MD. TATIANA PAOLA BORJA HERRERA MD. CECILIA DE LOS ÁNGELES CARRIÓN GUZMÁN UNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADOR FACULTAD DE CIENCIAS MÉDICAS

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1 PREVALENCIA DE EXPRESIVIDAD DE PROTEÍNAS DEL SISTEMA * MMR ASOCIADA A INESTABILIDAD MICROSATELITAL EN HIPERPLASIA ENDOMETRIAL Y SU RELACIÓN CON LAS CLASIFICACIONES OMS Y NEOPLASIA INTRAEPITELIAL ENDOMETRIAL, HOSPITAL METROPOLITANO QUITO, 2011 MD. TATIANA PAOLA BORJA HERRERA MD. CECILIA DE LOS ÁNGELES CARRIÓN GUZMÁN UNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADOR FACULTAD DE CIENCIAS MÉDICAS PROGRAMA DE POSTGRADO DE ANATOMÍA PATOLÓGICA QUITO, JULIO, 2014 * MMR: Sistema de reparación de malos emparejamientos

2 ii PREVALENCIA DE EXPRESIVIDAD DE PROTEÍNAS DEL SISTEMA MMR ASOCIADA A INESTABILIDAD MICROSATELITAL EN HIPERPLASIA ENDOMETRIAL Y SU RELACIÓN CON LAS CLASIFICACIONES OMS Y NEOPLASIA INTRAEPITELIAL ENDOMETRIAL, HOSPITAL METROPOLITANO QUITO, 2011 MD. TATIANA PAOLA BORJA HERRERA MD. CECILIA DE LOS ÁNGELES CARRIÓN GUZMÁN Trabajo de Tesis presentado como requisito parcial para optar el Título de Especialistas en Anatomía Patológica Tutor: Dr. Nelson Arturo Montalvo Flores Asesor Metodológico: Dr. Klever Vinicio Sáenz Flor UNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADOR FACULTAD DE CIENCIAS MÉDICAS PROGRAMA DE POSTGRADO DE ANATOMÍA PATOLÓGICA QUITO, JULIO, 2014

3 iii FORMULARIO DE AUTORIZACIÓN DE PUBLICACIÓN EN EL REPOSITORIO INSTITUCIONAL 1.- Identificación del Documento y Autor Nombre del autor(es): Md Tatiana Paola Borja Herrera. Md Cecilia de los Ángeles Carrión Guzmán Correo electrónico personal: tatianaborjaherrera@hotmail.com ceciliacarrionguzmanmd@gmail.com Título de la obra: Prevalencia de expresividad de proteínas del sistema MMR asociada a inestabilidad microsatelital en hiperplasia endometrial y su relación con las clasificaciones OMS y Neoplasia intraepitelial endometrial, Hospital Metropolitano Quito, 2011 Tema del trabajo de investigación: Hiperplasia Endometrial, Inestabilidad microsatelital, OMS, NIE, Relación. 2.- Autorización AUTORIZACIÓN DE LA AUTORÍA INTELECTUAL Yo Tatiana Paola Borja Herrera y Cecilia de los Ángeles Carrión Guzmán En calidad de autor del trabajo de investigación o tesis realizada sobre: Prevalencia de expresividad de proteínas del sistema MMR asociada a inestabilidad microsatelital en hiperplasia endometrial y su relación con las clasificaciones OMS y Neoplasia intraepitelial endometrial, Hospital Metropolitano Quito, 2011, por la presente autorizo a la UNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADOR, hacer uso de todos los contenidos que me pertenecen o parte de lo que contiene esta obra, con fines estrictamente académicos o de investigación. Los derechos que como autor me corresponden, con excepción de la presente autorización, seguirán vigentes a mi favor, de conformidad con lo establecido en los artículos 5,6,8,19 y demás pertinentes de la Ley de Propiedad Intelectual y su reglamento. Md Tatiana Paola Borja Herrera 3.- Formato digital (CD): Md. Cecilia de los Ángeles Carrión Guzmán Con la portada correspondiente, El trabajo de tesis deberá ser grabado en un solo archivo en formato de texto.doc (Microsoft Word).

4 iv APROBACIÓN DEL TUTOR En mi carácter de Tutor del Trabajo de Grado, presentado por las Doctoras Tatiana Paola Borja Herrera y Cecilia de los Ángeles Carrión Guzmán para optar el Título de Especialistas en Anatomía Patológica cuyo título es PREVALENCIA DE EXPRESIVIDAD DE PROTEÍNAS DEL SISTEMA MMR ASOCIADA A INESTABILIDAD MICROSATELITAL EN HIPERPLASIA ENDOMETRIAL Y SU RELACIÓN CON LAS CLASIFICACIONES OMS Y NEOPLASIA INTRAEPITELIAL ENDOMETRIAL, HOSPITAL METROPOLITANO QUITO, Considero que dicho Trabajo reúne los requisitos y méritos suficientes para ser sometido a la presentación pública y evaluación por parte del jurado examinador que se designe. En la ciudad de Quito a los 23 días del mes de julio de Dr. Nelson Montalvo Cd. N o

5 v DEDICATORIAS A mi querida familia y novio por su incansable ayuda y soporte A mis maestros por sus enseñanzas y ejemplo A todos aquellos que directa e indirectamente han contribuido con este trabajo y con nuestra formación. Md Tatiana Paola Borja Herrera A mis padres y hermanos, por su fortaleza y confianza. A mi esposo Juan Pablo, por su apoyo incondicional. A mi hijo Emilio, fuente de inspiración y amor infinito. Md. Cecilia de los Ángeles Carrión Guzmán

6 vi RECONOCIMIENTOS A Dios, base y luz. A la Universidad Central del Ecuador, que por medio del Instituto Superior de Posgrado de la Facultad de Ciencias Médicas, con la coordinación del Postgrado de Anatomía Patológica, brinda la oportunidad de ampliar y fortalecer la formación académica de los médicos del país. Al Hospital Metropolitano, y especialmente al Servicio de Anatomía Patológica, por brindarnos la apertura y aporte técnico, fundamental en el desarrollo del presente trabajo. Al Dr. Nelson Montalvo, por apoyo y colaboración generosa. Al Dr. Klever Sáenz, Asesor metodológico de tesis, catedráticos y amigos; por apoyarnos con sus conocimientos científicos desde la planificación hasta la culminación exitosa de este trabajo. Las Autoras

7 vii CONTENIDO CONTENIDO DE GRÁFICOS CONTENIDO DE TABLAS RESUMEN INTRODUCCIÓN CAPÍTULO I PROBLEMA DE INVESTIGACIÓN PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA Pregunta de Investigación Hipotesis Objetivos Objetivo General Objetivos Específicos Justificación II MARCO TEÓRICO HIPERPLASIA ENDOMETRIAL Definición Epidemiología Clasificación Clasificación OMS Hiperplasia Simple Hiperplasia Compleja Hiperplasia Simple y Compleja con Atipia Sistema NIE Hiperplasia Benigna Neoplasia Intraepitelial Endometrial Comparación de la clasificación OMS y Sistema NIE INESTABILIDAD MICROSATELITAL Sistema MMR Carcinogénesis de Hiperplasias Endometriales III ARCO METODOLÓGICO METODOLOGÍA Diseño de Investigación Matriz de Variables Operacionalización de Variables Universo, Población y Muestra Procedimiento Plan de Análisis y Estandarización Normas Éticas Limitaciones pp ix x xi

8 viii IV ORGANIZACIÓN ADMINISTRATIVA RECURSOS Recursos Humanos Recursos Materiales Recursos Económicos CRONOGRAMA DE ACTIVIDADES V ANÁLISIS E INTERPRETACIÓN DE RESULTADOS RESULTADOS VI DISCUSIÓN, CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES DISCUSIÓN CONCLUSIONES RECOMENDACIONES REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS ANEXOS A Técnica de microarray tisular B Protocolo para la técnica de Inmunohistoquímica usando los anticuerpos para MLH1, MSH2, MSH6, PMS2 C Esquema del patrón arquitectural glandular: Valoración de volumen porcentual estromal (VPE) D Hoja de recolección de datos E Fotografías CURRICULUM VITAE INVESTIGADOR 1 CURRICULUM VITAE INVESTIGADOR

9 ix CONTENIDO DE GRÁFICOS GRÁFICO 1 Distribución de edad (años) de pacientes de origen de muestras estudiadas pp 36

10 x CONTENIDO DE TABLAS TABLA 1 Evolución de las Clasificaciones de Hiperplasia Endometrial 2 Características histológicas en Hiperplasia Endometrial por condición de menopausia 3 Citología de lesión que difiere de endometrio conservado y dimensión lineal de la lesión por condición de menopausia 4 Porcentaje estromal promedio por condición de menopausia 5 Tipo de Hiperplasia Endometrial por Condición de menopausia. Clasificación WHO 6 Tipo de Hiperplasia Endometrial por Condición de menopausia. Clasficación EIN 7 Tipo de Hiperplasia Endometrial por Condición de menopausia. Clasificación WHO y EIN 8 Prevalencia de No Expresividad de Marcadores de Inmunohistoquímica Estudiados. Muestra General 9 Prevalencia de No Expresividad de Marcadores de Inmunohistoquímica Estudiados por escalas de Clasificación WHO y EIN. 10 Prevalencia de No Expresividad de Marcadores de Inmunohistoquímica Estudiados por Características Histológicas pp

