Citocinas y Quimiocinas.

Transcripción

1 Citocinas y Quimiocinas. Bqca. Esp. Grenón Sandra L. Bqca. Esp. Mereles, Beda E. Bqco. Esp. Salvi Grabulosa, Marcelo. Bqco. Esp. Payes Monzón, Federico. Bqca. Benitez Jesica D. Cátedra de Inmunología de Bioquímica y Farmacia. Facultad de Ciencias Exactas Química y Naturales. Universidad Nacional de Misiones

2 El presente trabajo corresponde a una recopilación bibliográfica, acompañado de imágenes diseñado para facilitar la comprensión del alumno, respecto a los mediadores químicos. El mismo abarca: citocinas, definiciones, propiedades, clasificaciones, principales funciones en la respuesta inmune; receptores transmembrana y solubles, estructura, mecanismo de señalización; quimiocinas: estructura, clasificación y receptores. Para profundizar sobre el tema puede consultar la bibliografía detallada al final del capítulo. Cátedra de Inmunología. Carrera de Bioquímica y Fármacia. Facultad de Ciencias Exactas Química y Naturales. Universidad Nacional de Misiones.

3 CITOCINAS Qué son? Las citocinas son proteínas solubles pequeñas producidas y secretadas en forma transitoria por efecto de un estímulo. Pueden alterar el comportamiento o las propiedades de la propia célula o de otras células. Son liberadas por muchas células además de las del sistema inmunitario. Éstas representan el lenguaje universal de las células, y gracias a ellas las células reconocen lo que está ocurriendo a su alrededor y establecen en consecuencia una respuesta. Las citoquinas participan, entre otros, en la proliferación y diferenciación celular, la hematopoyesis, la actividad microbicida, la reacción inflamatoria, la respuesta inmune específica y no específica, y en procesos relacionados con el desarrollo de los organismos vivos. Regulan la respuesta inmune, induciendo o inhibiendo la producción de otras citoquinas y sus respectivos receptores así como activando mecanismos de transducción de señales en células blanco o sobre ellas mismas. El número de citoquinas descubiertas ha ido en continuo aumento en los últimos años, así como los conocimientos en cuanto a los mecanismos regulatorios de éstas. Un conjunto particular de citoquinas corresponde a la familia de las quimioquinas las que en total suman actualmente tantas como el resto de las citoquinas. Este grupo variado de moléculas tienen diferentes designaciones. Un ejemplo conocido son las interleucinas (IL seguida de un número, IL-2), nombre con las que se conoce a la mayoría de las citocinas producidas por células T. En la Tabla N 1 se detalla la nomenclatura.

4 Tabla Nº1. Nomenclatura de Citocinas. Fuente: Descubrimiento de las citoquinas Descubrimiento de la primera citoquina, IFN Descripción de sobrenadantes con diferentes actividades biológicas Se descubrió la primera linfoquina, MIF, factor producido por los linfocitos que inhibe la migración de los macrófagos in vitro 1969 Definición de linfoquinas y monoquinas. Terminología inexacta Se acuñó el término de citoquina Definición de interleuquinas, IL-1 e IL-2. Principios de 1980: purificación de citoquinas por métodos bioquímicos 1981 Se utilizó por primera vez una citoquina en clínica humana, IFN-α Mediados de clonamiento mediante técnicas de biología molecular de las citoquinas Se utilizó IL-2 en clínica humana Clonamiento de MIF 1990 Se clonaron los receptores para varias citoquinas 1993 Mecanismos de transducción de señal de las citoquinas. Caracterización de PTK y STAT asociadas a las respuestas de las distintas citoquinas

5 PROPIEDADES GENERALES DE LAS CITOQUINAS La mayor parte de las citoquinas han sido caracterizadas en cuanto a: Peso Molecular, Secuencia de DNA Secuencia de aminoácidos, e incluso los genes que codifican para ellas han sido localizados a nivel de cromosomas tanto en humanos como en ratón. Los receptores de las citoquinas y sus mecanismos de acción molecular han sido también ampliamente estudiados en los últimos años La secreción de citoquinas es un acontecimiento breve y autolimitado. Son muy potentes y actúan a bajas concentraciones. Las citoquinas son factores proteicos solubles, producidos transitoriamente frente a un estímulo. La producción de citoquinas es controlada a nivel transcripcional y existe un segundo nivel de control dado por la inestabilidad de los mrna. La acción de las citoquinas es local, pudiendo en algunos casos, ejercer su función sobre la misma célula productora de la citoquina (actividad autócrina) o sobre células vecinas (actividad paracrina). En algunos casos pueden tener actividad endócrina cuando son producidas en grandes cantidades y pasan a la circulación (Fig.1) Se unen a receptores específicos de la membrana de las células donde van a ejercer su función, ocasionando un reordenamiento en la membrana celular que produce la activación de proteínas que

6 se encuentran en forma latente en el citoplasma, desencadenando una cascada de reacciones que lleva a los efectos que se les conoce a las citocinas. Poseen una afinidad elevada al receptor. Fig.2. Fuente Kuby Inmunology. 6ta Ed Las citoquinas son pleiotrópicas y redundantes (Fig.2, Fig.3), lo que quiere decir que una citoquina puede ejercer una actividad funcional sobre varios tipos celulares y que una determinada función puede ser realizada por diferentes citoquinas, respectivamente. Fig.3. Fuente Kuby Inmunology. 6ta Ed Las citoquinas en general son producidas por una gran variedad de células, como es el caso de la IL-1 la cual es producida por todas las células nucleadas. Los linfocitos T y los macrófagos son las células que producen la mayor diversidad de citoquinas, aunque casi cualquier célula es capaz de producir citoquinas ante determinados estímulos. La producción de una citoquina desencadena variadas reacciones. Induce la secreción de al menos otra citoquina, puede suprimir la actividad de otras citoquinas o bien puede inducir una cascada de citoquinas (Fig.4)

7 La cantidad de citoquina producida tiene relación con la actividad biológica de ella misma. A menudo, las citoquinas actúan en sinergia o en forma antagónica. Sinergismo: dos o más citoquinas producen un efecto que se potencia mutuamente. Por ejemplo: la acción conjunta de IL-4 e IL-5 induce en células B el cambio de clase para que produzcan Ig E (Fig.5) Antagonismo: inhibición o bloqueo mutuo de sus efectos. Por ejemplo: el IFN-gamma bloquea el cambio de clase promovido por IL-4 (Fig.5). Fig.5. Fuente: Kuby Inmunology.6ta Ed Por otra parte, una citoquina puede inducir la expresión de su propio receptor en la célula que la está secretando o en células vecinas, o bien puede inducir la expresión de un receptor para otra citoquina. Las propiedades de las citoquinas demuestran que existe una red de interacciones celulares muy compleja y difícil de estudiar en los organismos vivos. Resumen de Propiedades.

