 30 µl del homogenado total se retiró para la posterior cuantificación de las proteínas totales según el método del ácido bicinconínico (del ingles BCA ). 54 A continuación, al lisado restante se le añadió tampón de carga de electroforesis 10X y se hirvió durante 2 min. Las muestras se guardaron a - 20ºC. Las proteínas se separaron mediante electroforesis en geles de poliacrilamida con SDS, también llamada SDS- PAGE (del inglés, Sodium Dodecyl Sulfate- Polyacrilamide Gel Electrophoresis ). Para ello se utilizaron geles de 8% de poliacrilamida (1,5 mm de espesor). A continuación, las proteínas se transfirieron a membranas de nitrocelulosa (Western- blot). Tras la transferencia de proteínas, las membranas de nitrocelulosa se incubaron durante 1h a temperatura ambiente en una solución bloqueadora (Blocking Buffer Odyssey). A continuación, las membranas se incubaron durante la noche a 4ºC en solución bloqueadora con 0,1% de Tween- 20 que contuvo los anticuerpos primarios específicos: anticuerpos monoclonales anti β- actina (1:10000) y anti- c- MET (1:1000), y anticuerpos policlonales anti- P- c- MET (Tyr1234/1235), anti- AKT, anti- P- AKT (Ser473), anti- p44/42 MAPK (ERK1/2) y anti- P- p44/42 MAPK (P- ERK1/2) (Thr 202/tyr 204), los cuales se obtuvieron de Cell signalling Technology. Todos los anticuerpos policlonales se utilizaron a una dilución 1:1000. Después de retirar el anticuerpo primario, las membranas se lavaron tres veces durante 8 min con TBS 1X y se incubaron posteriormente con los anticuerpos secundarios anti- conejo (1:10000) y anti- ratón (1:10000) durante 2 horas a temperatura ambiente en solución de bloqueo con 0,1% de Tween- 20. Los anticuerpos secundarios anti- conejo o anti- ratón se encontraban marcados con los compuestos fluorescentes IRDdye 700 y/o IRDdye 800 y fueron suministrados por LI- COR. La señal de inmunoreactividad se detectó utilizando el sistema de imagen en el infrarrojo ODYSSEY y su software (LI- COR, Biosciences). 3.6 Análisis de los datos La intensidad óptica de cada banda de proteína fosforilada fue normalizada con respecto a la intensidad de la banda de su correspondiente proteína total. Los valores finales fueron expresados como porcentaje de las células tratadas con vehículo (tomadas como el 100%). Al tratarse de un estudio preliminar algunos de los valores solo constan de un único experimento y en otros dos, por lo que se ha dado la media y la desviación estándar en esos casos. Todos los cálculos se realizaron con el programa Microsoft Excel

21 4. RESULTADOS Y DISCUSIÓN. El estudio preliminar de la implicación de la vía c- MET en células GIST se ha extendido a otros tipos de sarcomas de partes blandas, debido al lento crecimiento de la línea GIST 48 in vitro. En la base de datos medline, el número de entradas que responde a la búsqueda del término c- MET en pubmed se ha visto incrementada en los últimos 10 años. Este auge, se relaciona con la implicación que tiene este receptor en la patogenia de distintos cánceres bien sea a través de la activación de vías oncogénicas clave (RAS, PI3K/AKT, ERK, STAT3, entre otras), la angiogénesis y la dispersión de las células, lo que puede llegar a provocar metástasis. La implicación de c- MET en la patología del cáncer ha sido principalmente estudiada en los carcinomas, un tipo de cáncer maligno muy común cuyo origen es de tipo epitelial o glandular. Esto se demuestra al realizar la búsqueda de c- MET y carcinoma a través de pubmed (Figura 4), en la que se obtiene un número de entradas igual a 924 (en los últimos 10 años). Este resultado si se compara con la misma búsqueda pero en sarcomas de partes blandas (79 entradas) y en GIST (5 entradas), indica que la implicación de este receptor en procesos celulares asociados a los SPB y a los GIST están aún poco estudiados. Si analizamos la Figura 5, se puede observar que numerosos estudios implican al receptor c- MET en la supervivencia, la proliferación, la migración y la metastasis de carcinomas. En los sarcomas de partes blandas, la implicación de este receptor en estos procesos también se ha demostrado para algunos subtipos, pero está menos estudiada ya que se obtiene un número de entradas inferior que en el caso anterior. Por último, en GIST, solo se han publicado 5 trabajos relacionando c- MET con su caracterización (1), con su terapia (1), con metástasis (1) y con su concurrencia con carcinoma papilar (2), por lo que su implicación en este tipo de sarcoma está muy poco estudiada; a pesar de su potencial interés en tumores GIST resistentes a imatinib. Esta serie de búsquedas ponen de manifiesto la necesidad de ampliar el estudio sobre la implicación del receptor c- MET en GIST pudiendo cobrar importancia en tumores que se han vuelto resistentes al tratamiento con los fármacos convencionales. 21

