Detección n de Avellana mediante ELISA. críticos en el control del método

Transcripción

1 CENTRO NACIONAL DE ALIMENTACIÓN Detección n de Avellana mediante ELISA. Puntos críticos en el control del método Mª del Camino Martín-Forero Servicio de Biotecnología

2 ÍNDICE I. Estudio comparativo entre diferentes kits de determinación n de avellana Elección n de un kit para acreditación II. Validación n cualitativa del kit 1. Determinación n de la especificidad 2. Control de la curva de ensayo 3. Comprobación n del Límite L de cuantificación

3 Corylus avellana Cor a 2 En la avellana el alergeno principal, denominado Cor a 1, es una proteína de 17 kda homóloga al alergeno principal del abedul. Cor a 12 Cor a 13 Cor a 8 Cor a 9 Cor a 11 Cor a 14

4 I.Estudio Comparativo kits ELISA de determinación n de Avellana AVELLANA Nombre del kit In Cura HazelnutAlert ELISA kit ELISA SYSTEMS OXOID Hazelnut ELISA R-BIOPHARM NEOGEN/TEPNEL ROMER LABS Ridascreeen FAST Hazelnut Biokits Hazelnut Assay Kit Veratox AgraQuant Hazelnut Método Indirecto Sándwich Sándwich Fast Sándwich Sándwich Sándwich Detección Proteína de avellana Proteína de avellana Avellana entera Avellana Avellana Avellana LQ 2-25 ppm 0,5ppm 2,5 mg/kg (ppm) 1,6-32 ppm 2,5-25ppm 1-40 ppm LD 1,5 ppm No disponible Curva de calibración Anticuerpos ppm Policlonales 0-0,5-1-2,5-5 ppm Proteína específica de avellana estable al calor Reactividad % Nuez No disponible Características de los kits de ensayo 1,5 ppm o 0,00015%Avellana en la muestra 0,1 ppm de avellana 0-2, ppm De 1,6 a 32 ppm No especificado Semillas de girasol 0 07%;semillas de lino (molidas) y almendras no detectables Policlonales proteínas especificas de avellana Nuez % Pecan % No disponible 0-2, ppm No especificado No disponible 0,3 ppm ppm Policlonales proteínas especificas de avellana No disponible

5 Elección n de cuatro sistemas ELISA para Estudio Comparativo Sistema ELISA Expresión n de resultado Límite de cuantificación 1 Proteína de avellana 0,5 mg/kg 2 Avellana 1 mg/kg 3 Avellana 2,5 mg/kg 4 Avellana 2,5 mg/kg

6 RESULTADOS INICIALES DUDOSAS NEGATIVAS POSITIVAS ETIQUETADO Puede contener trazas de avellana. Rastros de avellana. Trazas de frutos secos.. Frutos de cascara. No Figura Avellana entre sus ingredientes No contiene Frutos secos Contiene avellanas Con un x% de avellana Pasta de avellana PRESENCIA DE AVELLANA Nº de Muestras DETECTADO NO DETECTADO

7 DISTINTOS SISTEMAS ELISA LC 0,5 mg/kg (ppm) de Proteína de avellana LC 1 mg/kg (ppm) de Avellana LC 2,5 mg/kg (ppm) de Avellana LC 2,5 mg/kg (ppm) de Avellana MUESTRAS NO ETIQUETADAS No figura avellana entre Galleta con chocolate sus ingredientes Galleta multivitaminada No figura avellana entre sus ingredientes > 5 mg/kg 35 mg/kg 15,5 mg/kg > 20 mg/kg 0,7 mg/kg 2,9 mg/kg 4,9 mg/kg 8,3 mg/kg MUESTRA ETIQUETADA Phoskitos Avellana 2% NO DETECTADO NO DETECTADO 3,6 mg/kg NO DETECTADO MUESTRAS ETIQUETADO DUDOSO Mars Rastros de avellana NO DETECTADO NO DETECTADO NO DETECTADO NO DETECTADO Barquillo Puede contener trazas de nueces, almendras y soja NO DETECTADO DETECTADO NO DETECTADO NO DETECTADO Turrón Trazas de frutos secos NO DETECTADO NO DETECTADO NO DETECTADO NO DETECTADO Chocolate Rastros de cacahuete, avellana y almendra NO DETECTADO NO DETECTADO NO DETECTADO NO DETECTADO

8 II. VALIDACIÓN N CUALITATIVA DEL KIT DE ELECCIÓN 1. DETERMINACIÓN N DE LA ESPECIFICIDAD 2. CONTROL DE LA CURVA DEL ENSAYO 3. COMPROBACIÓN N DEL LÍMITE L DE CUANTIFICACIÓN ESTUDIO DE RECUPERACIÓN N EN MUESTRAS CARGADAS

9 1. DETERMINACIÓN N DE LA ESPECIFICIDAD MUESTRAS ETIQUETADO NÚMERO DE MUESTRAS MUESTRAS CONSIDERADAS POSITIVAS MUESTRAS CONSIDERADAS NEGATIVAS MUESTRAS CONSIDERADAS DUDOSAS Puede contener trazas de Avellanas Rastros de Avellanas Rastros de frutos secos Frutos de cáscara Entre sus ingredientes no figura la Avellana No contiene frutos secos Contiene Avellana Contiene un X% de Avellana Contiene Pasta de Avellana

10 2.- ESTUDIO DE LA CURVA DE CALIBRADO Variabilidad del patrón LC respecto al del certificado Estudio B/Bmax.