11 xi UNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADOR FACULTAD DE CIENCIAS MÉDICAS PROGRAMA DE POSTGRADO DE ANATOMÍA PATOLÓGICA Prevalencia de expresividad de proteínas del sistema MMR asociada a inestabilidad microsatelital en hiperplasia endometrial y su relación con las clasificaciones OMS y Neoplasia intraepitelial endometrial, Hospital Metropolitano Quito, Autoras: Tatiana Borja Herrera, Cecilia Carrión Guzmán Tutor: Nelson Montalvo Fecha: Julio 2014 RESUMEN Contexto: La hiperplasia endometrial se presenta en mujeres de entre 50 a 60 años y es considerada una lesión premaligna. Para su clasificación la más utilizada es la de la OMS, pero se ha propuesto otro sistema denominado Neoplasia Intraepitelial Endometrial. La importancia en clasificar a las hiperplasias adecuadamente radica en que las atípicas pueden progresar a carcinoma. Los carcinomas endometriales tipo endometrioide son causados por: silenciamiento del PTEN, IM y mutaciones de genes p53 y Kras. La IM se debe a la inactivación por silenciamiento de MLH1 y MSH2. Objetivo: Establecer la prevalencia de expresividad de proteínas del sistema MMR asociadas con inestabilidad microsatelital en hiperplasias endometriales, simples, complejas, benignas y neoplasia intraepitelial endometrial. Diseño: Epidemiológico analítico transversal Lugar y Sujetos: Servicio de Patología del Hospital Metropolitano, Quito Se elaboraron 8 bloques de microarreglos tisulares con 151 muestras de legrado endometrial de pacientes diagnosticadas de hiperplasia. De cada bloque se generaron 5 laminillas para Hematoxilina/Eosina, MLH1, MSH2, MSH6 y PMS2. Mediciones principales: Se compararon las clasificaciones de la OMS y EIN, y la prevalencia de expresividad de proteínas del MMR. Las variables cuantitativas, cuantitativas y la prevalencia se expresaron en promedios y porcentajes, acompañado de su intervalo de confianza al 95%. Resultados: De las 151 muestras, el porcentaje de lesiones precursoras fue del 8.6% según la OMS y 27.8% según el sistema EIN. Se clasificaron como EIN al 35.7% de HSSA, 34.3% HCSA, 14.3% HSCA y 16.7% HCCA. Hubo ausencia de proteínas MMR en 31% de casos de hiperplasias atípicas (OMS) y en 16,6% de casos de EIN. Conclusión: Se identificaron más lesiones precursoras con la clasificación EIN que con la clasificación OMS. La ausencia de expresividad de MMR fue mayor entre hiperplasias atípicas que entre EIN Descriptores: Hiperplasia endometrial, OMS, EIN, Inestabilidad microsatelital.

12 xii Abstract Setting: endometrial hiperplasia in women aged 50 to 60 years is considered premalignat injuries. The most used classification is the WHO s, but another system so-called Endometrial Intraepitelial Neoplasia. The relevance of property classifying hyperplasia lays in the fact that atipic can progress to carcinoma. Endometroid endometrial carcinomas are caused by: PTEN silencing, IM and gene mutations p53 and Kras. IM is due to inactivation for silencing MLH1 and MSH2. Objective: Establish prevalence of expressivity of the MMR system in association to microsatellite instability in simple, complex, benign endometrial hyperplasia and endometrial intraepithelial neoplasia. Design: Transversal, analytical, epidemiologic. Pleace and Subjects: Pathologic service in the Hospital Metropolitano, Quito blocks with tisular micro-arrangements with 151 samples of endometrial curettage of patients diagnosed with hyperplasia. From each block, 5 plates were generated for hematoxylin/eosin, MLH1, MSH2; MSH6 and PMS2. Core Measurements: Who and EIN classifications were compared, as well as prevalence of expressivity in MMR proteins. Qualitative and quantities variables, as well as prevalence were expressed in averages and percentages, accompanied by confidence interval at 95%. Results: From 151 samples, the percentaje of precursor injuries was 8.6% pursuant to WHO and 27.8% in accordance to EIN system. They were classified as EIN to 35.7% HSSA, 34.3% of atypical hyperplasia (WHO) and 16.6% of cases in EIN. Conclusion: More precursor injuries were found with EIN classification than with WHO classification. The absence of expressivity in MMR system was higher among atypical hyperplasia than among EIN. Describers: endometrial hyperplasia, WHO, EIN, microsatellite instability.

13 INTRODUCCIÓN La hemorragia uterina disfuncional se define como cualquier sangrado que difiera del patrón menstrual normal en frecuencia, cantidad y duración. La mayoría de sangrados disfuncionales de mujeres con edades comprendidas entre 50 a 60 años se deben a hiperplasia endometrial (HE), la cual se caracteriza por proliferación glándulo-estromal, secundaria al estímulo estrogénico permanente. Esta entidad puede retornar a la normalidad en forma espontánea o con tratamiento, persistir como tal o evolucionar a carcinoma. Es considerada una lesión premaligna, la incidencia de hiperplasia simple (HS) sin atipia es de 142 por mujeres, compleja sin atipia es 213 por e hiperplasias atípicas (HA) 56 por mujeres. Se han propuesto muchos sistemas de clasificación de HE, y a lo largo del tiempo se ha utilizado diversidad de términos para ello, sin embargo en 1994 la Organización Mundial de la Salud introdujo una clasificación, utilizando dos criterios: complejidad glandular y atipia nuclear, creando 4 grupos: simple, compleja, simple con atipia y compleja con atipia. La interpretación de las características microscópicas es subjetiva, dando como resultado diferentes criterios diagnósticos, lo cual disminuye su reproducibilidad. Existe otro sistema de clasificación que ha adquirido importancia en los últimos años, propuesto por el Grupo Colaborador Internacional Endometrial, denominado Neoplasia Intraepitelial Endometrial (NIE), el cual está basado en características morfométricas, genéticas, biológicas y pronósticas. Se subdivide en: hiperplasia benigna (HB), NIE y cáncer. Los hallazgos esenciales en su definición son: Arquitecturales (porcentaje de volumen estromal y densidad glandular) y citológicos (desviación estándar del eje nuclear). Su valoración puede realizarse en forma objetiva, mediante un sistema computarizado llamado Referencia Estándar Morfométrica (D- 1

14 SCORE); o subjetiva, teniendo en cuenta parámetros establecidos (citológicos y arquitecturales). Se han relacionado alteraciones genéticas y epigénicas con la progresión de un endometrio normal, a hiperplásico y por último al desarrollo de un carcinoma. Los carcinomas endometriales (CE) tipo endometrioide suman el 70 a 80% de los casos, y son causados por: silenciamiento del PTEN, el cual es un gen supresor de tumores que actúa en el ciclo celular previniendo una proliferación y división celular aceleradas; inestabilidad microsatelital (IM) (20 a 45% de los casos) asociada con defectos en la reparación de malos emparejamientos y mutaciones del gen Kras y p53. La IM puede observarse en tumores esporádicos, a través de la inactivación por silenciamiento de MLH1 y MSH2, y en pacientes con Síndrome de Lynch. El CE es el segundo tipo de malignidad más frecuente en el espectro de carcinomas asociados a esta patología, comprendiendo el 2% de CE diagnosticados. 2

15 CAPÍTULO I PROBLEMA DE INVESTIGACIÓN PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA La hemorragia uterina disfuncional se define como cualquier sangrado que difiera del patrón menstrual normal en frecuencia, cantidad y duración. Se presenta en aproximadamente 30% de mujeres, ocasionan el 20% de las consultas y el 25% de todas las cirugías ginecológicas, 65% de las histerectomías y 100% de las ablaciones endometriales. Aproximadamente, en el 15% de legrados/biopsias endometriales de mujeres postmenopáusicas con hemorragia uterina anormal, se diagnostica hiperplasia. (Pérez, L., 2007; Kurmann, N., 1985). La HE es la proliferación de glándulas endometriales de tamaño y forma irregular, con mayor proporción de glándulas sobre estroma. La causa principal constituye la exposición prolongada e intensa a estrógenos. (García, E., 2010). Se ha propuesto una clasificación alternativa que es el sistema NIE, en respuesta a la pobre reproducibilidad de la clasificación OMS. El sistema NIE está basado en parámetros morfológicos, morfométricos, moleculares y pronósticos, que evalúan el volumen de porcentaje estromal, densidad glandular y variación del tamaño nuclear. Existen tres categorías dentro del sistema: HB, NIE y adenocarcinoma. NIE se define como una lesión proliferativa, monoclonal con alteraciones moleculares similares a las vistas 3