22 Search results c- MET AND carcinoma Figura 4. Búsqueda bibliográfica combinada del receptor c- MET y cáncer. Usando el buscador Pubmed de la base de datos Medline se ha realizado 3 tipos de búsqueda combinada acotada a los últimos 10 años: c- MET AND carcinoma, c- MET AND soft tissue sarcoma y c- MET AND gastrointestinal stromal tumor obteniendo un número de entradas diferente para cada una de las búsquedas realizadas. Última actualización c- MET AND so {ssue sarcoma 5 c- MET AND gastrointes{nal stromal tumor Search results c- MET AND survival c- MET AND prolifera{on c- MET AND migra{on c- MET AND metastasi AND carcinoma AND so {ssue sarcoma AND gastrointes{nal stromal tumor Figura 5: Búsqueda bibliográfica combinada del receptor c- MET y cáncer, y diferentes procesos implicados en cáncer. Mediante el buscador Pubmed en la base de datos Medline se compara los resultados obtenidos por diferentes búsquedas en los últimos 10 años. El resultado indica el número de entradas obtenidas para cada una de las búsquedas realizadas. Última actualización

23 Con el fin de determinar el nivel de expresión del receptor c- MET en los distintos subtipos de líneas celulares de SPB y de GIST de las que dispone el grupo de Investigación Clínica y Traslacional de la UIB se analizó la expresión de c- MET fosforilado y total mediante inmunoblot en las células de leiomiosarcoma SK- UT- 1, liposarcoma SW872, liposarcoma AW, GIST CP30039, GIST BI y GIST 48 Las bandas de inmunoreactividad obtenidas a 145 kda indicaron que los niveles de expresión de la proteína c- MET fueron altos en las células de leiomiosarcoma SK- UT- 1, liposarcoma SW872, liposarcoma AW y GIST BI, siendo esta última la linea celular donde la expresión de c- MET fue menor (Figura 6B). Por otro lado, la expresión de dicha proteína fue débil en GIST 48 y fue prácticamente indetectable en la línea primaria GIST CP0039 (Figura 6B). La fosforilacion de c- MET (P- c- MET) en las tirosinas 1234 y 35 indica la activación del receptor. Las bandas inmunoreactivas de P- c- MET que se observaron con gran intensidad en la línea de leiomiosarcoma SK- UT- 1 y con menor intensidad en GIST BI (Figura 6A) sugieren la activación del receptor en su medio de cultivo (con FBS). Sin embargo, en el resto de líneas celulares estudiadas, incluyendo a las GIST 48, P- c- MET apenas fue detectable, lo que sugiere que estas células no presentan activación del receptor en su medio de crecimiento, lo cual no descarta la posibilidad de que se pueda inducir su activación con su ligando. A) 250 kda > 150 kda > 100 kda > MW SK- UT- 1 Aw Sw872 CP0039 GISTBI GIST48 p- c- MET (Tyr1234 / 1235) B) C) 250 kda > 150 kda > 100 kda > 45 kda > c- MET β- Actina Figura 6. Niveles de expresión de la proteína c- MET y P- c- MET en distintas líneas celulares de sarcomas de partes blandas y GIST. (A) Detección de la expresión del receptor c- MET fosforilado (tyr 1234/35) mediante inmunoblot en las líneas celulares SK- UT- 1 de leiomiosarcoma, Aw de liposarcoma, Sw872 de liposarcoma desdiferenciado y en las líneas primarias de GIST CP0039, GIST BI y GIST 48 de tumores de estroma gastrointestinal. (B) Detección de la expresión del recetor c- MET en las mismas líneas celulares descritas anteriormente. (C) Se muestra la expresión de β- Actina (45 kda) utilizada como control de carga. La cantidad de proteína total cargada en el gel fue de 28 μg. 23

