Estudio de la regulación transcripcional activada por el morfógeno Dpp durante la formación del ectodermo dorsal en Drosophila melanogaster

Transcripción

1 Estudio de la regulación transcripcional activada por el morfógeno Dpp durante la formación del ectodermo dorsal en Drosophila melanogaster Tesis entregada para optar por el grado de Doctor en Biotecnología Calixto Domínguez Portilla Directora de Tesis: Dra. Verónica Cambiazo Co-director de Tesis: Dr. Tomás Pérez-Acle Santiago Chile 2012

2 Resumen Durante la embriogénesis de Drosophila melanogaster el ectodermo dorsal se subdivide en dos tipos celulares, la amnioserosa y la epidermis dorsal. La diferenciación hacia estos dos tipos celulares es producto de la acción combinada de dos morfógenos de la familia de Factores de crecimiento TGF-β, Decapentaplegic y Screw (Dpp/Scw). El gen dpp se expresa en la región dorsal del embrión en los estados del blastodermo celular y gástrula, mientras que scw se expresa de forma ubicua, por un corto periodo de tiempo, durante la celularización del embrión. La acción de Dpp se manifiesta en forma de un gradiente extracelular, que alcanza niveles máximos de señalización en la región más dorsal del embrión, determinando directamente el destino de las células dorsales del embrión mediante la activación transcripcional de diferentes grupos de genes. Los TGF-β emiten su señal primaria a través de la familia de factores de transcripción Smads los cuales forman complejos con cofactores específicos activando o reprimiendo la expresión de genes blancos. Durante la subdivisión del ectodermo dorsal, la unión de Dpp y Scw a receptores serina/treonina kinasa Tipos I y II conduce a la fosforilación de Mad (Mothers-against-dpp) un factor de transcripción de la familia Smad. La forma fosforilada de Mad (pmad), forma un complejo con el co-activador conocido como Medea (Med), siendo ambos translocados al núcleo para activar la transcripción de un número indeterminado de genes blanco. Las evidencias acerca de la localización espacial de pmad revelan la formación de un gradiente de concentración del factor de transcripción con niveles máximos en las células localizadas en la región más dorsal del embrión disminuyendo de manera simétrica hacia las regiones laterales. El complejo pmad/medea se une a módulos de regulación en cis (MRC) que contiene sitios bipartitos de una secuencia caracterizada por el patrón rico en GC y un patrón de unión del dominio NH1 GNCN. Este patrón es similar a la secuencia de unión para la familia Smad (SBE, smad binding elements) en vertebrados. Los genes regulados por la vía Dpp/pMad se expresan en dominios celulares centrados en la línea media dorsal del embrión y claramente correlacionados con el gradiente nuclear de pmad a lo largo del ectodermo dorsal, sugiriendo que la actividad pmad determina al menos tres umbrales de expresión. Cada uno de estos umbrales está definido por la expresión de uno o más genes que han sido clasificados como genes de umbral tipo I, II o III. Niveles máximos de pmad activan los genes de umbral tipo I zerknüllt (zen), Ance y pebbled (peb), que se expresan en 4-5 células en la región más dorsal del embrión. Los genes de umbral tipo II, u-shaped (ush) y tailup (tup), son activados en un dominio más amplio de 12 hasta 14 células en la región dorsal. Por otro lado, pannier (pnr) es el único representante de genes de umbral tipo III y se expresa en un dominio de células.! xi!

3 Cúal es el mecanismo utilizado por estos genes para responder al gradiente de pmad?. El análisis de los MRCs de algunos de ellos ha permitido postular tres mecanismos alternativos. Primero, una composición de sitios de unión de Mad/Medea con afinidades relativas. Segundo, un balance entre señales de activación y represión transcripcional. Tercero, una interacción sinérgica de pmad/medea, por ejemplo con el factor de transcripción Zen. zen es un gen de la familia homeobox, cuya expresión es activada por Mad/Medea. Durante los estados tempranos de la embriogénesis la expresión del gen zen está restringida a las 3-5 células más dorsales donde el gradiente de pmad muestra los niveles más altos de actividad y la actividad de su producto es esencial para la diferenciación de la amnioserosa. Las descripciones de los mecanismos empleados para interpretar la señal del gradiente de Dpp durante la diferenciación del ectodermo dorsal han sido realizadas en un número limitado de genes diana, por ello no es posible obtener conclusiones más específicas de cómo estos operan. Más aún, las estructuras de las regiones reguladoras en cis de distintos genes, necesitan ser comparadas y analizadas en el contexto de una red de regulación génica controlada por el morfógeno Dpp. En este proyecto, se diseñaron experimentos utilizando microarreglos que contienen el transcriptoma completo de D. melanogaster para identificar nuevos genes diana de la vía Dpp/pMad. Hemos medido los cambios de expresión entre muestras de ARNs extraídas de embriones silvestres y embriones con carencia y exceso de la función de Dpp. Paralelamente, se generó un mapa con las zonas que contienen grupos de motivos de unión de Mad como probables MRCs involucrados en los estadios tempranos del desarrollo de D. melanogaster. Estos resultados se integraron con datos de conservación de secuencias, siguiendo la huella filogenética y bases de datos de expresión in situ y logramos identificar los MRCs de tres genes (CG13653, CG12420 y CG8147) cuya expresión varía bajo las perturbaciones de la señal de Dpp. Finalmente, examinamos la funcionalidad in vivo de los MRCs en ensayos en líneas transgénicas con genes reporteros (lacz). Finalmente, el análisis de nuestros resultados nos ha permitido generar un modelo que asimila e integra el conocimiento de los mecanismos por los cuales las células interpretan el gradiente de Dpp/Mad para ser traducidos en patrones estables del destino celular.! xii!