16 en CE (mutaciones de gen PTEN e IM). (Mutter, G; 2000). La OMS divide a las HE en simple y compleja con y sin atipia. El 79% de HA, 44% HC sin atipia y 5% HS sin atipia son reclasificadas como NIE. (Robboy, S., 2009; Mutter, G., 2002). Factores genéticos y epigénicos están relacionados con la progresión de un endometrio normal, a hiperplásico y por último al desarrollo de carcinoma. En el endometrio se describen dos tipos generales de carcinoma: Tipo I o endometrioide y tipo II o no endometrioide. Esta clasificación se basa en vías tumorogénicas distintas para cada uno. (Abal, M., 2006; Shermann, M., 2000). Los CE tipo endometrioide suman el 70 a 80% de los casos, y se asocian a: silenciamiento del gen PTEN, IM (20 a 45% de los casos) asociada con defectos en la reparación de malos emparejamientos y mutaciones del gen Kras. (Okuda, T., 2010). Tanto la mutación del gen PTEN como la IM constituyen vías de carcinogénesis más frecuentes para desarrollar CE tipo endometrioide. (Mutter, G., 2002) Dentro del ADN existen microsatélites formados por repeticiones mono y dinucleotídicas cortas de hasta 8 pares de bases, las mismas que se mantienen estables en longitud y composición debido a la existencia de un sistema de reparación de malos emparejamientos, que actúa durante la replicación de ADN. La variación en longitud y composición de los microsatélites se conoce como IM (Redrobán, L., 2010; Lynch, H., 2003) La IM puede observarse en tumores esporádicos, por inactivación o silenciamiento de MLH1 y MSH2, y así como en pacientes con SL. Se ha llegado a proponer que la IM ocurre en un estadío temprano de la carcinogénesis global en la que un gen mutador provocaría mutación subsiguiente de genes. (Okuda, T., 2010; Perucho, M., 1996) 4

17 El reconocimiento de lesiones potencialmente precursoras de neoplasia tienen como resultado, un tratamiento médico o histerectomía; mientras que lesiones no precursoras tienen un manejo espectante. La mayoría de estudios demuestran que las hiperplasias atípicas son las que tienen mayor riesgo de progresión maligna. Aunque en el contexto de IM, las HC con o sin atipia son igualmente importantes como precursoras de CE. (Silverberg, S., 1999; Nieminen, T., 2009) El SL es una enfermedad con herencia autosómica dominante. El CE es el segundo tipo de neoplasia más frecuente en el espectro de carcinomas asociados a esta patología, después del CCR. El SL se asocia al 2% de CE diagnosticados. (Yoshihito, I., 2002; Boland, R., 2008; Van, L., 2010). Se realizó un estudio en pacientes con SL que evaluó la expresión proteica del sistema MMR. En ellas se identificó pérdida de la expresión del complejo proteico en: 7% de los endometrios normales, 40% de las HS, 100% de las HC sin atipias, 92% de las HC con atipias y 100% de los CE. (Nieminen, T., 2009) El éxito depende de los esfuerzos para identificar pacientes que se encuentran en riesgo de desarrollar este tipo de carcinoma a través del descubrimiento y entendimiento de sus bases moleculares. La detección de IM en endometrios hiperplásicos simples, complejos con o sin atipia determina un potencial riesgo de desarrollo de carcinoma (Okuda, T., 2010; Nieminen, T., 2009) Pregunta de Investigación Por lo mencionado en los párrafos anteriores, se plantea el siguiente problema: 5

18 Cuál es la prevalencia de expresividad de proteínas del sistema MMR asociada a inestabilidad microsatelital en hiperplasia endometrial y su relación con las clasificaciones OMS y Neoplasia Intraepitelial Endometrial? Hipótesis La prevalencia de expresividad de proteínas del sistema MMR en hiperplasias endometriales es alta y se relaciona con las clasificaciones de severidad establecidas en las escalas OMS 2003 y NIE Objetivos Objetivo General Establecer la prevalencia de expresividad de proteínas del sistema MMR asociadas con inestabilidad microsatelital en hiperplasias endometriales, simples, complejas, benignas y neoplasia intraepitelial endometrial. Objetivos Específicos Determinar la relación entre la expresividad de las proteínas del sistema de reparación de malos emparejamientos y las clasificaciones OMS y Neoplasia Intraepitelial Endometrial Establecer la relación entre la expresividad histomorfológicas de la lesión. y las características 6

19 Justificación La hiperplasia endometrial es considerada una lesión premaligna. Entre las clasificaciones para determinar la presencia o no de atipia citológica la más usada es la de la OMS, sin embargo su reproducibilidad es baja, existiendo otra clasificación más objetiva como el sistema EIN. El CE es el segundo tipo de malignidad más frecuente en el espectro de carcinomas asociados a esta patología, comprendiendo el 2% de CE diagnosticados. Este trabajo busca brindar información suficiente para clasificar de manera correcta a las hiperplasias endometriales, para un adecuado manejo de las pacientes que presenten riesgo de desarrollar cáncer y sobre todo establecer si existe inestabilidad microsatelital para realizar una terapéutica eficaz. 7

20 CAPÍTULO II MARCO TEÓRICO HIPERPLASIA ENDOMETRIAL Definición La HE es una de las causas más frecuentes de sobrediagnóstico en patología quirúrgica, se caracteriza por un índice glándulo-estromal incrementado secundario al estímulo estrogénico permanente. Se ha visto que el endometrio hiperplásico puede regresar a la normalidad en forma espontánea o con tratamiento, persistir como tal o evolucionar a carcinoma. Los factores de riesgo implicados en su desarrollo son: terapia estrogénica, obesidad, diabetes, menarquia temprana y menopausia tardía. (Silverberg, S., 2000; McCluggage, W., 2005; Barrero, R., 2008) Epidemiología La HE es una lesión premaligna. Al tomar en cuenta la clasificación OMS 2003, la incidencia de HS sin atipia es de 142 por mujeres, compleja sin atipia es 213 por e HA 56 por mujeres. (Sivridis, E., 2008; Reed, S., 2009). Es importante mencionar que no hay datos epidemiológicos de HE en Ecuador. 8

21 En Colombia en pacientes con diagnóstico de HE el 68,5% corresponden a HS sin atipia y el 19.7% a HA, el promedio de edad de las pacientes con HE encontrado es 44.8 años. (García, E., 2010). En Estados Unidos se registran nuevos casos de CE, con una incidencia de 16 por en el año En la ciudad de Quito se registran 137 casos nuevos de CE, con una tasa de incidencia de 5 por Representando el 81% de las lesiones malignas del cuerpo del útero, cabe anotar que el cáncer de cuello de útero tiene una frecuencia aproximada 10 veces mayor que el de endometrio en esta ciudad. (Cueva, P., 2009; Ferlay, J.). La edad promedio de ocurrencia de hiperplasias sin atipia es de 50 a 54 años, mientras que aquellas con atipia se presentan entre los 60 y 64 años. (Reed, S., 2009). El riesgo de progresión de endometrio hiperplásico sin atipia a uno con ella, es de 10,5% (Sivridis, E., 2008). El riesgo de progresión a carcinoma es de 0 a 27% para las hiperplasias no atípicas y 20 a 10% para las atípicas. (James, V., 2010). El CE tiene una incidencia de casos nuevos diagnosticados anualmente. Aproximadamente 90% son esporádicos y 10% restante son hereditarios (Okuda, T., 2010). Clasificaciones Tabla 1. Evolución de las clasificaciones Campbell y Barter (1961) Hiperplasia Benigna Hiperplasia Atípica, tipo I Hiperplasia Atípica, tipo II Hiperplasia Atípica, tipo II Beutler, Dockerty, y Randall (1963) Proliferación quística 9

22 Hiperplasia glandular Hiperplasia glandular con proliferación epitelial atípica Gusberg y Kaplan (1963) Hiperplasia adenomatosa leve Hiperplasia adenomatosa moderada Hiperplasia adenomatosa marcada Gore y Hertig (1966) Hiperplasia quística Hiperplasia adenomatosa Anaplasia Carcinoma in situ Vellios (1972) Hiperplasia quística Hiperplasia adenomatosa Hiperplasia atípica Tavassoli y Kraus (1978) Hiperplasia quística Hiperplasia adenomatosa Hiperplasia atípica Hendrickson y Kempson (1980) Hiperplasia Sin Atipia Con atipia leve Con atipia moderada Con atipia severa Kurman y Norris (1986) (OMS) Hiperplasia Simple Compleja Hiperplasia atípica Simple Compleja Mutter 2003 (NIE) 10

23 Hiperplasia Benigna Neoplasia intraepitelial endometrial Carcinoma Endometrial (Basado y modificado de Rosai, J., 2011; Mutter, G., 2003 ) Clasificación OMS La Organización Mundial de la Salud (OMS) y la Sociedad Internacional de Patólogos Ginecológicos divide a la HE en cuatro subtipos de acuerdo al grado de complejidad arquitectural y a la presencia o ausencia de atipia nuclear, aunque la aplicación de este sistema puede ser simple, algunas veces es difícil ponerlo en práctica. Al momento la OMS sostiene que no existe una clasificación que pueda remplazar a la actual. (Matías, A., 2009; Rosai, J., 2011). Hiperplasia Simple sin Atipia Se caracteriza por incremento del volumen endometrial y diferencias cualitativas con el endometrio cíclico normal, existe una proliferación tanto de las glándulas como del estroma. Está compuesta de estructuras tubulares y quísticas, dilatadas y revestidas por epitelio pseudoestratificado, similares a la fase proliferativa. Los núcleos son ovalados con cromatina dispersa y nucleolos inconspicuos, las mitosis son frecuentes en profase y metafase, lo cual explica la presencia de células claras en el epitelio glandular. El estroma es abundante y celular, y los vasos sanguíneos son dilatados y frecuentemente trombosados. (Nucci, M., 2009; Dallenbach, G., 2010). Hiperplasia Compleja sin Atipia Está caracterizada por glándulas empaquetadas con cambio del índice glándulo-estromal a favor del componente glandular. Las glándulas son irregulares y muestran pliegues papilares proyectados hacia la luz. La 11