24 Sería interesante evaluar en un futuro si la mayor activación de c- MET en las células SK- UT- 1 y GIST BI en su medio de cultivo es debido a una mutación activadora en el gen y si esta activación está implicada en la viabilidad y migración de estas células tumorales evaluando el efecto de inhibidores específicos de c- MET, como PHA y otros actualmente utilizados en clínica, sobre estos procesos celulares. El factor de crecimiento de hepatocitos y su receptor c- MET son responsables de una amplia variedad de respuestas celulares, tanto fisiológicas durante el desarrollo embrionario y la homeostasis del tejido, como patológicas durante el crecimiento y diseminación tumoral en diferentes cánceres humanos. 55 En cáncer, c- MET puede actuar como un oncogén en las células tumorales y su activación puede ser dependiente o no de ligando (HGF). 56 Las moléculas que interfieren con la actividad de c- MET podrían ser agentes terapéuticos valiosos. 55 Es por ello que es interesante analizar si en diferentes líneas GIST es posible estimular la expresión de c- MET. Para este estudio preliminar se eligió la línea GIST 48 que es resistente a imatinib. Como control positivo se utilizó en paralelo la línea de fibrosarcoma HT- 1080, una línea de SPB en la que ya se ha demostrado la estimulación de c- MET mediante HGF. 57 En concordancia con resultados ya publicados, en células HT la estimulación con una concentración de 20 ng/ml de HGF provocó un incremento de la activación del receptor c- MET de un 563,38 ± 487,1% sobre el vehículo (Figura 7A). En la estimulación con HGF 40 ng/ml se pudo observar una activación de c- MET de 1297,02 ± 151,6%, muy superior con respecto al grupo vehículo que representó el 100% (Figura 7A). Resultados similares en la activación de c- MET ya se han visto a estas concentraciones en la línea celular MDA- MB- 231 de cáncer de mama. 58 En estas células se ha evaluado el efecto de PHA , un inhibidor de molécula pequeña capaz de bloquear la fosforilación inducida por HGF en c- MET y por lo tanto su activación. Esto se ha podido observar en células de fibrosarcoma HT ya que el efecto de la inhibición con PHA a una concentración de 1 μm en DMSO al 1% disminuyó significativamente la activación basal de c- MET (inhibición del 93,51 ± 0,18%) y bloqueó completamente su activación por HGF 40 ng/ml (Figura 7B). Consecuentemente, la inhibición de c- MET por PHA inhibió la activación de AKT tanto la basal (inhibición del 19,06 ± 0,68%) como la activada por HGF 40 ng/ml (activación del 164,95 ± 7,36% sobre el vehículo), dejando su nivel de activación a un 64,43 ± 5,0% del vehículo (Figura 7C). AKT es una de las proteínas corriente debajo de la cascada de señalización celular de c- MET implicada en proliferación y migración celular. Por lo que PHA además de producir un bloqueo a nivel de receptor también lo produce en los efectores localizados corriente abajo de la vía de señalización. 24

25 Resultados similares para la inhibición de la activación de c- MET, AKT y ERK1/2 ya se han visto a las mismas concentraciones de PHA y tiempo de tratamiento en las células CNE- 1 and HONE- 1 de carcinoma nasofaríngeo. 59 A) B) C) Figura 7. Efecto de la estimulación con HGF e inhibición con PHA sobre el receptor c- MET en la línea celular de fibrosarcoma HT (A) Estimulación del receptor c- MET con una concentración creciente de HGF (descrito en materiales y métodos). (B) Estimulación del receptor c- MET con 40 ng/ml de HGF e inhibición con PHA μm. (C) Efecto de la estimulación del receptor c- MET con HGF (40 ng/ml) y su inhibición con PHA μm, sobre la fosforilación de AKT. Cada columna representa la media ± SEM de dos experimentos. 25

26 Como se ha comentado anteriormente debido a que la inhibición de c- KIT por imatinib induce respuestas clínicas en la mayoría de los pacientes con GIST, algunos de ellos desarrollan resistencia a dicho tratamiento siendo la vía de c- MET una de las posibles causas. 3,20 Por este motivo, aunque la línea celular GIST 48 resistente a imatinib no presentó una activación de c- MET en su medio de crecimiento, se estudió si este receptor y sus efectores en la cascada de señalización (AKT y ERK1/2) podían ser activados por HGF. Como muestra la Figura 8A, tras la estimulación con HGF (40 ng/ml), las células GIST 48 mostraron un incremento de los niveles de P- c- MET del 30836,04% con respecto al vehículo considerado como el 100% (Figura 8A). De igual modo el efector AKT tras la estimulación por HGF vio incrementada su fosforilación en un 72,98% con respecto al vehículo (Figura 8B). Por último, ERK1 y ERK2 también vieron incrementado su fosforilación tras la estimulación con HGF 40 ng/ml en un 12,57% y 45,19%, respectivamente, con respecto al vehículo (Figura 8C). Se han obtenido resultados similares para la activación de los efectores AKT y ERK1/2 con HGF en las células epiteliales de las glándulas ecrinas de sudor humano (del inglés hesgc ). 60 Estos resultados sugieren que la activación de c- MET por HGF podría estar implicada en ciertos procesos como en la viabilidad y migración de estas células tumorales. Por ello, estos resultados han dado paso a estudiar si el compuesto PHA inhibe la fosforilación de c- MET activada por HGF a distintos tiempos y si esta inhibición está relacionada con la inhibición de la viabilidad celular y la migración de estas células (trabajo en curso). En caso de resultados positivos, una de las alternativas para tratar los tumores GIST resistentes a los fármacos ya establecidos sería una terapia dirigida contra el receptor c- MET y extender el estudio a otros tipos de SPB. 26

27 A) V- HGF 40 P- c- MET > c- MET > B) C) Figura 8. Efecto de la estimulación con HGF 40 ng/ml en la línea celular GIST 48. (A) Estimulación del receptor c- MET con 40 ng/ml de HGF. (B) Efecto de la estimulación del receptor c- MET con HGF (40 ng/ml) sobre la fosforilación de AKT. (C) Efecto de la estimulación sobre el receptor c- MET con HGF (40 ng/ml) sobre la fosforilación de ERK1/2. 27