8 Familias estructurales de citocinas. Citocinas de tipo I: IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-9, IL-11, IL-12, IL-13, IL-15 y varios factores de crecimiento hematopoyético. Citocinas de tipo II: IFN (α, β, γ), IL-10, IL-19, IL-20, IL-22, IL-24, IL-28, IL-29. Familia de TNF: FNT. Miembros de la superfamilia de inmunoglobulinas: IL 1 y quimiocinas. Clasificación según el Patrón de Secreción. Citoquinas de la respuesta inmune innata. Citoquinas de la respuesta inmune especifica. Factores de crecimiento hematopoyético. Quimiocinas. PRINCIPALES ACTIVIDADES BIOLÓGICAS DE LAS CITOQUINAS Las citoquinas participan principalmente en la respuesta inmune innata, reacción inflamatoria, en la respuesta inmune específica o adquirida y en la hematopoyesis. Estas actividades se manifiestan en la proliferación y diferenciación celular, la inducción de la síntesis de proteínas o de mrna, su participación en la activación celular, su papel como factores quimiotácticos y también su participación en fenómenos como la apoptosis. 1. Inmunidad innata Un organismo puede ser infectado por numerosos tipos de patógenos, para lo cual se dequiere de diferentes medios para su eliminación, además de diversos mecanismos efectores. Las células implicadas en la inmunidad innata o natural son capaces de desarrollar diferentes funciones y de discriminar en función del patógeno qué tipo de función efectora debe ser activada. Estas señales son inducidas por el patógeno sobre las células efectoras de la inmunidad natural. Cada tipo de célula efectora una vez activada producirá diferentes citoquinas

9 dependiendo de la naturaleza del patógeno. Estas citoquinas producidas tempranamente en la infección, determinan finalmente el tipo de respuesta del sistema inmune específico. Por lo tanto la inmunidad innata y específica, están integradas en la respuesta inmune. Fig.6. Células Productoras y Efectos de INFα/β 1.1. Inmunidad antiviral Existen dos tipos de respuestas a la infección por un virus. En primer lugar se estimula la producción de interferones de tipo I, es decir INF-α o IFN-β, los cuales tienen como función inhibir la replicación viral. Por otra parte, la infección viral provoca la activación de las células NK las cuales son capaces de matar una amplia variedad de células infectadas por virus. Los IFNs de tipo I aumentan además la actividad lítica de las células NK, las cuales pueden matar en forma más eficaz las células infectadas. Los macrófagos son las mejores células productoras de IFN-α y por esto se lo llama interferón leucocitario (Fig.6). El IFN-β consiste de un único producto génico, localizado en la misma región cromosómica del IFN-α. Estos dos tipos de interferones presentan muy poca homología estructural, sin embargo se unen al mismo receptor celular.. Los interferones inducen diversos efectos sobre las células (Fig.7) Inhiben la replicación del RNA o DNA viral mediante la síntesis de varias enzimas. Esta acción de los interferones es paracrina, es decir, su acción se lleva a cabo en las células vecinas que no han sido infectadas. Este efecto es conocido como la inducción del estado antiviral en el cual la proliferación celular es inhibida. Los interferones de tipo I aumentan la expresión de las moléculas de histocompatibilidad de clase I (MHC clase I) e inhiben la expresión de las moléculas MHC clase II. Ya que los linfocitos citotóxicos (LTc) reconocen los antígenos en función de las moléculas MHC clase I, la acción de este tipo de

10 interferón favorece el desarrollo de una respuesta inmune específica celular de tipo Th1. Fig. 7. IFN Tipo I ( IFN α, IFN β). Sus acciones protegen al organismo de las infecciones víricas y favorecen la inmunidad celular frente a microorganismos intracelulares. Fuente: Nature Reviews/Immunology Citoquinas e inflamación. La inflamación es una respuesta fisiológica normal al daño, ya sea mecánico o infeccioso. En las primeras etapas se encuentra localizada, pero luego puede desarrollarse una respuesta sistémica. Las principales alteraciones observadas son: coagulación, exudación plasmática, activación del sistema del complemento, diapédesis y migración leucocitaria, activación de células mononucleares y polimorfonucleares y producción de mediadores solubles, entre ellos citoquinas. Todos los procesos inflamatorios, ya sean de origen inmune u otro, llevan consigo la activación de macrófagos residentes y la infiltración de leucocitos desde la sangre. La activación induce cambios en las células entre los cuales se incluyen la producción de citoquinas. Determinadas citoquinas originan directa o indirectamente la cascada de eventos que genera otros mediadores esenciales en la respuesta inflamatoria. De las numerosas citoquinas presentes en el sitio de la inflamación, dos de ellas, IL-1 y TNF-α, juegan un papel fundamental. Algunas de sus acciones sobre diversos tipos