24 estratificación y polaridad nuclear está conservada, las figuras mitóticas y cuerpos apoptóticos son frecuentes. (Nucci, M., 2009) Es común observar cambios metaplásicos escamosos, células claras y ciliadas. El estroma es celular y compacto y las arteriolas espirales no son prominentes. La proliferación glandular compleja puede ser focal dentro de una HS, caracterizada por empaquetamiento glandular moderado y alteración arquitectural. (Dallenbach, G., 2010) Hiperplasia Simple y Compleja con Atipia La HA muestra un crecimiento adenomatoso difuso y extenso con formación micro alveolar focal, incremento de la pseudoestratificación o estratificación nuclear con yemas intraluminales epiteliales. Hay una alteración en la relación núcleo-citoplasma y pérdida de la polaridad axial, los núcleos usualmente son grandes y redondeados, pleomórficos e hípercromáticos. Los nucleolos son prominentes de cromatina irregular y dispersa. Las mitosis y cuerpos apoptóticos son frecuentes. (Mehmet, C., 2010) Sistema de Neoplasia Intraepitelial Endometrial (NIE) La clasificación NIE está basada en estudios morfométricos, genéticos, biológicos y pronósticos, fue propuesta por el Grupo Colaborador Endometrial Internacional, en el año 2003 liderado por Mutter. Las clasificaciones morfológicas dentro de este sistema son una expresión evolutiva de la exposición a estrógenos sin oposición de progesterona (Mutter, G., 2007). Existen tres categorías en la clasificación NIE: 1. Hiperplasia benigna (HB) 2. Neoplasia Intraepitelial 3. Cáncer. 12

25 Los hallazgos esenciales en su definición son: Arquitecturales (porcentaje de volumen estromal y densidad glandular) y citológicos (polaridad nuclear). (Baak, J., 2004). Hiperplasia Benigna Es una lesión policlonal de topografía difusa que muestra incremento del índice glándulo-estromal (porcentaje estromal del 75%), resulta de una constelación de cambios histológicos secundarios a exposición estrogénica, por lo que su apariencia histológica es única en cada individuo. En cualquier momento se pueden producir o sobreponer cambios histológicos sugestivos de un efecto progestágeno. El cambio constante de las influencias hormonales produce alteraciones microscópicas variables y singulares para cada muestra. (Mutter, G., 2007). La exposición prolongada a estrógenos sin oposición, primero da lugar a un endometrio proliferativo desordenado, y con el tiempo a una disposición glandular irregular y progresiva, conocida como HB. (Baak, J., 2005). El material endometrial es abundante, las glándulas son quísticas, dispuestas al azar, asociadas generalmente con ciclos anovulatorios. A menor magnificación presenta un patrón de distribución glandular regularmente irregular y a mayor aumento se observa metaplasia tubárica. Ante la persistencia de exposición estrogénica los vasos sanguíneos presentan trombosis fibrinoide, con el consecuente desprendimiento endometrial (Zaino, D., 2002; Mehmet, C., 2010). Entonces tanto el endometrio proliferativo desordenado como las primeras fases de la HB comparten una patogenia común. Presentan un espectro de cambios morfológicos superpuestos en lugar de patrones 13

26 histológicos específicos que permitan su diferenciación. (Robboy, S., 2005). Neoplasia Intraepitelial Endometrial Es una lesión premaligna, neoplásica monoclonal, constituida por una proliferación glandular con arquitectura y citología alteradas. Es propensa a la transformación maligna hacia adenocarcinoma endometrial tipo endometrioide (Tipo I). Al momento del diagnóstico en la mayoría de los casos es focal, solo el 20% de las lesiones son difusas. (Mutter, G., 2007). Inicialmente las lesiones NIE exhiben mutación de los genes PTEN, p53, Kras y PAX2, que permiten proliferación monoclonal de glándulas densamente empaquetadas, que responden a estímulos hormonales y son susceptibles de reversión bajo dicha influencia (fase latente). A medida que el tiempo transcurre y el estímulo persiste acumulan alteraciones genéticas, provocando heterogeneidad molecular con transformación maligna. (Mutter, G., 2002). Los criterios diagnósticos son cinco y de cumplimiento obligatorio para el diagnóstico: 1. Dimensión lineal de por lo menos 1mm o 5 a 10 glándulas. 2. Incremento del número de glándulas con un porcentaje de volumen estromal menor al 55% o D-SCORE menor de Hallazgos citológicos que difieren de la arquitectura del endometrio conservado adyacente. 4. Exclusión de lesiones con arquitectura similar (endometrio basal, secretor, pólipos, reparación endometrial) 5. Excluir carcinoma (Kindelberger, S., 2002) 14

27 Arquitectura: El agrupamiento glandular es característica fundamental. El parámetro de evaluación es el volumen porcentual estromal (VPS), que se define como la cantidad de estroma expresada en porcentaje frente al componente glandular. El umbral cuantitativo de corte para las lesiones NIE corresponde a VPS menor al 50% con respecto a las glándulas. Las áreas con grandes quistes se deben evitar al evaluar. A pesar de que NIE es una enfermedad epitelial, la evaluación de la densidad glandular se realiza concentrándose en el compartimiento estromal. Las lesiones NIE tienen un VPS medio de alrededor de 40% y las no NIE un VPS de 75% (Hecht, J., 2005) (Ver Anexo C) Citología: No existe una norma absoluta para las características citológicas de las lesiones NIE. Los intentos de definir un estándar absoluto son afectados por la plasticidad morfológica extrema de las células glandulares del endometrio, en respuesta a los cambios hormonales, estados de reparación y metaplasia. (Palazzo, R., 2005). La citología de NIE suele ser claramente delimitada y divergente de la existente del endometrio benigno vecino. Las descripciones clásicas de atipia celular se cumplen en muchos casos de NIE pero no en todos, por lo tanto la atipia citológica no es un requisito previo para el diagnóstico de NIE. El tipo de cambio citológico en NIE varía considerablemente de paciente a paciente y puede incluir pero no limitarse a: variación de tamaño y contorno nuclear, agrupación y cromatina granular, presencia de nucleolos, cambios en el índice núcleo/citoplasma, y tinción citoplasmática. (Mutter, G., 2001; Palazzo, R., 2005) Algunos cambios citológicos en lesiones NIE, involucran la diferenciación hacia fenotipos tubáricos, micropapilares, mucinosos o eosinofílico. Este 15

28 hallazgo debe ser cuidadosamente diferenciado de las metaplasias superficiales aisladas que se producen por cambios en el patrón hormonal (Reed, S., 2008). Tamaño: La lesión debe tener un tamaño mayor a 1 mm de diámetro y abarca 5 a 10 glándulas. El requisito de tamaño se debe cumplir en un fragmento único de tejido, sin sumar diámetro entre varios fragmentos sospechosos (Mutter, G., 2005). Exclusión de entidades benignas (Robboy, S., 2002) Bajo este término se agrupan patologías que deben descartarse antes de diagnosticar NIE 1.- Cambios reactivos. 2.- Alteraciones glandulares artefactuales 3.- Efecto estrogénico persistente. 4.- Endometrio secretor medio o tardío. 5.- Pólipos endometriales. 6.- Cambios endometriales menstruales Exclusión de carcinoma (Mutter, G., 2007) Un carcinoma puede coexistir con NIE pero debe ser diagnosticado correctamente. NIE está compuesto de glándulas individuales revestidas por un epitelio simple, que puede ser pseudoestratificado y ausencia de arquitectura cribiforme o áreas sólidas de células epiteliales. La presencia de cualquiera de los siguientes hallazgos es compatible con carcinoma: 1. Luces serpenginosas, laberínticas. 16

29 2. Sábanas epiteliales. 3. Arquitectura cribiforme. 4. Patrón glandular en mosaico, con glándulas poligonales y estroma filiforme. 5. Mioinvasión: raramente observada en biopsias o curetajes. Comparación de la Clasificación OMS y Sistema NIE Existe una considerable variación inter e intraobservador en el diagnóstico de hiperplasia endometrial, debido a que los criterios diagnósticos de la clasificación OMS son muy subjetivos, mientras que la clasificación NIE utiliza parámetros morfométricos para identificar pacientes en riesgo real de progresión a cáncer. Aún cuando la concepción original de NIE fue morfométrica computarizada, es posible utilizar criterios semicuantitativos (Hecht, J., 2005). La mayoría de casos de NIE corresponde a hiperplasia compleja (HC) con atipia (79%), de HS no atípica el 2% y de HC sin atipia el 44% (Allison, K., 2008). El riesgo de CE en presencia de hiperplasia compleja atípica es del 26.4% y en NIE de 24.3% (Lacey, J., 2008). Varios autores mencionan que la clasificación OMS tiene pobre reproducibilidad diagnóstica, predicción pronóstica subóptima y tampoco relación biológica, ni terapéutica. En un estudio que evalúa 2601 especímenes endometriales asignados a dos equipos de patólogos expertos, hubo desacuerdo diagnóstico en 22.2% de casos, sobre todo en aquellos casos que incluían HC sin atipia y con ella. El mayor acuerdo diagnóstico se encontró en los casos de HS o ausencia de hiperplasia (Allison, K., 2009; Baak, J., 2005). 17

