Organismos modificados genéticamente No autorizados. Papaya MG

Transcripción

1 CENTRO NACIONAL DE ALIMENTACIÓN Organismos modificados genéticamente No autorizados. Papaya MG Servicio de Biotecnología Silvia Gil Alcalde Jornadas de Referencia Análisis de Alimentos. Centro, junio

2 INTRODUCCIÓN CARACTERÍSTICAS: Fruta tropical, origen americano Alto contenido en azúcar, vit C y carotenoides Agradable olor aromático PRINCIPALES PRODUCTORES: Brasil, México, Nigeria, Indonesia, India, Etiopía, Congo, Perú, China y Filipinas. Carica papaya L. PRINCIPALES EXPORTADORES: México y Brasil (Mercado USA) USA (Hawai) y Filipinas y Tailandia (Mercado japonés) Brasil (proveedor UE) Jornadas de Referencia 2014 Análisis de Alimentos. Centro, junio

3 INTRODUCCIÓN USOS Jornadas de Referencia Análisis de Alimentos. Centro, junio Frutos de la papaya madura: se consumen frescos y procesados en forma de mermelada, jalea, dulces, purés Frutos verdes o inmaduros: se añaden como vegetales a las comidas o forman parte de un producto llamado achara*. El látex de la papaya verde o inmadura es fuente de papaínautilizada en varios pasos de procesamiento de alimentos como ablandador.tambiénse ha utilizado en la industria farmacéutica y cosmética.

4 PRINCIPALES VARIEDADES COMERCIALIZADAS HortusGold y Honey Gold frutas delgadas de color amarillo dorado.sur de África Solo fruto de Hawai, doble tamaño que surafricanas, pero más pequeña y delgada que la tropical americana. Se ha utilizado para obtener las líneas Sunrise, Sunset, Kapohosolo, Waimanalo, Higgins y Wilder. Así como las líneas transgénicas SunUp(pulpa roja) y Rainbow (pulpa amarilla). Cartagena, Cedro y Santa Cruz cultivares de América Central, gran tamaño (melón) Coorg Honey Dew cultivar típico de la India ImprovedPetersen, Guinea Gold y Sunnybankcultivos mayoritarios de Australia, tamaño intermedio y de pulpa amarilla. Jornadas de Referencia Análisis de Alimentos. Centro, junio

5 PROBLEMAS DE LA INDUSTRIA DE LA PAPAYA VIDA ÚTIL CORTA Calidad de los frutos sufre durante almacenamiento, transporte, distribución y venta Pobre apariencia, textura, sabor y aceptabilidad en general INFECCIÓN POR EL VIRUS Papaya ringspot virus (PRSV) Jornadas de Referencia Análisis de Alimentos. Centro, junio

6 ORIGEN DE LA PAPAYA MODIFICADA GENÉTICAMENTE En 1940 se descubrióel virus PRSV PRSV responsable de la casi total eliminación de los cultivos de papaya en la isla Oahu años 50. Reubicación de la producción de papaya en distrito de Puna por sus condiciones de pluviosidad, disposición del terreno y libre de PRSV. PRSV (Grupo potyvirus) PRSV-w Afecta a cucurbitáceas no papaya PRSV-p El más dañino y extendido. Varios tipos o variedades. Jornadas de Referencia Análisis de Alimentos. Centro, junio

7 ORIGEN DE LA PAPAYA MODIFICADA GENÉTICAMENTE Plantas infectadas Pierden capacidad fotosintética Retraso en crecimiento Frutos peor calidad (manchas y menor contenido azúcares) PRSV tiene un control difícil y una vez infectada no hay tratamiento eficaz A mediados años 80 proyecto basado en resistencia derivada de patógenos. Se transformaron embriones jóvenes de la variedad Sunset con el gen de cubierta proteica del virus PRSV aislado en Hawai. Surgióla línea 55-1que mostró resistencia al virus. Jornadas de Referencia Análisis de Alimentos. Centro, junio

8 PAPAYA MG: TIPOS CONOCIDOS Línea55-1(resistente a PRSV) se desarrollaron 2 cultivares: SunUp Pulpa roja, homocigoto para el gen de la cubierta proteica del virus insertado Rainbow Pulpa amarilla obtenida de híbrido F1 de SunUp y la no transgénica Kapoho. Jornadas de Referencia Análisis de Alimentos. Centro, junio

9 EVENTO 55-1 Código identificador: CUH-CP551-8 Jornadas de Referencia Análisis de Alimentos. Centro, junio

10 EVENTO 63-1 Código identificador: CUH-CP631-7 Centro No contiene gen gus Jornadas de Referencia Análisis de Alimentos. Centro, junio

11 OTRAS LÍNEAS: HuanongNo.1 X17-2(UFL-X17CP-6) KN 116/5 Jornadas de Referencia Análisis de Alimentos. Centro, junio

12 Num Año Nombre País Comercializada Ensayo completado Todavía en ensayo Secuencia disponible? SunUp USA Si si Rainbow USA Si si Laie Gold USA Si si X17-2 USA No si Huanong 1 China Si si Varias líneas Brasil No no Varias líneas Jamaica No si no Varias líneas Taiwan No si no Varias líneas Tailandia No si no Varias líneas Filipinas No si no Varias líneas Malasia No si no Varias líneas Vietnam No si no Varias líneas Venezuela No si no Varias líneas Indonesia No si no Varias líneas Australia No si no

