CENTRO NACIONAL DE ALIMENTACIÓN

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María Rosario Maestre Suárez
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1 CENTRO NACIONAL DE ALIMENTACIÓN DETECCIÓN DE ALÉRGENOS EN ALIMENTOS Mª Isabel Prieto Santos Servicio de Biotecnología Jornada: Reglamento sobre Información Alimentaria al Consumidor: Compartir experiencias Madrid, 9 de diciembre de 2014

Biotecnología Jornada: Reglamento sobre Información

2 REGLAMENTO (UE) Nº 1169/2011 DEL PARLAMENTO EUROPEO Y DEL CONSEJO de 25 de octubre de 2011 Artículo 21 Etiquetado t de determinadas d sustancias o productos que causan alergias o intolerancias

3 REGLAMENTO (UE) Nº 1169/2011 (Anexo II): Sustancias que causan alergias o intolerancia: ALÉRGENOS ALIMENTARIOS Los alérgenos alimentarios son proteínas o glicoproteínas presentes de forma natural en los alimentos, tanto de origen vegetal como animal

alimentarios son proteínas o glicoproteínas presentes de forma

4 PRINCIPALES MÉTODOS DE ANÁLISIS DE ALERGENOS DETECCIÓN PROTEÍNA O PROTEÍNAS ALERGÉNICAS ADN PCR MÉTODOS INMUNOLÓGICOS ELISA TIRAS INMUNOREACTIVAS (LFD) MÉTODOS CROMATOGRÁFICOS LC MS/MS

5 1. MÉTODOS INMUNOLÓGICOS Métodos basados en la detección de una o más proteínas o fragmentos proteicos (alérgeno), mediante la unión específica antígeno anticuerpo

6 Enzimoinmunoensayo i ELISA ALÉRGENO PRESENTE EN EL ALIMENTO Centro Anticuerpo específico Desarrollo del color Segundo Anticuerpo Conjugado Enzima Lectura de Absorbancia

7 AgraQuant TEPNEL BIOKITS Límite de cuantificación : < 2,5 mg/kg g AgraQuant R Biopharm Neogen ELISA Systems Huevo 0,4 mg/kg 0,5 mg/kg 2,5 mg/kg 1 mg/kg Caseína 0,2 mg/kg 0,25 mg/kg 2,5 mg/kg 1 mg/kg Avellana 1 mg/kg 2,5 mg/kg 2,5 mg/kg 0,5 mg/kg Soja 40 μg/kg 2,5 mg/kg 2,5 mg/kg 2,5 mg/kg Crustáceos 20 μg/kg 0,5 mg/kg 2,5 mg/kg 0,05 mg/kg

0,2 mg/kg 0,25 mg/kg 2,5 mg/kg 1 mg/kg Avellana 1 mg/kg 2,5 mg/kg 2,5 mg/kg 0,5

8 Tiras inmunocromatográficas (FDL) / dipsitck NEGATIVO POSITIVO

9 Tiras inmunocromatográficas (FDL) / dipsitck Muy sencillos Cualitativos / semicuantitativos Rápidos ( 5 minutos) Útiles Control de Riesgo, verificación zonas de limpieza, muestreo ambiental, screening en alimentos Disponibles para muchos alérgenos Sensibilidad declarada ( entre 1 mg/kg 10 mg/kg ) Requieren confirmación

zonas de limpieza, muestreo ambiental, screening en alimentos Disponibles para

10 2. MÉTODOS CROMATOGRÁFICOS Digestión Enzimática LC MS/MS Péptidos PROTEÍNA Alergénica Cromatografía: HPLC LC MS/MS LIMITACIONES: Mayor dificultad analítica VENTAJAS : Varias dianas en un único análisis Estandarizar losmétodos

MS/MS LIMITACIONES: Mayor dificultad analítica VENTAJAS

11 3. ANÁLISIS DE ADN (PCR) MÉTODO INDIRECTO: Amplificación de un fragmento del gen del alérgeno o de alguna secuencia genética específica indicativa de la especie alergénica Kits comerciales (Límite de sensibilidad declarado < de 2,5 ppm de alimento alergénico)

específica indicativa de la especie alergénica Kits comerciales

12 MÉTODOS ÉO OSIN INMUNOLÓGICOS vs MÉTODOS ÉO OSA ADN PROTEÍNAS ADN SISTEMA DE Alérgeno o proteína Fragmentos de ADN DETECCIÓN alergénica ESPECIFICIDAD SENSIBILIDAD CUANTIFICACIÓN Alta (AMb específicos) Alta Alta (secuencias de ADN, que codifican la proteína alergénica o específicas del alimento) Alta < 25mg/kg 2,5 10 copias de ADN Cuantitativo (cuantifica la proteína especifica) Cualitativo/ cuantitativo (cantidad de ADN)