30 El Grupo Oncológico Ginecológico (GOG) revisaron casos con diagnósticos establecidos de hiperplasia compleja atípica (HCA) que en el 30% de casos fueron reclasificados como carcinoma, mientras otro 40% tuvieron un menor grado de hiperplasia o fueron muestras completamente benignas (Baak, J., 2005). La sensibilidad de NIE para detectar lesiones precursoras es del 92% comparada con el 67% para las HA de la clasificación OMS, y con el 46% de HCA. La clasificación NIE provee beneficios para el paciente relacionados con el manejo de la enfermedad (Baak, J., 2005). INESTABILIDAD MICROSATELITAL La inestabilidad genética es una propiedad común de muchos cánceres humanos; una de sus formas se caracteriza por acumulación de mutaciones somáticas en las secuencias repetitivas simples o microsatélites; la aglomeración de mutaciones clonales es secundaria a la presencia de un gen mutador en la replicación del ADN, o en factores de reparación que provocan una disminución de la fidelidad de replicación, errores que no son corregidos, y que finalmente llevan a IM. (Perucho, M, 2003). La IM se debe a defectos en los genes del sistema de reparación de malos emparejamientos (MMR), la misma que puede ser identificada en el 25 a 40% de CE tipo endometrioide y en el 2% asociados al síndrome de Lynch (Van, L., 2010; Okuda, T., 2010; Rigau, V., 2003). Existe inestabilidad asociada a mecanismos epigénicos, no hereditarios, que se deben a la metilación del promotor del gen que codifica para la proteína MLH1, teóricamente esta puede ocurrir en cualquier otra de las proteínas del sistema (Hsieh, P., 2009). 18

31 Sistema de Reparación de Malos Emparejamientos (MMR) La replicación es un proceso extraordinariamente fiel, pueden ocurrir mutaciones con una frecuencia de 1 en 10 9 a 1 en pares de bases por división celular. La ADN polimerasa (ADN pol) es responsable del proceso de lectura y corrección inicial de estas mutaciones. La vía MMR repara los malos emparejamientos no identificados por la ADN pol, mejorando la fidelidad de la replicación en 50 a 1000 veces (Kazuhiko, A., 2008; Boland, R., 2008). El MMR permite corregir los errores de replicación del ADN. Su ausencia incrementa el índice de mutaciones espontáneas y está asociada con una considerable proporción de carcinomas esporádicos (Hsieh, P., 2008). El sistema MMR está conformado por una familia de proteínas (heterodímero) llamadas MutS homólogo (MSH2, MSH6, MSH3) y MutL homólogo (MLH1, PMS2, MLH3). Cada una de las familias participa en la configuración del heterodímero con dos proteínas integrantes, siendo obligatoria la presencia de MSH2 y MLH1. Las combinaciones MSH2 con MSH6 son específicas para detectar malos emparejamientos, mientras que MSH2 y MSH3 reconocen las inserciones y deleciones (Lynch, H., 2009). La secuencia de eventos para el funcionamiento del sistema MMR se inicia con el reconocimiento del mal emparejamiento por MutS alfa (MSH2-MSH6) o MutS beta (MSH2-MSH3). Esto permite la unión a MutL alfa (MLH1-PMS2) con actividad de endonucleasa, que separa la zona marcada por la primera fracción del heterodímero. Posterior a esto, la ADN pol III replica la porción de cadena faltante (Chen, S., 2010). La ausencia de MLH1 o MSH2 provoca inactividad completa del sistema MMR, mientras que la ausencia de las proteínas acompañantes produce una atenuación de la actividad (Boland, R., 2008). 19

32 La IM se ha estudiado como modelo en el síndrome de Lynch (SL). Este es un transtorno autosómico dominante que predispone a carcinomas colorrectales (CCR), endometriales, ováricos, gástricos, pancreáticos, de intestino delgado y cerebro, así como tumores benignos (queratoacantoma, entre otros) (Garg, K., 2009). Tradicionalmente ha sido asociado a CCR, sin embargo en las mujeres su incidencia se iguala o es superada por el CE. En más del 50% de casos, el CE es la malignidad centinela (primera malignidad) de estas pacientes. La frecuencia de mutaciones en el sistema MMR en población no seleccionada con CE es de 1.8 a 2.1%. En pacientes menores de 50 años, la incidencia de este trastorno asociado al CE es superior a 9% (Shannon, A., 2002). El patólogo debe sospechar el diagnóstico de SL y hacer un screening de IM frente a CCR o CE antes de los 50 años, de un segundo CCR antes de los 70 años o CCR en menores de 70 años con otros tumores metacrónicos y sincrónicos asociados al SL (Van, L., 2009). La mutación de las proteínas obligatorias del sistema MMR (MLH1 y/o MSH2) da lugar al SL clásico; la mutación de las proteínas alternas se acompaña de predisposición a carcinomas en edades más tardías que el síndrome clásico. Se ha visto que las pacientes con mutaciones de MSH6 frecuentemente presentan CE a edades mayores a 50 años y su prevalencia aproximada es 1.6% de todos los casos de síndrome de Lynch (Goodfelow, S., 2003). Técnicas de Investigación del Sistema de Corrección de Malos Emparejamientos Para la detección de IM puede aplicarse ensayos basados en PCR e inmunohistoquímica (IHQ) para la valoración de expresión proteica. (Chialina, S., 2006). 20

33 La IHQ se emplea para valorar la expresión proteica de los genes del sistema MMR. En una célula normal existirá positividad nuclear, mientras en aquellas con mutaciones del sistema, la expresión desaparece. Las proteínas a evaluarse son MLH1, MSH2, MLH6 y PMS2 (Van Lier M, 2009) El sistema basado en PCR compara perfiles alélicos de marcadores microsatelitales, generados por amplificación de ADN. Utiliza sondas marcadas con un material fluorescente, que incluyen 5 repeticiones mononucleotídicas, BAT25, BAT26, NR21, NR24 y MONO27; y dos pentanucleótidos: PENTA C y PENTA D. Los marcadores mononucleotídicos son utilizados para la determinación de IM, y los marcadores pentanucleótidos son utilizados para detectar errores y/o contaminación. Los productos de la prueba de PCR son sometidos a electroforesis. (Chialina, S., 2006). Carcinogénesis en Hiperplasias Endometriales La mayoría de hiperplasias simples y algunas complejas son policlonales y consideradas procesos reactivos debido a hiperestrogenismo y pueden ser revertidas con progesterona. En contraste la mayoría de hiperplasias atípicas y un grupo de complejas sin atipia son monoclonales. (Lax, S., 2004; Doll, A., 2008). En las hiperplasias atípicas están presentes alteraciones del gen PTEN, Beta catenina, K ras, p53, PAX2 e IM. La mutación de PTEN, junto con IM constituyen las vías genéticas más frecuentes de CE endometrioide. En hiperplasias simples y endometrio normal también se ha visto inactivación del PTEN, de significado desconocido (Norasate,S., 2010; Westin, G., 2009). En HA y estadíos tempranos de carcinoma pueden observarse pérdida de PTEN en 35 a 50%, mientras que IM en 20 a 40%. En ocasiones pueden coexistir (63%). (Okuda, T., 2010). 21

34 Se realizó un estudio en pacientes con SL, en los que se identificó pérdida de la expresión del complejo proteico MMR en: 7% de los endometrios normales, 40% de las hiperplasias simples, 100% de las hiperplasias complejas sin atipia, 92% de las hiperplasias complejas con atipia, y 100% de los CE (Westin, G., 2009). 22

35 CAPÍTULO III MARCO METODOLÓGICO METODOLOGÍA Diseño de Investigación Se realizó un diseño epidemiológico analítico transversal, con la finalidad de establecer la prevalencia de expresividad de proteínas del sistema MMR asociadas con inestabilidad microsatelital en hiperplasias endometriales, simples, complejas, benignas y neoplasia intraepitelial endometrial Matriz de Variables EDAD V. MODERADORA CONDICION DE MENOPAUSIA INESTABILIDAD MICROSATELITAL V. INDEPENDIENTE CAUSAL GRADO DE HIPERPLASIA V. DEPENDIENTE CARACTERISTICAS HISTOMORFOLOGICAS V. INTERVINIENTE 23

36 Operacionalización de Variables VARIABLE DEFINICION DIMENSIÓN INDICADOR ESCALA EDAD Tiempo transcurrido entre el nacimiento y la fecha actual Tiempo Años Numérica Condición de Tiempo transcurrido Tiempo Igual o mayor Presente Menopausia entre la fecha de la última menstruación y el transcurrido entre la FUM y el de un año Ausente momento actual igual o mayo a un año momento actual Menor de un año Presente Ausente Grado de Incremento de glándulas Relación glandulo- OMS Hiperplasia endometrial endometriales por superficie estromal en base a clasificación OMS estromal Hiperplasia simple Presente Ausente y EIN Hiperplasia compleja Presente Ausente Hiperplasia simple con Presente atipia Ausente Hiperplasia Presente compleja con atipia Ausente 24

37 EIN Presente Hiperplasia Ausente benigna Presente EIN Ausente Inestabilidad Inexpresión de proteínas Grado de Inmunohistoq microsatelital del sistema de expresión de uímica: en Hiperplasia endometrial reparación de malos emparejamientos: MLH1, marcadores MLH 1 Presente MSH2,MLH6, PMS2 Ausente MSH 2 Presente Ausente PMS2 Presente Ausente MSH6 Presente Ausente Características Conjunto de cambios Cambios Proliferación Presente Histomorfológi celulares y glanduloestromale concordadnte ausente cas arquitecturales del s entre endometrio glandulas y Según OMS y EIN estroma Presente 25

38 Glándulas quísticas Ausente Indice glandulo estromal Numérica Presente Ausente Estratificación nuclear Presente Ausente Complejidad glandular Presente Yemas intraluminales Ausente Presente Ausente Vasos sanguíneos dilatados Presente Ausente Vasos 26