11 MATRÍZ INGREDIENTES V.REFERENCIA S2 V. OBTENIDO S2 MUESTRA Muesli.Barritas de cereales Pone cereales con avellanas D.O BS2/Bmax BS2/Bmax -25% BS2/Bmax +25% D. O Réplica D. O Réplica 2 D. O Media CV% BS2/Bmax D. O Media RESULTADO % 11% 19% % > 2.5 MUESTRAS POSITIVAS Muesli. Barritas cereales Barritas cereales. Avellanas Contiene pasta de avellana Contiene avellanas y pasata de avellanas % 11% 19% % > % 11% 19% % > 2.5 Phoskitos.Crash Avellanas 2% % 11% 19% % <2.5 Palitos de trigo con chocolate y avellanas Minis de Bollycao Avellanas 2.5% % 11% 19% % > 2.5 Pasta de avellana 1% % 11% 19% % > 2.5 M-Joy. Avellanas enteras Crema al cacao Knoppers Fruta y fibra Contiene avellanas Con un 5% de avellanas Con un 9% de avellana Contiene avellanas % 11% 19% % > % 11% 19% % > % 11% 19% % > % 11% 19% % > 2.5

12 MATRÍZ INGREDIENTES V.REFERENCIA S2 V. OBTENIDO S2 MUESTRA Copos de maíz Desayuno a la taza D.O BS2/Bmax BS2/Bmax -25% BS2/Bmax +25% D. O Réplica1 D. O Réplica2 D. O Media CV% BS2/Bmax D. O Media RESULTADO % 12% 20% % < % 12% 20% % < 2.5 MUESTRAS NEGATIVAS MiniDinosaurios Sabor chocolate % 12% 20% % < 2.5 Galletas chocomaría % 12% 20% % >2.5 Pan molde sin corteza % 12% 20% % < 2.5 Galletas multivitaminadas % 12% 20% % >2.5 Tableta de chocolate puro % 12% 20% % < 2.5 Fideos de chocolate % 12% 20% % < 2.5 KINDER MAXI CHOCOLATE % 12% 20% % < 2.5 KINDER DÉLICE CACAO % 12% 20% % < 2.5

13 MUESTRAS DUDOSAS MATRÍZ INGREDIENTES V.REFERENCIA S2 V. OBTENIDO S2 MUESTRA Bollo Qé caña. Mars Galletasc/chocol Petitbeurre Corazones barquillo Conguitos Turrón de cacahuete Cereales trigo y chocolate Helado. Conos de crema,nata,trufa M&m s Torrone nougat Puede contener trazas de avellana Rastros de avellana Puede contener trazas de avellana Puede contener trazas de: nueces, almendras, cacahuetes, soja. Puede contener trazas de otros frutos secos Trazas de frutos secos Puede tener indicios de cacah., frutos de cáscara y sésamo Frutos de cáscara y trazas de cacahuete Rastros de cacahuete, avellana y almendra Puede contener trazas de avellana D.O BS2/Bmax BS2/Bmax -25% BS2/Bmax +25% D. O Réplica1 D. O Réplica2 D. O Media CV% BS2/Bmax D. O Media RESULTADO % 12% 20% % 20% > % 12% 20% % 20% < % 12% 20% % 20% > % 12% 20% % 20% < % 12% 20% % 20% > % 12% 20% % 20% < % 12% 20% % 20% > % 12% 20% % 20% > % 12% 20% % 19% < % 12% 20% % 19% >2.5

14 3.- COMPROBACIÓN N DEL LÍMITE L DE CUANTIFICACIÓN ESTUDIO DE RECUPERACIÓN N EN MUESTRAS CARGADAS Materiales de Referencia

15 Soluciones de carga probadas 1. Nutella con un 13% de Avellana (Spike Instructions Allergens kits R-Biopharm ver.09/2010) 2. Suspensión de Avellanas enteras molidas, en Carboximetil Celulosa (Spike Instructions Allergens kits R-Biopharm ver.10/2012) 3. Suspensión de polvo de avellanas desgrasadas en tampón de extracción

16 Matrices cargadas con Nutella Nutella un 13% de avellana pura Preparación solución madre: Nutella en chocolate puro (Concentración aproximada 1000 mg/kg ) Preparación solución Intermedia (1:10): dilución en chocolate puro. ( Concentración de 100 mg/kg) Preparación muestra cargada: 1 g de matriz blanco con la cantidad correspondiente de solución intermedia