Alta Alta (secuencias de ADN, que codifican la proteína alergénica o específicas del alimento) Alta <

13 PROTEÍNA ADN TIEMPO DE ANÁLISIS 1 hora 6 horas 1 2 días REALIZACIÓN DISPONIBILIDAD EQUIPAMIENTO Sencillo Disponible para la mayoría de alérgenos Lector de microplacas Sencillo (con alguna experiencia) Disponible para la mayoría de alérgenos Termociclador Equipo PCR en tiempo real Reglamento (UE) 1169/2011

Lector de microplacas Sencillo (con alguna experiencia) Disponible para la

14 DIFICULTAD EN LA EXTRACCIÓN PROTEÍNAS ADN Complejidad de la matriz Proteína alergénica Componentes del alimento Presencia de inhibidores Polifenoles Taninos Grasas

15 ESTABILIDAD PROTEÍNAS ADN Modificación de estructura ADN mayor estabilidad de las proteínas al procesado Productos hidrolizados Calentamiento durante el procesado (horneado, pasteurizado) Matriz grasa X Fragmentación de las proteínas Productos ácidos X (Proteínas hidrolizados) Acidez? Productos Fermentados (ej. Salsas) Productos refinados (ADN / PROTEÍNA ALERGENICA)

pasteurizado) Matriz grasa X Fragmentación de las proteínas Productos ácidos X (Proteínas

16 UNIDAD DE MEDIDA/EXPRESIÓN DE RESULTADOS PROTEÍNAS ADN Cantidad de ingrediente alergénico o proteína alergénica por kilo de alimento (mg/kg) Cantidad de ADN (nº de copias) detectado por mg de alimento No se puede establecer una correlación entre cantidad de PROTEÍNA y cantidad de ADN

(mg/kg) Cantidad de ADN (nº de copias) detectado por mg de alimento No

17 Qué método elegir?

18 Criterios de elección? Centro Tipo de matriz Matriz grasa ADN X ELISA Productos hidrolizados ADN ELISA X Naturaleza del alérgeno buscado Apio ADN Inespecificidad Poca cantidad de ADN ELISA

19 ACTUACIONES CNA: Avellana (ELISA vs PCR) Centro Secuencia diana : Gen que codifica la proteína Cor a 1 COMPONENTE [ ] INICIAL [ ] FINAL µl/reacción TaqMan Universal (BioRad) 12,5 Primer F 10µM 300nM 0,75 Primer R 10µM 300nM 0,75 Sonda 10µM 200nM 0,50 Agua libre de nucleasas 5,5 ADN 5 Volumen Total 25 ETAPA Tª (ºC) TIEMPO (s) Nº de CICLOS 1 DESNATURALIZACIÓN AMPLIFICACIÓN EXTENSIÓN

Primer R 10µM 300nM 0,75 Sonda 10µM 200nM 0,50 Agua libre de nucleasas 5,5 ADN 5 Volumen Total 25

20 Sensibilidad del ensayo Centro Preparación de solución de trabajo : 20 ng/ul de ADN Curva: Concentración de 100 ng 0,005 ng CONCENTRACIÓN CURVA 1 CURVA 2 CURVA 3 CURVA 4 CURVA 5 CURVA 6 SD ng ST , , , , , ,1843 1,55 ST , , , , , ,3769 1,61 ST3 1 28, , , , , ,8476 1,59 ST4 01 0,1 31, , , , , , ,57 ST5 0,01 33, , , , , ,3649 1,43 ST6 0,005 36, , , , , ,5891 1,39 Pendiente 3,189 3,227 3,173 3,339 3,435 3,339 R 2 0,992 0,999 0,997 0,993 0,998 0,999 Eficiencia 106% 104% 107% 99% 96% 99% Sensibilidad: 0, ng de ADN de avellana El tamaño del genoma de C.avellana es 0,48 pg (Bennett MD, Smith JB (1991) Philos Trans R Soc London B 334: ) LD absoluto de 10 copias de genoma de avellana