11 celulares son: la producción de mediadores lipídicos, enzimas proteolíticas y radicales libres, todos elementos involucrados en el daño observado. IL-1 y TNF-α ejercen su actividad citotóxica sobre tejidos como el endotelio vascular, el cartílago, los huesos, músculos y las células de los islotes de langerhans. Otras citoquinas, tales como el IFN-, IL-3 o GM-CSF, que pueden ser producidas por otras células presentes o atraídas al sitio de la inflamación, las cuales actúan amplificando la respuesta inflamatoria y aumentando la producción de IL-1 y TNF-α por los macrófagos. Las citoquinas producidas en el sitio de la inflamación participan directamente en el reclutamiento de leucocitos en el foco inflamatorio (ver más adelante). Este efecto es mediado por la producción de quimioquinas, tales como IL-8 y MCP-1 ( Monocyte Chemoattractant Protein ). Además, en células endoteliales, IL-1, TNF-α e IFN-, inducen la expresión de moléculas de adhesión tales como ICAM-1 ( Intercellular Adhesion Molecule 1 ) y VCAM ( Vascular Cell Adhesion Molecule ) participando de esta manera directamente en la adherencia de células sanguíneas. Por otra parte, IL-1, TNF- α e IL-8 alteran la permeabilidad vascular y permiten una extravasación de proteínas plasmáticas. La IL-6, muy abundante en los procesos inflamatorios, induce la producción de las proteínas de fase aguda en los hepatocitos y la respuesta febril junto a IL-1 y TNF-α. Lo mismo ocurre con IL-11 y LIF. La reacción inflamatoria es inhibida por varias citoquinas antiinflamatorias, entre las cuales se encuentran TGF β ( Transforming Growth Factor beta ), IL-4 e IL-10 que inhiben la producción de IL-1 y de TNF-α. Los glucocorticoides tienen igualmente esta capacidad y son producidos por una cascada de eventos iniciada por IL-1, TNF-α e IL-6 a través del sistema o eje neuro-endocrino. Las prostaglandinas inducidas por IL-1 (Fig.8) y TNF-α causan muchos de los efectos observados en la inflamación. La producción de radicales libres, principalmente óxido nítrico (NO), es altamente eficiente en la eliminación de microorganismos.

12 Sin embargo, el estrés oxidativo provocado por los radicales libres, daña numerosas células. La producción de NO es inducida fuertemente a través de IL-1 y TNF-α en células endoteliales, monocitos/macrófagos y fibroblastos. Fig. 8. IL 1. Producida por macrófagos activados. Efectos similares al TNF-α, mediando la respuesta inflamatoria del huésped a las infecciones y otros estímulos inflamatorios. En bajas concentraciones actúa como mediador de la inflamación local pero a altas concentraciones entra en circulación y ejerce efectos endocrinos.

13 Tabla Nº2.Resumen de los Efectos Biológicos de las Principales Citoquinas que participan en la Inflamación. Citoquina Efecto Biológico Célula productora IL-1a, IL-1b Proinflamatorias. Inducen la síntesis de RFA. Monocitos y macrófagos. IL-6 Proinflamatorias. Inducen la síntesis de RFA. Estimula secreción de Ig. Monocitos macrófagos. y TNF-α IL-10, IL-19, IL-20, IL-22 IL-12 IL-18 Proinflamatorias. Responsable del shock endotóxico. Induce la expresión de moléculas de adhesión. Inmunosupresoras. Inhiben la secreción de citoquinas y otros mediadores proinflamatorios y expresión de MHC-II y moléculas de adhesión en monocitos. Estimulan a LB e inducen síntesis de Ig. Inductor de diferenciación Th 1. Estimula actividad citotóxica de LT y NK. Estimula actividad citotóxica de LT y NK. Monocitos, macrófagos LT. y Monocitos, macrófagos, LT y LB. Monocitos macrófagos. y IL-23 Estimula actividad citotóxica de LT y NK. INF-α, INF-β Efecto antiproliferativo e inmunomodulador. Actividad antitumoral

14 2. Citoquinas y respuesta inmune Adaptativa. Las citoquinas regulan una gran variedad de respuestas inmunes, estimulando o inhibiendo el crecimiento y la diferenciación de las células que componen el sistema inmune. Las citoquinas seleccionan el tipo de respuesta inmune y también los mecanismos efectores. Tabla Nº3. Principales Citoquinas que participan en la Respuesta Inmune Adaptativa. Citoquina Efecto Biológico Célula productora IL-2 IL-4 Proliferación de LT. Activación y proliferación de NK. Proliferación de LB. Promueve la diferenciación a Th 2; cambio de isotipo a Ig E. Células T Células Th 2 y mastocitos IL-5 Activación y generación de eosinófilos. Células Th 2 TGF-β IFN-γ Inhibe proliferación de LT y LB. Promueve cambio de isotipo a Ig A. inhibe a los macrófagos. Activa a macrófagos. Aumenta la expresión de MHC 1 y 2.Incrementa la presentación antigénica LT, macrófagos y otros tipos celulares. Células Th 1, células T CD8+, NK 2.1. Citoquinas y diferenciación de células linfoides En un estado temprano del desarrollo en el timo, algunas citoquinas entre las cuales se incluyen SCF ( Stem Cell Factor ), IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-6, IL-7 y TNFα, pueden jugar un papel importante en la diferenciación de los linfocitos T. Las células que conforman el estroma tímico interactúan con los timocitos en los diferentes estados de desarrollo y regulan la producción de citoquinas de todo el sistema.

15 La combinación de SCF, IL-3, IL-6 e IL-7 mantienen el crecimiento de las células troncales hematopoyéticas provenientes de la médula ósea. IL-1 e IL-7, así como TNF-α, están involucradas en la maduración de los precursores tempranos de los timocitos CD3-CD4-CD8- hacia el estado de células pro-t que luego pueden dar origen a linfocitos T funcionalmente competentes. IL-2 participa en la posterior diferenciación de las células T (Fig.9). Finalmente, las citoquinas influencian también el reordenamiento del receptor de los linfocitos T (TCR). Fig.9. IL-2 Actúa sobre la misma célula productora, estimulando la proliferación y síntesis 2.2. Células Th1 y Th2 Polarización de las células T "helper" Los LT CD4 + pueden diferenciarse a diferentes tipos de células efectoras. En la actualidad se conoce la existencia de las siguientes subpoblaciones: LTh1, LTh2, LTh3, LTh17, LTreg1, LTfh (Fig.10) Fig.10. Subpoblaciones de LT de acuerdo al patrón de citocinas que lo activan.