39 sanguíneos trombosados Presente Ausente Atipia Numérica Dimensión lineal de la lesión (mm) Numérica % de estroma Presente Ausente Citología de la lesión que difiere del endometrio conservado adyacente VARIABLE DEFINICION DIMENSIÓN INDICADOR ESCALA Grado de Incremento de glándulas Relación glandulo- OMS Presente Hiperplasia endometrial endometriales por superficie estromal en base a clasificación OMS y EIN estromal Hiperplasia simple Hiperplasia compleja Ausente Hiperplasia simple con 27

40 atipia Hiperplasia compleja con atipia EIN Hiperplasia benigna EIN Inestabilidad Inexpresión de proteínas Grado de Inmunohistoq Presente microsatelital en Hiperplasia endometrial del sistema de reparación de malos emparejamientos: MLH1, MSH2,MLH6, PMS2 expresión de marcadores uímica: MLH 1 MSH 2 Ausente PMS2 MSH6 Características Histomorfológi cas Conjunto de cambios celulares y arquitecturales del endometrio Según OMS y EIN Cambios glanduloestromale s Proliferación concordadnte entre glandulas y estroma Glándulas quísticas Presente Ausente Indice glandulo estromal 28

41 Forma del núcleo Estratificación nuclear Complejidad glandular Yemas intraluminales Vasos sanguíneos dilatados Vasos sanguíneos trombosados Atipia Dimensión lineal de la lesión % de estroma Citología de la lesión que difiere del endometrio conservado adyacente Universo, Población y Muestra El Universo del presente estudio fue constituido por la totalidad de especímenes obtenidos por legrado endometrial, de pacientes adultas, de género femenino, durante el período comprendido entre Enero de 2002 y Diciembre del 2011 con diagnóstico de hiperplasia endometrial clasificada por la OMS Al tratarse de un Universo Infinito y al ser el objeto de estudio cualitativo, la muestra fue calculada a partir de muestreo aleatorio simple para universo 29

42 infinito, objeto de estudio cualitativo, considerando una probabilidad de un 40% de desarrollo de inestabilidad microsatelital, empleando la siguiente fórmula: n pxqxz 2 e 2 Donde: p=probabilidad de ocurrencia (40%) 2 = 0.4 q = probabilidad de no ocurrencia = 0.6 z = nivel de significación (95%) = 1.96 e = error de inferencia (8%) = 0.08 Reemplazando: 0.4x0.6x1.96 n El tamaño muestral mínimo requerido fue de 143 muestras, sin embargo, para cubrir la probabilidad de pérdida ésta se incrementó en un 10%, resultando en una muestra de 157 especímenes. Procedimiento Se procedió a revisar los archivos de los reportes de diagnóstico histopatológico de los especímenes obtenidos por legrado endometrial, de pacientes adultas, de género femenino, durante el período comprendido 2003 a 2011 en el laboratorio de Patología del Hospital Metropolitano de Quito. 2 Okuda, T.,

43 Se seleccionó todos aquellos casos con diagnóstico de hiperplasia endometrial clasificada por la OMS 1994, luego se revisó cada una de las laminillas histológicas para confirmar que cumplan con los parámetros histológicos impuestos para el diagnóstico. Posteriormente a los casos revisados, se los reclasificó adicionalmente bajo los criterios de neoplasia intraepitelial endometrial, de tal manera que cada muestra tenga ambas clasificaciones. Se elaboró microarreglos de tejidos (ver Anexo E) mediante técnica manual y artesanal, utilizando como molde una platina rectangular de acero y plástico de 3 x 2,5cm, la cual contenía 24 varillas de cobre de 0,2cm de diámetro por 0,5cm de altura, y con una separación de 0,2cm entre varilla, y un margen periférico de 0.3cm. Posteriormente se bañó con aceite Johnson la superficie provista de varillas colocándose sobre un molde cubriéndola con parafina fundida a 60 C, sellándola con una caseta, luego, se llevó la muestra al congelador hasta que la parafina se solidificó. Una vez endurecida la parafina, se retiró la platina que contenía las varillas de cobre y quedó listo el molde de parafina para introducir los cilindros de tejido. Mientras tanto en los bloques de parafina de los casos seleccionados para el estudio se obtuvo los cilindros de tejido de 0,2cm de diámetro, utilizando una cánula para biopsia de médula ósea. Una vez conseguidos los cilindros tisulares, se procedió a colocarlos en los orificios del molde de parafina, tomando como referencia el eje de las x y y, de izquierda a derecha, dejando los orificios de las esquinas libres, donde se colocaron cilindros de tejido normal que sirvieron de control al momento de evaluar la técnica de inmunohistoquímica. Una vez elaborado el bloque del microarreglo sobre una laminilla portaobjetos se introdujo en una estufa a 40 C durante 15 minutos para que se homogenice la parafina del bloque con la de los cilindros tisulares, se repitió este paso una vez más por 10 minutos y posteriormente se colocó al bloque en el congelador hasta que la parafina 31

44 estuvo completamente solidificada. (Parsons, A., 2009, Hoos, E., 2001). (Ver anexo A) Se realizó 5 cortes de 4 um utilizando micrótomo de rotación marca SHANDON FINESSE 325, posteriormente se pescó sobre baño de flotación SHANDON, uno de ellos se tiñó con hematoxilina y eosina y los 4 restantes se los reservó para la técnica de inmunohistoquímica, para la cual se utilizaron los anticuerpos: MLH 1, MSH2, PMS2, MSH6. (Ver anexo B). De acuerdo a la literatura se tomaron como muestras informativas si más del 50% del disco de microarray tenía lesión. (Hardisson, D., 2003). Plan de Análisis y Estandarización La información requerida para el estudio fue recopilada en un formulario específico diseñado para el efecto (Ver Anexo D), a partir de la cual se creó una base de datos en Microsoft Excel 2010 para su posterior limpieza y análisis en SPSS v16-0. Las variables cuantitativas fueron expresadas en promedios y desviaciones estándar, y las cualitativas en frecuencias simples y porcentajes. La prevalencia de expresividad fue mostrada en porcentaje acompañado de su correspondiente intervalo de confianza al 95%. Para el análisis inferencial, se empleó en el caso de la variables cualitativas prueba T de diferencia de proporciones para grupos no independientes y para las cualitativas prueba T de diferencia de promedios, previo aplicación de prueba F, considerando un nivel de significación del 95% (alfa = 0.05). 32

45 Normas Éticas El estudio respetó las normas éticas de investigación en sujetos humanos establecidas en el protocolo de Helsinky II. Sin embargo al tratarse de un estudio que no implica riesgo alguno para pacientes puesto que se trabajó sobre muestras de archivo, únicamente se aseguró la confidencialidad de identidad tanto en el manejo de base de datos cuanto en la publicación de resultados. Limitaciones Las principales limitantes de este trabajo se relacionan con la calidad de la muestra, ya que debido a la presencia de algunos factores como sangre y procesamiento de los legrados endometriales, estos dificultan la elaboración de los microarreglos y pueden interferir con la tinción inmunohistoquímica de los biomarcadores. 33

46 CAPÍTULO IV ORGANIZACIÓN ADMINISTRATIVA RECURSOS Recursos Humanos El siguiente estudio se llevó a cabo por las autoras y contó con el soporte de los investigadores y del Laboratorio de Patología del Hospital Metropolitano. Recursos Materiales El presente estudio contó con el soporte del material del Laboratorio del Hospital Metropolitano de Quito, correspondiente a: MATERIAL NUMERO Procesador de tejidos marca SAKURA TISSUE-TEK VIP I 1 Micrótomos de rotación marca SHANDON FINESSE Baños de flotación marca SHANDON 2 Planchas calientes 2 Coloreador automático marca MICRON HMS Laminillas histológicas de hematoxilina y eosina 145 Bloques de parafina 145 Anticuerpos MLH1, MSH2, MSH6, PMS2 4 Solución de recuperación antigénica 1 34

47 Recursos Económicos Los costos de este estudio fueron cubiertos por sus autoras y se detallan en la siguiente tabla: RUBRO COSTO $ Laminillas histológicas por 100 Laminillas cubre objetos por 100 Set de Anticuerpos de evaluación de inestabilidad microsatelital (MLH1, MSH2, PMS2, MSH6) Bibliografía Papelería Imprevistos TOTAL 15 dólares 10 dólares 2148 dólares 50 dólares 50 dólares 100 dólares 2373 dólares Cronograma de Actividades Actividades Nov 2011 Dic 2011 Ene 2012 Feb 2012 Mar 2012 Abr-Dic 2012 Ene-Oct 2013 Nov Mar 2014 Abr-May 2014 Jun-Jul 2014 Realización de protocolo Aprobación de protocolo Inicio de recolección de datos Análisis de muestra Análisis de datos Redacción del informe final Informe final 35

48 CAPÍTULO V ANÁLISIS E INTERPRETACIÓN DE RESULTADOS RESULTADOS Se estudiaron un total de 151 muestras correspondientes a legrados endometriales con diagnóstico histopatológico de hiperplasia endometrial, correspondientes a mujeres con una edad promedio de 46.5 ± 7.8 años (Rango: años). La distribución por edad de la muestra estudiada se presenta en el gráfico I. En relación con la condición de menopausia, el 64.9% (n=98) de las muestras estudiadas procedieron de mujeres en esta condición. 36