32,27672767 30,8308 29,3236 28,1851 157 1,57 ST5 0,01 33,3778 32,8995 35,3786 34,6325 32,8088 31,3649 1,43 ST6 0,005 36,6321 34,1201 35,6541 35,0809 34,3196 32,5891 1,39 Pendiente 3,189 3,227 3,173

21 Comparación ELISA/PCR sobre muestras reales MUESTRAS ELISA (mg/kg) PCR Bollo 8 DETECTADO Galleta de chocolate > 20 DETECTADO MUESTRAS DUDOSAS (Puede contener trazas Galletas < 2,5 NO DETECTADO Bombón > 20 DETECTADO de avellana) Turrón de cacahuete < 2,5 DETECTADO Cereales de trigo y chocolate > 20 DETECTADO MUESTRAS POSITIVAS (Figura avellana como ingrediente) MUESTRAS NEGATIVAS (No figura avellana como ingrediente) Centro Barrita de cereales > 20 DETECTADO Muesli > 20 DETECTADO Barrita de trigo y chocolate > 20 DETECTADO Cereales Fruta y fibra > 20 DETECTADO Barquillo relleno de cacao > 20 DETECTADO Bizcocho cubierto de chocolate < 2,5 NO DETECTADO Copos de maíz < 2,5 25 NO DETECTADO Desayuno a la taza < 2,5 NO DETECTADO Galleta < 2,5 NO DETECTADO Pan de molde < 2,5 25 DETECTADO Galleta con vitaminas 9 DETECTADO

22 Soja (ELISAvs PCR) Centro ETIQUETADO CONTIENE SOJA PUEDE CONTENER TRAZAS DE SOJA NO FIGURA SOJA COMO INGREDIENTE MUESTRA RESULTADO ELISA RESULTADO (mg/kg) PCR Gllt Galletas > 20 DETECTADO Helado chocolate blanco > 20 NO DETECTADO Hamburguesa de vacuno > 20 DETECTADO Salchichas queso > 20 DETECTADO Chopped vegetal > 20 DETECTADO Barquillo de nata < 2,5 DETECTADO *( lecitina de soja) Tofu > 20 DETECTADO Postre de soja > 20 DETECTADO Magdalenas < 2,5 NO DETECTADO Sopa de pollo < 2,5 NO DETECTADO Desayuno a la Taza < 2,5 NO DETECTADO Sobaos < 2,5 NO DETECTADO Batido de chocolate < 2,5 NO DETECTADO Zumo de 10 frutas < 2,5 NO DETECTADO Salsa rosa < 2,5 NO DETECTADO Margarina < 2,5 NO DETECTADO Chorizo < 2,5 NO DETECTADO Yogurt < 2,5 NO DETECTADO Jamón cocido < 2,5 NO DETECTADO Crema de espárragos < 2,5 NO DETECTADO Galletas < 2,5 NO DETECTADO

23 Cómo garantizar los resultados? VALIDACIÓN INTERNA : Es la confirmación, a través del examen y el aporte de evidencias objetivas, de que se cumplen los requisitos particulares para un uso especifico previsto (Norma UNE/IEC 17025: 2005) OBJETO: Comprobar que los resultados indicados por el fabricante son reproducibles en el laboratorio PRECISIÓN DEL MÉTODO EXACTITUD DEL MÉTODO LD/LC repetibilidad Reproducibilidad Comprobar en distintas matrices Aceptable (Recuperación 80% 120%) LD límites de detección LC Límites de cuantificación LABORATORIO ACREDITADO Norma UNE/IEC 17025: 2005

24 Armonización de los métodos de detección UNE EN :2009. Productos alimenticios: Detección de alérgenos mediante métodos inmunológicos Parte 1: Consideraciones generales UNE EN :2009. Productos alimenticios: Detección de alérgenos mediante métodos de biología molecular Parte 1: Consideraciones generales UNE EN 15842:2010. Productos alimenticios: Detección de alérgenos Consideraciones generales y Validación de métodos UNE EN IN :2012. Productos alimenticios: Detección de alérgenos alimenticios. Formato para proporcionar información sobre métodos inmunológicos y métodos de biología molecular VALIDACION DE MÉTODOS POR ORGANISMOS INTERNACIONALES

25 Muchas Gracias Directora del CNA Mª Teresa López Esteban Servicio de Biotecnología Mª Isabel Prieto Santos

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