13 GENÉTICA DE LA PAPAYA MG. Elementos utilizados para el desarrollo de papaya MG PROMOTOR: 35S(Cauliflower mosaic virus CaMV 35S promoter) TERMINADOR: NOS(Nopaline synthase terminator) MARCADORES DE SELECCIÓN: nptiisecuencia codificantede la enzima NPTII (neomicinphosphotransferase) del Tn5 transposonde E.coli. Confiere resistencia a Neomicina y Kanamicina bar Enzima fosfinotricin acetil transferasa (PAT). Resistencia a herbicidas gus beta-glucuronidasa confiere resistencia a herbicidas uida Secuencia que codifica la enzima GUS (B-D-Glucuronidasa) de E.coli pmi Fosfomanosa isomerasa, marcador de selección antimetabolito Jornadas de Referencia 2014 Análisis de Alimentos. Centro, junio

14 SITUACIÓN ACTUAL DE LA PAPAYA EN EUROPA Enero 2003, Canadá permitió la importación de papaya transgénica. La Unión Europea no permite la importación de papaya transgénica en su territorio. En 2004 primeros hallazgos de papaya origen Hawai en UE (Busch et al.) En 2005, se publican métodos de PCR construcción específica de papaya MG SunUp/Rainbow(eventos 55-1, 63-1) A partir de 2010 se han encontrado en el mercado papayas MG no autorizadas. Por el momento no se han desarrollado métodos de control para detección en los productos importados. Jornadas de Referencia Análisis de Alimentos. Centro, junio

15 EU Database of Reference Methods for GMO Analysis Jornadas de Referencia 2014 Análisis de Alimentos. Centro, junio

16 Notificaciones RASFF 30 Tailandia (1x Vietnam) 25 RASFF Notifications Estados Unidos (Hawai) year Jornadas de Referencia 2014 Análisis de Alimentos. Centro, junio

17 NOTIFICACIONES AÑO 2013 PAÍS NOTIFICACIONES PAÍS NOTIFICACIONES Alemania 22 abril RASFF No abril RASFF No AUZ 3 mayo RASFF No mayo RASFF No AXY 18 junio RASFF No julio RASFF No julio RASFF No BIV 23 julio RASFF No BIW 27 agosto-rasff No dic RASFF No Bélgica 4 abril RASFF No mayo RASFF No junio RASFF No junio RASFF No julio RASFF No BFP 3 julio RASFF No BFR 5 julio RASFF No agosto RASFF No Francia Luxemburgo Austria Suiza Grecia 4 julio RASFF No julio RASFF No julio RASFF No julio RASFF No agosto RASFF No julio RASFF No junio RASFF No dic RASFF No abril RASFF No AUL Jornadas de Referencia Análisis de Alimentos. Centro, junio

18 Green papaya MG de Tailandia CONTIENE : Promotor P35S Terminador Tnos NO ESTAN PRESENTES: Las construcciones específicas: P35S-CP(ISO 21569) Pnos-nptII Presentes en la papaya de Hawai (SunUp/Rainbow) Jornadas de Referencia 2014 Análisis de Alimentos. Centro, junio

19 Genetic elements and constructs in SunUp papaya element-specific detection by P-35S, T-nos, P-nos methods (QL-ELE /13 & 64 LFGB) P-nos nptii T-nos P35S CP (coat protein) gene T-35S P35S GUS T-nos construct-specific detection Pnos-nptII construct-specific detection P35S-CP construct-specific detection 35S-GUS/GUS-Tnos Offical method 64 LFGB ISO method (annex of Amd 2013) R. Reiting, unpublished Jornadas de Referencia 2014 Análisis de Alimentos. Centro, junio

20 Detección de construcciones en papaya MG de Tailandia Pnos nptii T-nos P35S CP gene T-35S P35S Gus SunUp / Rainbow (55-1 (Acc.: FJ467933) P35S nptii P35S CP gene T-nos green papaya from Thailand construct-specific detection P35S-nptII R. Reiting (2010) construct-specific detection P35S-CP & CP-Tnos R. Reiting (unpublished) Jornadas de Referencia 2014 Análisis de Alimentos. Centro, junio

21 Resumen: Construcciones MG detectadas en frutas de papaya importadas de Tailandia Pnos nptii T-nos P35S CP gene T-35S P35S Gus T-nos SunUp 55-1 (Acc.: FJ467933) P35S nptii T-35S P35S CP gene T-nos GM papaya from Thailand (according to Reiting) P35S nptii T-35S bla gene CP gene T-nos Col1E (puc19) NGS of GM papaya from Thailand (according to BVL) Several insertions?! Jornadas de Referencia 2014 Análisis de Alimentos. Centro, junio