49 Las características histológicas para la muestra general y desagregadas por condición de menopausia se muestran en la Tabla I. Condición Menopausia Presente (n=98) Ausente (n=53) Total (n=151) TABLA II. CARACTERÍSTICAS HISTOLÓGICAS EN HIPERPLASIA ENDOMETRIAL POR CONDICIÓN DE MENOPAUSIA Características Histológicas n(%) PCGE** GQ** ENUC* CGLAND** YEMIN** VDILAT** VTROMBO** ATIPIA* METAPL* SI NO SI NO SI NO SI NO SI NO SI NO SI NO SI NO SI NO (11.2) (88.8) (79.6) (20.4) (11.2) (88.8) (24.5) (75.5) (21.4) (78.6) (96.9) (3.1) (100) (4.1) (95.9) (84.7) (15.3) (15.1) 19 (12.6) (84.9) 132 (87.4) (67.9) 114 (75.5) (32.1) 37 (24.5) (24.5) 24 (15.9) (75.5) 127 (84.1) (37.7) 44 (29.1) (62.3) 107 (70.9) (28.3) 36 (23.8) (71.7) 115 (76.2) (96.2) 146 (96.7) (3.8) 5 (3.3) (100) 151 (100) (15.1) (7.9) (84.9) 139 (92.1) (83) 127 (84.1) (17) 24 (15.9) PCGE = Proliferación concordante entre glándulas y estroma / GQ = Glándulas quístuicas / ENUC: Estratificación Nuclear / CGLAND = Complejidad glandular / YEMIN =Yemas intraluminales / VDILAT = Vasos sanguíneos dilatados / VTROMB = Vasos sanguíneos trombosados / METAPL = Metaplasia ** p>0.05 NDES Chi cuadrado. / * ** p<0.05 DES Chi cuadrado 37

50 En cuanto a la citología de la lesión que difiere del endometrio conservado adyacente, ésta característica estuvo presente en el 31.1% (n=47) de los casos estudiados; en tanto que el 72.8% de las lesiones estudiadas fueron de patrón difuso. Tabla II. TABLA III. CITOLOGÍA DE LESIÓN QUE DIFIERE DE ENDOMETRIO CONSERVADO Y DIMENSIÓN LINEAL DE LA LESIÓN POR CONDICIÓN DE MENOPAUSIA Condición Menopausia CITOLOGÍA QUE DIFIERE n(%)** DIMENSIÓN LINEAL** n (%) SI NO > 1 mm < 1 mm Difuso Presente (n=98) 29 (29.6) 69 (70.4) 25 (25.5) 1 (1) 72 (73.5) Ausente (n=53) 18 (34) 35 (66) 15 (28.3) (71.7) Total (n=151) 47 (31.1) 104 (68.9) 40 (26.5) 1 (0.7) 110 (72.8) ** p>0.05 Chi cuadrado. En cuanto al porcentaje de estroma en las muestras estudiadas, éste fue en promedio de ± 5.3% (Rango: ). El comportamiento de la relación glándulo estromal en relación con la condición de menopausia, se muestra en la siguiente tabla. TABLA IV. PORCENTAJE ESTROMAL PROMEDIO POR CONDICIÓN DE MENOPAUSIA Condición Menopausia Porcentaje de estroma ** X ± S Presente (n=98) 22.1 ± 5.6 Ausente (n=53) 21.7 ± 4.6 Total (n=151) ± 5.3 ** p>0.05 NDES Student T te 38

51 El tipo de hiperplasia endometrial por escala usada (WHO EIN), desagregada por condición de menopausia, se muestra en las siguientes tablas. TABLA V. TIPO DE HIPERPLASIA ENDOMETRIAL POR CONDICIÓN DE MENOPAUSIA. CLASIFICACIÓN WHO Condición Menopausia TIPO DE HIPERPLASIA ENDOMETRIAL (WHO) n(%)* HSSA HCSA HSCA HCCA Presente (n=98) 74 (75.5) 21 (21.4) 1 (1.0) 2 (2.0) Ausente (n=53) 32 (60.4) 11 (20.8) 5 (9.4) 5 (9.4) Total (n=151) 106 (70.2) 32 (21.2) 6 (4.0) 7 (4.6) HSSA= Hiperplasia simple sin atipia / HCSA = Hiperplasia compleja sin atipia / HSCA = Hiperplasia simple con atipia / HCCA = Hiperplasia compleja con atipia * p<0.05 Chi cuadrado. TABLA VI. TIPO DE HIPERPLASIA ENDOMETRIAL POR CONDICIÓN DE MENOPAUSIA. CLASIFICACIÓN EIN Condición de TIPO DE HIPERPLASIA ENDOMETRIAL (EIN) n(%)* Menopausia Hioperplasia Benigna EIN Presente (n=98) 73 (74.5) 25 (25.5) Ausente (n=53) 36 (67.9) 17 (32.1) Total (n=151) 109 (72.2) 42 (27.8) EIN= Neoplasia intraepitelial endometrial * p<0.05 Chi cuadrado. La relación entre la clasificación de hiperplasia de EIN frente a OMS, se muestra en la siguiente tabla. TABLA VII. TIPO DE HIPERPLASIA ENDOMETRIAL POR CONDICIÓN DE MENOPAUSIA. CLASIFICACIÓN WHO Y EIN. TIPO DE HIPERPLASIA ENDOMETRIAL (EIN) TIPO DE HIPERPLASIA ENDOMETRIAL (WHO) n(%)* HSSA HCSA HSCA HCCA Hiperplasia Benigna (n=109) 91 (83.5) 18 (16.5) EIN (n=42) 15 (35.7) 14 (33.3) 6 (14.3) 7 (16.7) HSSA= Hiperplasia simple sin atipia / HCSA = Hiperplasia compleja sin atipia / HSCA = Hiperplasia simple con atipia / HCCA = Hiperplasia compleja con atipia / EIN= Neoplasia intraepitelial endometrial * p<0.05 Chi cuadrado. 39

52 Se estudiaron un total de 4 marcadores de inestabilidad microsatelital inmunohistoquímica, a saber: MLH1; PMS2, MSH2 y MSH6. por La prevalencia de no expresividad general en las muestras estudiadas para cada uno de éstos marcadores, se muestra en la siguiente tabla. TABLA VIII. PREVALENCIA DE NO EXPRESIVIDAD DE MARCADORES DE INMUNOHISTOQUÍMNICA ESTUDIADOS. MUESTRA GENERAL Marcadores IHQ Prevalencia % (IC 95%) MLH1 2(Nc) PMS2 4.6 ( ) MSH2 3.3 ( ) MSH6 5.3 ( ) La prevalencia de expresividad de cada uno de los marcadores, en relación con el tipo de hiperplasia endometrial para cada una de las clasificaciones aplicadas, se muestra en la siguiente tabla. TABLA IX. PREVALENCIA DE NO EXPRESIVIDAD DE MARCADORES DE INMUNOHISTOQUÍMNICA ESTUDIADOS POR ESCALAS DE CLASIFICACIÓN WHO Y EIN Marcadores ESCALA WHO Prevalencia % (IC 95%) MLH1 PMS2 MSH2 MSH6 HSSA (n=106) 1.9 (Nc) 3.8 ( ) 3.8 ( ) 5.7 ( ) HCSA (n=32) (Nc) 3.1 (Nc) 3.1 (Nc) HSCA (n=6) (Nc) HCCA (n=7) (Nc) (Nc) ESCALA EIN MLH1 PMS2 MSH2 MSH6 Hiperplasia Benigna (n=109) (Nc) EIN (n=42) 4.8 (Nc) ( ) 7.1 (Nc) (Nc) 7.1 (Nc) ( ) 9.5 ( ) 40

53 El análisis de la prevalencia de cada uno de los marcadores, en relación con las características histológicas se muestra en la siguiente tabla. TABLA X. PREVALENCIA DE NO EXPRESIVIDAD DE MARCADORES DE INMUNOHISTOQUÍMNICA ESTUDIADOS POR CARACTERÍSTICAS HISTOLÓGICAS Marcadores CARACTERÍSTICAS HISTOLÓGICAS Prevalencia % (IC95%) MLH1 PMS2 MSH2 MSH6 PCGE* Si (n=19) (Nc) --- No (n=132) 2.3 (Nc) 5.3 ( ) 3 ( ) 6.1 (2 10.2) GQ* Si (n=114) 1.8 (Nc) 4.4 ( ) 3.5 ( ) 6.1 ( ) No (n=37) 2.7 (Nc) 5.4 (Nc) 2.7 (Nc) 2.7 (Nc) ENUC* Si (n=24) 4.2 (Nc) 8.3 ( ) 4.2 ( ) 8.3 ( ) No (n=127) 1.6 (Nc) 3.9 ( ) 3.1 ( ) 4.7 ( ) CGLAND* Si (n=44) 2.3 (Nc) 6.8 (Nc) 2.3 (Nc) 2.3 (Nc) No (n=107) 1.9 (Nc) 3.7 ( ) 3.7 ( ) 6.5 ( ) YEMIN* Si (n=36) (Nc) (Nc) (Nc) No (n=115) 1.7 (Nc) 4.3 (0.6 8) 3.5 ( ) 7.0 ( ) VDILAT* Si (n=146) 2.1 (Nc) 4.8 ( ) 3.4 ( ) 5.5 ( ) No (n=5) VTROMBO* Si (n=151) 2 (Nc) 4.6 ( ) 3.3 ( ) ATIPIA* Si (n=12) 8.3 (Nc) 16.7 (Nc) No (n=139) 1.4 (Nc) 3.6 ( ) METAPL* Si (n=127) (Nc) ( ) 5.3 ( ) (Nc) 3.6 ( ) 4.3 ( ) 3.1 ( ) 5.5 ( ) No (n=24) 4.2 (Nc) 8.3 (Nc) 4.2 (Nc) 4.2 (Nc) PCGE = Proliferación concordante entre glándulas y estroma / GQ = Glándulas quístuicas / ENUC: Estratificación Nuclear / CGLAND = Complejidad glandular / YEMIN =Yemas intraluminales / VDILAT = Vasos sanguíneos dilatados / VTROMB = Vasos sanguíneos trombosados / METAPL = Metaplasia ** p>0.05 NDES Chi cuadrado. 41