16 Estas subpoblaciones difieren en el espectro de citoquinas que ellas secretan una vez que son activadas. De éstas, los linfocitos Th1 y Th2 son los más conocidos: los linfocitos LTh1 secretan IL- 2, IFN-, TNF-α y los Th2 secretan IL-4, IL-5, IL-10 (Fig.11, Fig. 12) Fig. 11. Patrón de secreción de citocinas que diferencian Th1 de Th2. Fig.12. IL-4. Es el ppal. estimulo para la síntesis de Ig E y el desarrollo de Th 2 a partir de LT CD4+ vírgenes. Única citoquina que activa a STAT 6

17 La polarización de los linfocitos T se debe a una secreción temprana de citoquinas por células que participan probablemente en la inmunidad natural, como son macrófagos, células NK y en algunos casos incluso células epiteliales. La secreción de citoquinas por estas células accesorias depende de la naturaleza del antígeno, de la vía de introducción del antígeno así como de la concentración del antígeno (Fig. 13, Fig.14) Fig.13. Polarización hacia LT CD 4+ Th 1 Fig. 14. Polarización hacia LT CD4+ Th2. Las células Th1 y Th2 regulan mutuamente su actividad a través de la producción de citoquinas inhibitorias de la proliferación de una u otra subpoblación. IFN- e IL-4 son antagónicas en el desarrollo de células Th2 o Th1, respectivamente (Fig.15).

18 2.3. Activación de linfocitos B. Las citoquinas tienen dos funciones principales en las respuestas mediadas por inmunoglobulinas: participan en las fases proliferativas y de diferenciación de los linfocitos B y promueven selectivamente el cambio de clase de las inmunoglobulinas ( switch isotípico). Numerosas citoquinas pueden estimular la proliferación de los linfocitos B. De las citoquinas producidas por los linfocitos Th, IL-2, IL-4 e IL-5 participan en la proliferación y además pueden actuar en sinergia para llevar a cabo este efecto. La IL-6, que es producida por varios tipos celulares, principalmente macrófagos y células endoteliales, participa en la proliferación de los linfocitos B ya diferenciados productores de anticuerpos (plasmocitos). IL-1, IL-10 y TNF estimulan su crecimiento in vitro. La redundancia de las citoquinas involucradas en la proliferación de los linfocitos B explica en parte por qué al bloquear la producción de una determinada citoquina, esto no tiene efecto en la producción de anticuerpos (Fig.16). Fig. 16. IL 6. Actúa en la inmunidad innata y la adaptativa. En la inmunidad innata estimula la síntesis de RFA en los hepatocitos. En la inmunidad adaptativa estimula el crecimiento de los linfocitos B que se han diferenciado en productores de Ac. Las citoquinas participan directamente en la secreción de anticuerpos en respuesta a un antígeno. IL-2 e IL-6 aumentan la producción de anticuerpos. La función más específica de las citoquinas sobre los linfocitos B es su participación en el

19 cambio de isotipo de la inmunoglobulina secretada. Los ejemplos más claros de esta función de las citoquinas son IL-4, la cual es absolutamente necesaria para la producción de IgE e IFN- que está implicado en la producción de IgG2a. TGF-β en conjunto con IL-5 participan en el cambio de isotipo a IgA. La afinidad de las inmunoglobulinas secretadas por los linfocitos B depende también de las citoquinas presentes en el sitio donde se está llevando a cabo la reacción Respuesta inmune específica mediada por células Los linfocitos T CD4+ y CD8+ activados secretan un grupo de citoquinas que sirven para activar células efectoras de la respuesta inmune no específica o natural. Estas citoquinas comprenden el interferón inmune o IFN-, TNF-β o linfotoxina, IL-10, IL-5 e IL-12. Todas estas citoquinas producen la activación de numerosos tipos celulares entre los cuales los principales son macrófagos, células NK, linfocitos T y B, células endoteliales, neutrófilos y eosinófilos (Fig.17). El IFN- es producido por los linfocitos T CD4+ del tipo Th1, T CD8+ y células NK, como consecuencia inmediata de la activación de la respuesta inmune específica y es estimulada por IL-2 e IL-12. Funciones de El IFN- Más potente activador de los macrófagos para matar microorganismos fagocitados o células tumorales. Actúa a nivel de la fase de reconocimiento en la respuesta inmune, mediante la estimulación de la síntesis de moléculas MHC de clase I y la inducción de la síntesis de moléculas MHC de clase II en numerosos tipos celulares que normalmente no las expresan. Activa tanto células T CD4+ como T CD8+. Promueve la diferenciación de los linfocitos T CD4+ hacia el fenotipo Th1 e inhibe la proliferación de células Th2. La maduración de los linfocitos T CD8+ hacia LTc requiere de su presencia.

20 Actúa sobre los linfocitos B estimulando el cambio de isotipo de las inmunoglobulinas hacia IgG2a e Ig3, al mismo tiempo que inhibe el cambio a IgG1 e IgE. Estimula la actividad citotóxica de las células NK y activa los neutrófilos, aunque de manera menos eficaz que TNF-α o LT. Sinergiza la actividad de TNF-α o LT. Estimula la síntesis de numerosas otras proteínas, entre otras, moléculas de adhesión en células endoteliales vasculares, lo que facilita la extravasación de linfocitos T CD4+. Todas estas acciones del IFN-γ conllevan a respuestas del tipo Th1 y estimulan la reacción inflamatoria. La linfotoxina (TNF-β) es una citoquina que tiene un cierto grado de homología con TNFα, pero a diferencia de TNF-α, es sintetizada exclusivamente por linfocitos T. La linfotoxina se une al mismo receptor que TNF-α, regulando en consecuencia los mismos tipos de reacciones. Potente activador de los neutrófilos, y por lo tanto se encuentra implicada en la reacción inflamatoria, y contribuye además a la lisis mediada por LTc de las células blanco. Activa las células endoteliales aumentando la adhesión de leucocitos y la producción de citoquinas. La IL-10 es una citoquina que tiene más bien efectos inhibitorios sobre la respuesta inmune. Esta es producida por las células Th2 y varios otros tipos celulares. Las actividades más importantes de la IL-10 son la inhibición de las funciones accesorias del macrófago y la producción de citoquinas por éste. Estos efectos llevan a una inhibición de la reacción inflamatoria mediada por linfocitos T y a la estimulación de los linfocitos B. Un hecho sorprendente es que el virus Epstein-Barr posee en su genoma un gen homólogo a IL-10, lo cual podría significar que este virus adquirió este gen con el objeto de evadir la respuesta inmune.