22 TABLA RESUMEN ORIGEN Evento P35S T-nos P-nos nptii Pnos P35SnptII P35Scp -nptii cp- Tnos cp- T35S 35Sgus gus- Tnos Hawai Hawai Tailandia?? Jornadas de Referencia 2014 Análisis de Alimentos. Centro, junio

23 MÉTODOS DE EXTRACCIÓN Preparación de la muestra Pelar la fruta y separar la pulpa de las semillas Cortar en piezas y lonchas. Secar en estufa a 37ºC12 horas Almacenar a -80ºC Homogenizar con Nitrógeno líquido Jornadas de Referencia 2014 Análisis de Alimentos. Centro, junio

24 MÉTODO CTAB Método EN ISO 21571: mgde muestra triturada Eluirel extracto de ADN en 60 µldebuffer TE 0.1 MÉTODO WIZARD 200 mgde muestra triturada con 860 µlde buffer TNE (5mM Tris-HCL, ph 8.0, 2mM EDTA, 150mM NaCl, 1 % SDS). Añadir 100 µlde clorhidrato de guanidinay 40 µlde proteinasak. Incubar a 58ºC5 horas, mezclando ocasionalmente. La mezcla se centrifuga 10 mina g. Coger 500 µlde sobrenadante y añadir 10 µlde RNasa. Incubar 10 mina 65ºC. Purificar con las columnas Wizard DNA Clean-Up System(Promega, Madison, USA). GENESPIN DNA ISOLATION KIT Partimos de 200 mg de muestra triturada y siguiendo los protocolos del kit. Jornadas de Referencia 2014 Análisis de Alimentos. Centro, junio

25 ESTUDIOS CNA Nº Muestra Marca Comercial Procedencia Método de Extracción Kit comercial (GeneScan) Gen endógeno (papaina) Transgen Sunup TM Secuencias génicas analizadas Gen endógeno papaina (211bp) Sunup af/ar (152bp) Secuencias C.N.A. T-nos (118bp) P-35s (123bp) 1 Carica Pentágona Brasil CTAB + Nd + Nd Nd Nd Nd 2 Agronol Fruits Canarias CTAB + Nd + Nd Nd Nd Nd 3 Agronol Fruits Canarias CTAB + Nd + Nd Nd Nd Nd 4 Kipapaya Brasil CTAB + Nd + Nd Nd Nd Nd 5 HLB Tropical Food Brasil CTAB + Nd + Nd Nd Nd Nd 6 HLB Tropical Food Brasil CTAB + Nd + Nd Nd Nd Nd 7 Cozumel Canarias CTAB + Nd + Nd Nd Nd Nd 8 Cozumel Canarias CTAB + Nd + Nd Nd Nd Nd 9 Fyffes Brasil CTAB + Nd + Nd Nd Nd Nd 10 Caliman Brasil CTAB + Nd + Nd Nd Nd Nd 11 - Brasil CTAB + Nd + Nd Nd Nd Nd 12 - Brasil CTAB + Nd + Nd Nd Nd Nd 13 HLB Tropical Food Brasil CTAB + Nd + Nd Nd Nd Nd 14 - Dinamarca CTAB + Nd + Nd Nd Nd Nd 15 Trechas Méjico CTAB + Nd + Nd Nd Nd Nd 35s-Gus (250bp) Control endógeno papaya positivo: ADN pgse316 nat (Papaya) Control papaya MG: ADN pgse644 (SunUp TM papaya) Jornadas de Referencia 2014 Análisis de Alimentos. Centro, junio

26 Kits comerciales y materiales de referencia Kitforidentificationofgeneticallymodifiedpapaya. GMOIdentSunUp TM Eurofins GeneScan Ref KitGMOScreen35S/NOS EurofinsGeneScanRef / Material de Referencia plasmiddna pgse644(sunup TM Papaya) Eurofins GeneScan 0,15 ml (100 cp/ml) Ref Jornadas de Referencia 2014 Análisis de Alimentos. Centro, junio

27 ESTADO ACTUAL JRC: análisis de secuenciación de las muestras recibidas de GermanFederal Office y BelgianWallonAgriculturalResearchCentre. Comparación bioinformática de las secuencias disponibles publicadas de la variedad MG rainbow Presencia de muchos elementos genéticos en el nuevo genoma de la papaya: - secuencias de codificación de CP (Coatprotein), algunos aparentemente no funcional - elementos 35S y T-nos - nptii y genes de betalactamasas La organización de los tres fragmentos de inserción totalmente caracterizados, confirma los resultados de la detección realizada por la Oficina Federal Alemana. Algunos suplementos de papaya (cápsulas o comprimidos) se han encontrado elementos positivos 35S, T-nos y nptii Jornadas de Referencia 2014 Análisis de Alimentos. Centro, junio

28 MUCHAS GRACIAS Servicio de Biotecnología Mª Isabel Prieto Santos Silvia Gil Alcalde Josefina Gangoso Herreras Mª Luisa Salvador Pulgar Esther Rico Cañada Míriam Gómez Martín Mª del Camino Martín Forero Mercedes Fernández de la Puebla Mª Isabel Rodríguez Pérez Jornadas de Referencia 2014 Análisis de Alimentos. Centro, junio