4 Abstract The Drosophila dorsal ectoderm is subdivided into two cell types, the amnioserosa and the dorsal epidermis. The differentiation into two cell types is the result of the combined action of two members of growth factors family (TGFβ), Screw and Decapentaplegic ligands (Scw/Dpp). The dpp gene is expressed in the dorsal region of the embryo during the cellular blastoderm and gastrula states, while scw is ubiquitously expressed for a short period of time, during the embryo cellularisation. Dpp acts as an extracellular gradient, reaching maximum levels of signaling in the most dorsal region of the embryo. The gradient determines directly the destination of the embryo dorsal cells by transcriptional activation of different sets of genes. TGF-β pathway emits the primary signal via the family of transcription factor Smads that form complexes with cell-specific cofactors activating or repressing the expression of target genes. During subdivision the dorsal ectoderm, binding of Scw/Dpp to receptors serine/threonine kinase Types I and II leads to Mad phosphorylation (Mothers-against-dpp) a transcription factor of the Smad family. The phosphorylated form of Mad (pmad), forms a complex with the co-activator known as Medea (Med), both are translocated to the nucleus to activate transcription of an unknown number of target genes. Evidence for the spatial localization of pmad reveals the formation of a concentration gradient with maximum levels in the most dorsal cells of the embryo decreasing symmetrically towards the lateral regions. The complex pmad/medea binds to cis-regulatory modules (CRM) containing bipartite sites characterized by a sequence rich in GC pattern and a pattern of GNCN NH1 binding domain. This pattern is similar to the binding sequence for Smad family (SBE, Smad binding elements) in vertebrates. Genes regulated via Dpp/pMAD are expressed in nested domains centered in the dorsal midline cells and clearly correlated with the pmad nuclear gradient along the dorsal ectoderm. The pmad activity determines at least three expression thresholds each of these thresholds is defined by the expression of one or more genes that have been classified as threshold genes of type I, II or III. Maximum levels of pmad activate the type I threshold genes zerknüllt (zen), Ance and pebbled (peb), which are expressed in 4-5 cells in the dorsal region of the embryo. The type II threshold genes, u- shaped (ush), tailup (tup), C15 are activated in a broader domain of cells in the dorsal region. Furthermore, pannier (pnr) is the only representative of type III threshold genes and is expressed in a domain of cells. This thesis address the question about the mechanisms used by these genes that permit then to respond the gradient of Dpp/Mad. Analysis of some CMRs has suggesting three mechanisms. First, a composition of binding sites affinities with Mad/Medea. Second, a balance among transcriptional activation and repression signals. Third, a synergistic interaction of pmad/medea with specific co-factors, for instance, with Zen. Zen is a transcription factor homeobox! xiii!

5 gene whose expression is activated by Mad/Medea. During the early stages of embryogenesis the expression of zen is restricted to the most dorsal 3-5 cells where the gradient of pmad shows the highest levels of activity and the activity of its product is essential for the amnioserosa differentiation. The proposed mechanisms used to interpret the signal of Dpp gradient during the dorsal ectoderm differentiation were analyzed on a limited number of target genes, impeding more specific conclusions as they operate. Moreover, the structures of CMRs of different genes need to be compared and analyzed in the context of a gene regulatory network controlled by the Dpp morphogen. In this project, I designed experiments using microarrays containing the complete transcriptome of D. melanogaster to identify novel target genes downstream of Dpp/Mad pathway. We measured the change of expression among samples of RNAs extracted from wild type embryos and embryos with loss-of-function and gain-of-function of Dpp. In parallel, we generated a map with groups of Mad binding motifs to predict probable CMRs involved in the early development of D. melanogaster. These results were integrated with data from sequence conservation, following the phylogenetic footprinting and in situ expression databases. I identified three novel genes (CG13653, CG12420 and CG8147) whose expression varies under perturbations Dpp signals and are expressed in the ED region. Finally, we examined the CRMs in vivo functionality assays in transgenic lines of flies with reporter genes (lacz). Finally, our results permit a model to be proposed that assimilates and integrates the knowledge of the mechanisms by which cells interpret the gradient of Dpp/Mad for translation into stable patterns of cell fate.! xiv!