21 La IL-5 es una citoquina producida por linfocitos Th2 y mastocitos activados. Su principal acción es la de estimular la proliferación y diferenciación de eosinófilos de tal manera que ellos sean capaces de eliminar células infectadas con un determinado parásito. La IL-5 actúa en sinergia con IL-2 e IL-4 para estimular el crecimiento y la diferenciación de los linfocitos B. Fig. 17. Los linfocitos T CD4+ y CD8+ activados secretan un grupo de citoquinas que sirven para activar células efectoras de la respuesta inmune no específica o natural. La IL-12 tiene gran importancia en la respuesta inmune por las numerosas actividades biológicas en las cuales participa. El efecto global de la IL-12 está en la respuesta inmune mediada por células, debido a los efectos que tiene sobre las células NK y los linfocitos T. Más potente estimulador de las células NK, induciendo además la producción de IFN- por estas células. Para ello actúa en sinergia con IL-2 produciendo las denominadas células LAK ( Lymphokine Activated Killer Cells ). La diferenciación de las células Th1 es dependiente de la presencia de IL-12, la cual inhibe la proliferación de células de tipo Th2. Estimula la diferenciación de linfocitos T CD8+ a células T citotóxicas.

22 3. Citoquinas y hematopoyesis Las células de la sangre que ayudan a mantener la funcionalidad del organismo, tienen una vida media limitada. Por lo tanto, estas células terminales deben ser reemplazadas. La producción de las células sanguíneas es un proceso dinámico finamente regulado a nivel celular e intracelular. La regulación involucra por una parte las células de la sangre y células accesorias, y por otra parte, las células que responden a la acción de las citoquinas. Entre las células accesorias, las cuales producen diferentes citoquinas, están linfocitos, monocitos, macrófagos, granulocitos, células NK, fibroblastos, células endoteliales, adipocitos, miocitos y células del estroma en general. Las células sobre las cuales van a actuar las citoquinas dependerán de la presencia en su superficie del receptor adecuado para la citoquina producida por la célula accesoria. Actualmente se conocen más de 40 citoquinas, que tienen efecto sobre la hematopoyesis. Estas citoquinas tienen efectos estimulantes o supresores. Muchas de las citoquinas tienen actividad pleiotrópica, más que efectos específicos. A su vez, las citoquinas pueden ejercer un efecto directo o indirecto en la hematopoyesis Factores estimuladores de colonias Las principales citoquinas que estimulan la hematopoyesis son los diferentes "factores estimuladores de colonia", denominados por CSF antecedido por la inicial del tipo de células progenitoras sobre la cual actúa. Entre estos tenemos GM-CSF, G-CSF, M-CSF. Otras citoquinas como IL-3, IL-7, IL-12 y "c-kit ligand" o (SCF) tienen una función esencial en la hematopoyesis (Fig.18). Las acciones de estas citoquinas son influenciadas por otras citoquinas, algunas de las cuales como TNF-α, LT, IFN-γ y TGF-β, inhiben el crecimiento de los progenitores hematopoyéticos.

23 Las citoquinas que tienen un efecto estimulador directo en la proliferación de las células progenitoras mieloides son IL-3, GM-CSF, G-CSF, M-CSF e IL-5. La eritropoyetina (Epo) actúa sobre los progenitores eritroides. La IL-3 y el GM-CSF son citoquinas que actúan sobre los progenitores más tempranos, mientras que el GCSF, M-CSF, Epo e IL-5 actúan sobre progenitores de linaje más restringido. Algunos de estos factores de crecimiento interactúan con componentes de la matriz Extracelular para contribuir a la función de los progenitores o células efectoras. El GM-CSF es producido por linfocitos T, macrófagos, fibroblastos y células endoteliales. Esta citoquina es un factor de sobrevida y crecimiento para progenitores hematopoyéticos, así como para precursores más maduros tales como eritrocitos, linfocitos T, megacariocitos, e igualmente para células endoteliales. El G-CSF es producido por macrófagos, fibroblastos, células endoteliales y células que conforman el estroma de la médula ósea. Este es un factor de crecimiento, diferenciación y activación de neutrónicos y sus precursores. El M-CSF es un factor de crecimiento, diferenciación y activación para macrófagos y sus células progenitoras. Este es producido por múltiples fuentes, incluyendo linfocitos monocitos, fibroblastos, células endoteliales, moblaste y osteoblastos. Fig. 18. Factores de Crecimientos Hematopoyéticos.

24 3.2. Otras citoquinas estimuladoras de la hematopoyesis Varias citoquinas que no tienen un efecto directo sobre las células troncales o progenitoras, pueden aumentar el efecto proliferativo de los factores estimuladores de colonias en combinación con ellos. Entre estas citoquinas tenemos: SCF, IL-1, IL-4, IL-6, IL-7, IL-9, IL-11, IL-12. Tabla Nº 4. Principales Factores de Crecimiento Hematopoyéticos. Citoquina Efecto biológico Célula productora IL-3 Hematopoyesis en situaciones de stress. LT activados IL-5 Diferenciación, proliferación y activación de eosinofilos. Linfocitos Th 2 activados IL-7 Maduración de LT y LB. Células estromales de M.O. IL-9 Proliferación de precursores eritroides y de células T. LT activados IL-11 Megacariocitopoyesis. Fibroblastos de M.O. GM-CSF Desarrollo y diferenciación de granulocitos y macrófagos. G-CSF Desarrollo y diferenciación de granulocitos. M-CSF Desarrollo y diferenciación de macrófagos. LT activados Fibroblastos, células endoteliales y monocitos. Monocitos y macrófagos

25 3.3. Citoquinas supresoras Las citoquinas involucradas como moléculas supresoras de la hematopoyesis son: lactoferrina, la subunidad H de ferritina, las prostaglandinas E1 y E2, TNF-α, TNF-β, IFNα, IFN-β, IFN-, TGF-β, inhibina y algunos miembros de la familia de las quimioquinas. Factor de Necrosis Tumoral (TNF). Es el principal mediador de la respuesta inflamatoria aguda frente a las bacterias gram negativas y a otros microorganismos infecciosos. En infecciones graves, el TNF se produce en grandes cantidades y causa alteraciones histológicas y clínicas sistémicas (Fig.19) Fig. 19. Principales efectos del TNF en la regulación de la respuesta inmune.