54 CAPÍTULO VI DISCUSIÓN, CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES DISCUSIÓN La mayoría de sangrados disfuncionales en mujeres entre 50 y 60 años se deben a hiperplasia endometrial. (Pérez, L., 2007). Esto se refleja en la distribución etaria del presente estudio, donde el rango de edad más frecuente está comprendido entre 41 y 57 años. Su elevada incidencia se relaciona con el establecimiento de menopausia, por lo que 64.9% de pacientes incluidas en este estudio tenían esta condición. Estos datos epidemiológicos son reproducibles también en otras investigaciones como Garcia 2010 en donde el 61.32% de pacientes tenían entre 41 y 50 años. Para la clasificación de HE el sistema más utilizado es el de la OMS, sin embargo por su baja reproducibilidad se ha propuesto otro sistema denominado NIE. La importancia de clasificar a las hiperplasias adecuadamente radica en que las que presentan atipia citológica se han relacionado con alteraciones genéticas y epigénicas que pueden progresar a carcinoma (Kurmann, N., 1985). En este estudio se encontró que el 91.4% de casos eran hiperplasias sin atipia (70.2% tuvieron HSSA, 21.2% HCSA) y el restante 8,6% correspondía a lesiones atípicas. Al utilizar la clasificación NIE encontramos 27,8% de lesiones precursoras. Estos datos ponen en evidencia la diferencia entre las clasificaciones al momento de diagnosticar lesiones precursoras. Al comparar con otros estudios García 2010 encontró 19.6% de hiperplasias atípicas y Kurhman 42

55 (referente mundial) 28%, esta variabilidad podría explicarse por la baja reproducibilidad de la clasificación OMS sobre todo en lesiones atípicas. Lo antes mencionado se demuestra en el estudio europeo multicéntrico para análisis de reproducibilidad de la clasificación OMS. Los valores Kappa para acuerdos diagnósticos intra e interobservador entre patólogos expertos, mejoraban a medida que se disminuían las categorías diagnósticas (con 7 categorías valores kappa de 0.53 a 0.74, con 3 categorías valores Kappa de 0.70 a 0.83). En otros estudios similares como Zaino 2006 el panel de expertos coincidió en el diagnóstico de hiperplasia atípica solo en el 38% de casos referidos y en Allison 2009 el porcentaje de desacuerdo diagnóstico de atipia citológica fue del 47,3%. Estos datos contrastan con los de Usubutun 2012 que realizó un estudio de reproducibilidad de la clasificación EIN con 20 patólogos que obtuvieron entrenamiento vía online sin ser subespecialistas en patología ginecológica y dos patólogos expertos obteniendo un valor kappa de 0,72. La baja reproducibilidad de la clasificación OMS podría deberse a que sus criterios son subjetivos, existiendo variabilidad de diagnóstico entre patólogos expertos y más aún entre patólogos generales, mientras que los del EIN son más objetivos evidenciándose un mejor acuerdo entre patólogos. En este estudio se diagnosticó EIN en 27.8%, este valor se acerca al porcentaje de hiperplasias clasificadas como atípicas por Kurhman en Lo cual indica que los criterios usados por el sistema EIN son mucho más reproducibles para incluir a las lesiones atípicas que los usados por la OMS. En general en este estudio la ausencia de expresión de biomarcadores (MLH1, MSH2, MSH6 Y PMS2) para detectar IM fue de 15,2%, similar a William 2000 que encontró en lesiones precursoras 13 a 25%. Los carcinomas endometriales tipo endometrioide son causados por: silenciamiento del PTEN, IM, mutaciones del gen Kras y p53 (Okuda, T., 2010). La IM puede observarse en 43

56 tumores esporádicos, a través de la inactivación por silenciamiento de MLH1, MSH2, MSH6, PMS2.y en pacientes con Síndrome de Lynch (Mutter, G., 2012) En el presente estudio se encontró ausencia de expresión de proteínas de MMR en 31% de los casos diagnosticados como hiperplasias con atipia según la OMS y en 16.6% de casos diagnosticados como EIN. Datos comparables fueron encontrados por William 2000 con 13 a 25% de ausencia de expresión en lesiones precursoras y otras referencias que indican 20 a 40% (Okuda 2010). Este porcentaje es importante ya que se relaciona con la segunda vía carcinogénica en el endometrio, y la diferencia de expresividad entre clasificaciones puede deberse a que el número de casos diagnosticados como EIN fue mayor. En este estudio no se encontró diferencias estadísticas significativas entre características histomorfológicas condición de menopausia y ausencia de proteínas MMR, lo cual no llama la atención porque puede estar relacionado con el tamaño de la muestra o más probablemente por características genotípicas más que fenotípicas. 44

57 CONCLUSIONES La prevalencia de expresividad de proteínas del sistema MMR en hiperplasias endometriales fue del 84.8%, siendo la prevalencia de no expresividad de MLH1: 2%, PMS2: 4,6% ( ), MSH2: 3.3% (0,5-6,1), MSH6: 5,3% (2,2-8,4) La no expresividad de proteínas MMR fue del 31% en lesiones precursoras según la clasificación OMS y 16,6% en EIN No se encontró relación estadísticamente significativas entre la inexpresividad de proteínas MMR y características histopatológicas específicas. 45

58 RECOMENDACIONES En el presente estudio la clasificación EIN fue superior a la de la OMS, detectando mayor número de lesiones precursoras, por lo que se recomienda su difusión y utilización, particularmente entre patólogos y ginecólogos. En las hiperplasias endometriales atípicas existen otras vías de carcinogénesis igual de frecuentes e importantes que la IM, por lo que se recomienda complementar con estudios que incluyan otros biomarcadores como PTEN y B-catenina. 46

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69 ANEXOS A TÉCNICA DE MICROARRAY TISULAR: Es una técnica útil para estudios experimentales de investigación, puede traducirse como micromatrices de tejido. En la década de los años 80 con el desarrollo de la inmunohistoquímica y con la finalidad de abaratar costos, surge esta nueva técnica. (Redrovan, L., 2010). Hector Battifora en 1986 propone, bajo el nombre de sausage method, el estudio de múltiples tejidos normales o tumorales en un único bloque de parafina, este se denominó bloque tisular multitumor. En 1987, Wan y cols, del Centro de Investigación de Denver implementan una modificación a la técnica, montando cilindros extraídos de varios bloques de tejido e incorporándolos en uno solo. Esto permitía obtener placas con hasta 120 casos, y al mismo tiempo solucionaba el problema de la distribución aleatoria de ellos. En 1998, Kononen y cols. del Instituto Nacional de Bethesda, describen una técnica automatizada utilizando un sencillo instrumento, el tissue arrayer, a través del cual se podían insertar hasta mil cilindros de tejido en un mismo bloque. Se los utiliza para: estudio de progresión rumoral, cribaje de todo el espectro de una neoplasia, identificación de nuevas posibilidades terapéuticas, ensayos clínicos, establecimiento de perfiles moleculares de tumores, testar y optimizar sondas y anticuerpos, docencia y control de calidad, obtención de muestra para extraer ADN. Las ventajas de utilizar los microarreglos tisulares incluyen la reducción significativa del tiempo y costo, basado en la posibilidad de un análisis 57

70 simultáneo y estandarizado de múltiples muestras con un tamaño suficiente para analizar. Los inconvenientes ocurren al analizar tumores histológicamente heterogéneos o cuando existe un número mínimo de células tumorales; casos en los cuales su evaluación requerirá la visualización de todo el corte. En la construcción del microarreglo tisular tomando en cuenta tejido endometrial, se deben obtener cilindros de al menos 1mm de diámetro, con una distancia aproximada entre las muestras de 1mm. 58

71 ANEXO B PROTOCOLO PARA LA TÉCNICA DE INMUNOHISTOQUIMICA USANDO LOS ANTICUERPOS PARA MLH1, MSH2, MSH 6, PMS2. Preparación: Cortes de 3 a 4 um, secados a 60ºC toda la noche Pretratamiento: Desparafinizar, rehidratar y recuperar el epítope La recuperación se hace con citrato de sodio a Ph 6 Tinción: Aplicar el anticuerpo e incubar por 30 minutos en un cuarto a temperatura ambiente y enjuagar. Aplicar el vehículo, incubar a temperatura ambiente y enjuagar. Aplicar cromógeno e incubar por uno a diez minutos a temperatura ambiente, enjuagar 4 a 5 veces con agua destilada Realizar montaje y colocar cubreobjetos Interpretación: Pérdida de la inmunoreactividad nuclear en el epitelio glandular endometrial Control interno positivo en linfocitos y células estromales. 59

72 ANEXO C Esquema del Patrón Arquitectural Glandular : Valoración de Volumen Porcentual Estromal (VPE) El siguiente es una serie de gráficos esquemáticos que representan glándulas (círculos grises claros) con respecto al estroma gris oscuro. Nota: El VPE en NIE es menor al 55% 60