17 MATRIZ Adición (mg/kg) Resultado (mg/kg) Recuperación (%) 2,5 < 2,5 2,5 2, ,3 3,6 109,1 1 1, Resultados obtenidos CHOCOLATE A LA TAZA GALLETAS DE CHOCOLATE CHOCOLATE PURO 2,5 1, , ,5 1,81 72,4 5 6,07 121,4 2,5 1,51 60,4 5 5, ,5 0, ,5 70 2,5 1,12 44,8 5 3,38 67,6 2,5 1,31 52,4 5 3,42 68,4 2,5 1,93 77,2 5 2,41 48,2

18 Chocolate la taza Galletas de chocolate Chocolate puro Valor esperado Valor obtenido

19 Matrices cargadas con Suspensión n de Avellana-CMC Suspensión Carboximetil celulosa con Thimerosal y BSA: 12 g de CMC en 600 ml de agua (tras la disolución total se añaden 300 mg de Thimerosal y 1,5 g de BSA) Preparación solución madre: Pasta de Avellanas molidas (mezcla de tostadas y crudas). 50 mg de pasta de avellana se mezclan en 70 g de suspensión CMC Preparación solución Intermedia : dilución en PBS 0,01 M (ph 7,4) en tampón de extracción Preparación muestra cargada: 1 g de matriz blanco con la cantidad correspondiente de solución intermedia

20 Resultados obtenidos Dilución n en PBS MATRIZ Adición (mg/kg) Resultado (m/kg) Recuperación (%) CHOCOLATE PURO PAN DE MOLDE 2,5 2, ,23 64,6 2,5 1,79 71,6 5 2,60 52

21 Resultados obtenidos Dilución n en Tampón n de extracción MATRIZ Adición (mg/kg) Resultado (mg/kg) Recuperación(%) DESAYUNO A LA TAZA 2,5 1,35 54 Resultados obtenidos PAN DE MOLDE 5 2,92 58,4 2,5 1,24 49,6 5 2,86 57,2 CEREALES DESAYUNO TURRÓN DE CACAHUETE 2,5 1,27 50,8 5 1,89 37,8 5 2,9 58

22 Chocolate puro Pan de molde Chocolate taza Pan de molde Cereales Turrón cacahuete Solución n de carga con PBS Solución n de carga con Tampón n de extracción Valor esperado Valor obtenido

23 Matrices cargadas con Suspensión n de polvo de avellana desgrasada en Avellana molida en polvo: Tampón n de Extracción Se prepara una pasta de Avellanas molidas a partir de avellanas crudas y tostadas. Se desgrasan mediante tres lavados con Hexano. Centrifugación Se seca el sedimento durante toda la noche. Se vuelve a pesar para calcular el porcentaje de peso perdido por la eliminación de la grasa

24 Preparación solución madre: Se pesa la cantidad adecuada de polvo de Avellana y se diluye en tampón de extracción. Se calcula la concentración resultante teniendo en cuenta el porcentaje de grasa perdida en los lavados con hexano. Preparación solución Intermedia (1:10): Se realiza una dilución de la solución anterior en tampón de extracción. Preparación muestra cargada: Se mezcla mediante homogenización 1 g de matriz blanco con la cantidad correspondiente de solución intermedia

25 Resultados obtenidos MATRIZ Adición (mg/kg) Resultado (mg/kg) Recuperación( %) 2,5 1,75 70 CHOCOLATE A LA TAZA 5 3, ,5 1, >>20 -- CEREALES DESAYUNO TURRÓN DE CACAHUETE GALLETAS 2,5 2,09 83,6 5 4, , ,5 3, ,5 3, ,5 3, ,93 98,6

26 Valor esperado Valor obtenido 1 0 Chocolate taza Cereales desayuno Turrón cacahuete Barquillos

27 %Recuperación Matriz: chocolate Matriz: galletas NIVEL 2,5 mg/kg

28 %Recuperación Matriz:chocolate Matriz:galletas NIVEL 5 mg/kg

29 Comprobación n del Límite L de cuantificación n en diferentes matrices 6 matrices evaluadas: Turrón de cacahuete -Chocolate Cereales -Galletas Helado -Dietético 2 niveles de concentración: - 2,5 mg/kg (L.cuantificación) - 5 mg/kg 2 ensayos independientes, por analistas diferentes

30 RECUPERACIÓN N MEDIA MATRIZ 2,5 mg/kg 5 mg/kg Turrón de cacahuete 120% 118% Chocolate 76% 81% Cereales 81% 92% Galletas 111% 88% Helado 77% 101% Dietético 87% 106% Recuperación admitida: % Reproducibilidad interna: RSD R < 25%

31 Centro Nacional de Alimentación MUCHAS GRACIAS. Servicio de Biotecnología Mª Isabel Prieto Santos Mª del Camino Martín Forero Mercedes Fernández ndez de la Puebla Mª Isabel Rodríguez Pérez P Silvia Gil Alcalde Josefina Gangoso Herreras Esther Rico Cañada ada Mª Luisa Salvador Pulgar Miriam Jornadas Gómez Gde Referencia Análisis de Alimentos. Majadahonda de junio