26 RECEPTORES DE LAS CITOQUINAS Y MECANISMOS DE TRANSDUCCIÓN DE SEÑALES Receptores de citoquinas Los receptores para las citoquinas son proteínas de transmembrana altamente específicos, siendo en su mayor parte, específicos para una especie. Es sorprendente el hecho de que jamás se haya podido demostrar que una citoquina determinada sea capaz de inhibir la unión de otra citoquina a su receptor. La especificidad de especie que se le atribuye a las citoquinas podría explicarse a nivel de unión a su receptor. La interacción entre la citoquina y su receptor es de gran afinidad. Las células pueden presentar en su superficie receptores para varias citoquinas siendo su número muy bajo, entre 100 a receptores por célula. Sin embargo se necesita que sólo una fracción de los receptores sea ocupada para ejercer una máxima actividad biológica. El receptor funcional está, generalmente, formado por la subunidad que une la citoquina y una o más subunidades diferentes más bien relacionadas con la transducción de la señal. Los receptores de las citoquinas han sido clasificados en familias de acuerdo a homologías estructurales, a la presencia de ciertos dominios conservados, o a homologías funcionales. A estas superfamilias pertenecen también proteínas que no son, necesariamente, receptores para citoquinas. De acuerdo a la clasificación basada en las semejanzas estructurales que existe entre los dominios de unión, se los divide en 5 familias (Fig.20):

27 1. Receptores de Citoquinas tipo I. 2. Receptores de Citoquinas tipo II. 3. Superfamilia de las inmunoglobulinas. 4. Receptores del TNF. 5. Receptores de 7 hélices alfa transmembrana. Fig. 20. Enfermedades Infecciosas y Microbiología Vol.25, Nº 2, Abril-Junio 1. Familia de receptores hematopoyéticos o de tipo I. Familia más numerosa Pertenecen a la familia de receptores alfa, beta y gamma. Se han reconocido en este grupo, las siguientes citocinas: IL 2, IL-3, IL-5, IL 6, IL 7, IL 9, IL 13, IL 15, GM-CSF (factor estimulante de colonias granulocitosmonocitos) y G-CSF (Factor estimulador de colonias de Granulocitos) (Fig.21). Fig.21. Kuby Inmunology.6ta Ed.2007

28 La señalización a través de este tipo de receptores no está bien definida aunque se han descrito la fosforilación en tirosinas y activación de varias proteínas celulares en respuesta a las citoquinas, como se detalla a continuación: 1). La citoquina provoca la dimerización de las dos subunidades del receptor (una cadena α necesaria para la unión de la citoquina y traducción de señales y una cadena β que se requiere para la señalización). 2). Una serie de proteín-quinasas de la familia de JAK (JANUS QUINASAS) se unen a las colas agrupadas de las subunidades de la cadena α se vincula con la familia de cinasas Janus (JAK), con lo que se esas quinasas se activan. 3). Las JAK se autofosforilan. 4). Las JAK fosforilan a su vez determinadas tirosinas de las colas del receptor, 5). Entonces proteínas de otra familia, llamada STAT (transductores de señal y activadores de transcripción) se unen a algunas de las tirosinas fosforiladas de las colas del receptor, quedando cerca de las JAK. 6). Las JAK fosforilan a las STAT unidas a las colas del receptor. 7). Al quedar fosforiladas, las STAT pierden su afinidad por las colas del receptor, y en cambio tienden a formar dímeros entre sí. (Las tirosinas fosforiladas que han quedado libres en las colas del receptor sirven para unir nuevos monómeros de STATs). Los STAT se translocan de los sitios de acoplamiento del receptor hacia el núcleo, donde inician la transcripción de genes específicos (Fig.22) Fig.22. Cascada de señalización, a través de receptores hamtopoyéticos.

29 La mayor parte de los receptores de clase I poseen dos proteínas de membrana: Cadena alfa, que es la subunidad específica de la citoquina, sin capacidad de enviar señales al citoplasma; Cadena beta, una subunidad transductora de señal, que a menudo no es específica de una sola citoquina, sino que es compartida por receptores de otras citoquinas, este hecho permite explicar dos cualidades a las que ya hemos aludido: la redundancia y el antagonismo (Fig.22, Fig.23). Fig. 22. La mayor parte de los receptores de clase I poseen dos proteínas de membrana: Cadena alfa, que es la subunidad específica de la citoquina, Cadena beta, una subunidad transductora de señal. Fig.23. IL-2, posee distintos grados de afinidad por su receptor, según este formado por una, dos o las tres cadenas, regulando de esta manera la intensidad del efecto. Receptores de las Citocinas Tipo I. Fig. 24. Ejemplos de receptores tipo I.Fuente: Nature Reviews/immunology.

30 2. Familia de los receptores del tipo interferón (IFN) o Tipo II Es una familia propia de los receptores de las entre los cuales se cuentan los de IFN α/β R, IFN- e IL-10 (Fig.25) La transducción de la señal por estos receptores involucra la fosforilación y activación de la familia de las kinasas JAK al igual que los de la familia de tipo I. Estos mecanismos han sido descritos con bastante precisión para los interferones, no así para IL10 (Fig.26). Fig. 25. Ligandos de receptores tipo II. Fuente: Kuby. Inmunology.6ta Ed Fig.26. Transducción de señales en receptores tipo IFN. Fuente: Nature reviews/immunology. 3. Superfamilia de las inmunoglobulinas. Poseen varios dominios extracelulares de tipo Inmunoglobulinas. Los receptores de las citoquinas pueden contener uno o más de estos dominios (Fig.27, Fig.28). Entre los receptores para las citoquinas que pertenecen a esta familia se encuentran IL-1R, IL-6R, FGFR ( Fibroblast Growth Factor Receptor ), PDGFR ( Platelet Derived Growth Factor Receptor ), M-CSFR ( Macrophage Colony Stimulating Factor Receptor ) y c-kit, también denominado SCFR ( Stem Cell Growth Factor Receptor ) (Fig.28).

31 Fig.27. Dominios presentes en receptores de la familia de inmunoglobulinas. Fuente: Nature reviews/inmunology. Pertenecen a una familia con actividad tirosina kinasa intrínseca. El mecanismo de transducción de señal para estos receptores involucra la oligomerización inducida por la unión de la citoquina. Esta oligomerización produce autofosforilación del receptor, lo que a su vez lleva a la unión de otras proteínas que contienen dominios SH-2 (dominios src homólogos que se unen a tirosina fosforilada) y que están involucradas en la cascada de señales.(fig.29, Fig.30)

32 Fig.29. Oligomerización inducida por la unión de la citocina. Fig. 30. Cascada de señales de transducción en receptores Con actividad tirosina kinasa intrínseca. 4. Receptores tipo TNF (Factor de Necrosis Tumoral). Sus miembros se caracterizan por un dominio extracelular rico en cisteínas. Ejemplos de ligandos: TNF- α, TNF- β, CD40 (Fig.31). Ejemplos de Receptores: NGFR ( Nerve Growth Factor Receptor ), TNFR-I (p55), TNFR-II (p75). Otras proteínas como Fas y CD40 (la proteína Fas juega un rol en la inducción de la apoptosis y CD40 está involucrado en la activación de los linfocitos B mediante contacto directo con el linfocito T) pertenecen a esta familia de receptores. Los mecanismos de transducción de señales de esta familia llevan a la activación de la expresión génica o a la apoptosis. Estos dos mecanismos son mediados por adaptadores moleculares (Fig. 32, Fig.33)

33 Fig.31. Dominios y Ligando de Receptores tipo TNF. Fuente Kuby Inmunology.6ta Ed Fig. 32. Cascada de señales de transducción. Fig. 33. Efecto final: activación celular o apoptosis. Fuente: Nature Reviews/Molecular Cell Biology. Tal como se ha mencionado, en numerosos casos los receptores de las citoquinas están formados por dos o tres subunidades, una de las cuales tiene por función unir la citoquina y las otras subunidades están encargadas de transmitir la señal hacia el interior de la célula.

34 El receptor funcional y de alta afinidad lo constituye el complejo formado por las diferentes subunidades. En algunos casos la subunidad transductora de la señal puede ser compartida por los receptores de varias citoquinas como es el caso de la cadena del receptor de IL-2 que se une al receptor de IL-4, IL-7, IL-9 e IL-15. (Fig.34) Si consideramos además que la subunidad que comparten estos diferentes receptores es la proteína transductora de la señal, esto permitiría explicar por qué diferentes citoquinas son capaces de ejercer una misma función, es decir la "redundancia" de las citoquinas.

35 Receptores Solubles. Por otra parte, últimamente se han descubierto formas solubles de muchos de los receptores de las citoquinas. Existen varias hipótesis respecto a la función de estos receptores solubles. Primero, los receptores solubles serían producidos por ruptura enzimática con lo cual impedirían que la citoquina pudiese efectuar su acción sobre la célula blanco. Es decir, actúan antagonizando a los receptores de membrana (Fig.35) También los receptores solubles podrían encontrarse en el espacio extracelular y como tal competirían por la citoquina disponible actuando entonces como factores de regulación negativo (Fig.36). Fig.26. Receptores Transmembrana y solubles compiten por la citocina. Sin embargo, los receptores solubles que se encontrarían en el espacio extracelular podrían tener como función estabilizar la citoquina en el lugar, y facilitar la señalización, en cuyo caso estarían más bien teniendo un efecto positivo sobre la acción de ésta. Una última hipótesis discutida en la literatura es que los receptores solubles se podrían ligar a proteínas de la superficie de una célula que normalmente no tiene receptor para la citoquina y de esta manera hacerla sensible a ésta. Fig. 37. Representación esquemática de las 3 hipótesis respecto a la función de receptores solubles.

36 QUIMIOQUINAS Las Citoquinas que reclutan células inflamatorias... Las quimioquinas corresponden a un grupo de pequeñas proteínas básicas (8-14 kda), secretadas y estructuralmente relacionadas que fueron inicialmente descritas como moléculas inducidas por la inflamación y capaces de atraer monocitos, neutrófilos y linfocitos T activados. Son citoquinas con actividad quimio táctica. Son proteínas básicas con sitios de unión a los glicosaminoglucanos y su extremo COO- une heparina. Posteriores investigaciones han mostrado que las quimioquinas cumplen un importante papel en la coordinación del tráfico linfocitario a través de todo el cuerpo durante la vigilancia inmune y en la dirección de complejos movimientos celulares durante el desarrollo y diferenciación de los linfocitos. Las quimioquinas también tienen efectos sobre células del sistema nervioso y el endotelio donde ejercen efectos angiogénicos. Dos propiedades generales caracterizan a estas moléculas: No son especie-específicas y Son promiscuas en el uso de sus receptores. No obstante, también existen quimioquinas muy específicas. Hasta ahora se han descrito más de 50 quimioquinas y en algunos casos la misma molécula ha sido reportada con nombres diferentes contribuyendo a crear una cierta confusión en este campo.

37 CLASIFICACIÓN Este conjunto de aproximadamente 40 proteínas forma una familia, porque todos sus miembros están asociados genéticamente. Según el número y la situación de la cisteína las quimioquinas se han clasificado en cuatro grupos (la C hace referencia al residuo de cisterna; por ejemplo las CXC tendrían un solo aminoácido X- entre dos residuos cisteína): C (LINFOTAXINA) CC (EOTAXINA, RANTES, ETC.) CXC (GRO-ALFA, GRO-BETA, GRO-GAMA, ETC.) CX3C (FRACTALQUINA) Otras clasificaciones, basándose en criterios estructurales y en la localización cromosómica, las ha dividido en dos subfamilias: 1. Las quimiocinas alfa (cromosoma 4): Las primeras actúan principalmente sobre los neutrófilos. Tabla Nº5. Principales Quimiocinas alfa - CXC y Funciones.

38 2. Las quimocinas beta (cromosoma 17): actúan sobre los monocitos. De las cuales se conocen MIP-1a, MIP-1b, MCP-1, TCA3, RANTES y varias más. Tabla Nº6. Principales Quimiocinas Beta y Funciones. Otras quimiocinas son: La proteína básica de las plaquetas (PBP), la proteína inducible por el IFN gama (g- IP10) La proteína-2 activadora de neutrófilos (NAP-2), el conjunto que forman GRO-a, GRO-b y GRO-g una proteína que deriva de células epiteliales y es activadora de neutrófilos, etc. Tabla Nº7. Quimiocinas C y CX3C.

39 RECEPTORES Cátedra de Inmunología. Carrera de Bioquímica y Farmacia. Según se han ido identificando, se los ha denominado con la letra R de receptor y un número (así CXCR-1, CXCR-2, etc.), si bien se referencian con nombres, muchas veces, diferentes según las clasificaciones que se utilicen. Algunos receptores fijan diferentes quimioquinas mientras que otros son más selectivos; el hecho de que una quimioquina pueda acoplarse a más de un receptor no significa que los receptores sean redundantes, la quimioquina puede serlo, puesto que los procesos biológicos iniciados después del acoplamiento pueden ser muy diferentes. Están ampliamente distribuidos en las células hematopoyéticas. También existen receptores de los que no conocen su ligando (receptores huérfanos), como los identificados recientemente en el gen TER1. Un rasgo característico de todos los receptores de las quimioquinas es tener una estructura como una serpentina que se ha llamado de siete dominios transmembrana. (Fig. 38 y Fig. 39). Las partes extracelulares están implicadas en la unión de las quimioquinas mientras que las partes intracelulares están implicadas en el envío de señales a la célula de las que pueden resultar alteraciones de las funciones celulares tales como activación, movimiento o migración, usualmente a lo largo de un gradiente de concentraciones de quimioquinas. Se sabe que algunos receptores de las quimioquinas juegan un papel en la patogénesis o susceptibilidad a las enfermedades infecciosas. El VIH-1 o el VIH-2 utilizan algunos receptores CCP o CXC como cofactores de entrada en la células, el DARC (antígeno de Duffy de los eritrocitos) es un cofactor para la entrada de Plasmodium vivax en los eritrocitos, la resistencia a P. vivax. en la malaria y el VIH, está asociada con una falta de expresión DARC como en el caso del CCR5 con deleción 32. Diferentes virus de la familia Herpes (virus de Epstein- Barr, Citomegalovirus, virus del

40 Herpes) contienen receptores funcionales homólogos de quimioquinas humanas que hacen pensar que algunos virus pueden usar estos receptores para subvertir los efectos de las quimioquinas del huésped. Los receptores de quimioquinas se denominan de la misma manera que los ligandos seguidos por la letra R y un número (CCR1-9, CXCR1-5, XCR1, etc). Según la nueva nomenclatura propuesta, las quimioquinas se designan con una letra L seguida por un número correspondiente al número del gen que codifica para esa quimioquina. Desde hace más de 10 años se ha hipotetizado sobre la presencia de un factor celular antiviral (Levy) que inhibiría la replicación del VIH dentro de las células infectadas y que sería producido por los linfocitos CD8 y que podría explicar la evolución lenta, o la falta de progresión, que algunos sujetos infectados presentan. Si bien dicho factor no se ha aislado de momento, ha sido probablemente la base teórica de las investigaciones que han conducido a la caracterización a finales de 1995 de diferentes quimioquinas (RANTES, MIP-I alfa (MIP-1a) y MIP-1 beta (MIP-1b) que producidas por los linfocitos CD8 son capaces de inhibir la replicación in vitro de algunas cepas del VIH-1. La identificación de personas que estando expuestas persistentemente al VIH no se infectaban condujo al estudio de las características genéticas que estas personas presentan. Existen proteínas de la superficie de la célula que ligan las quimioquinas, que pueden desempeñar un papel importante en la susceptibilidad al VIH y en la progresión de la enfermedad. Desde 1996 se investigan unas moléculas que existen en la superficie de los linfocitos CD4 y macrófagos -los dos tipos de células del sistema inmune que usa el VIH para replicarse- que han sido bautizadas como CXCR4 y CCR5 y que actúan junto al CD4 como correceptor indispensable para la infección del virus. El hallazgo de estos correceptores tenía encandilados a los especialistas que pensaban que, puesto se conocía también la existencia de unas moléculas llamada RANTES capaces de competir con los receptores mencionados y bloquearlos, el uso de esta proteína y otras

41 quimioquinas de sus características podría ser un mecanismo nuevo que impidiera que el virus cumpliera su siniestra misión. No obstante, el conseguir cerrar la puerta al virus no ha sido una empresa sencilla. La diana más importante del virus del SIDA es un grupo de linfocitos, o células T, que llevan unas moléculas en su superficie a las que se llama CD4. Pero el CD4 no es suficiente para que se produzca la infección, hace falta lo que se llama un cofactor, o correceptores, es decir, otra molécula más. La quimiocina se encuentra unida a proteoglicanos de la superficie endotelial los cuales impiden que las quimiocinas sean arrastradas por el flujo sanguíneo. El contacto de la quimiocina con su receptor específico presente en el leucocito induce la activación de ésta célula. Fig. 40. Expresión de Receptores de nativos y Activados. Quimiocinas en Linfocitos CD4+

42 BIBLIOGRÁFIA. Iván Palomo G., Arturo Ferreira V., Cecilia Sepúlveda C., Mario Rosemblatt S., Ulises Vergara C. Fundamentos de Inmunología Básica y Clínica. Editorial Universidad de Talca. Talca- Chile, julio de Edición soporte papel año Roitt Ivan. Inmunología. Fundamentos. Editorial Médica Panamericana.9º Ed Charles A., Janeway, Jr., Travers, P., Walport M., Capra J.D. Inmunobiología. El sistema inmunitario en condiciones de salud y enfermedad. Masson S.A KINDT THOMAS J. Inmunología de Kurby. McGraw-Hill Interamericana de España S.L. 6ta Edición Abbas AK, Lichtman A. H. Inmunología Celular y Molecular. Interamericana