CONTROLES DE CALIDAD. Taller 3

Transcripción

1 Taller 3 CONTROLES DE CALIDAD Coordina: Andres C. García Rosa Pinto (Banco Nacional de ADN, Salamanca) María Almeida Parra (Banco Nacional de ADN, Salamanca) María Pérez Caro (Banco Nacional de ADN, Salamanca) Raquel Paternain (Fundación para la Investigación Médica Aplicada, Navarra)

2 Taller 3: CONTROLES DE CALIDAD Cuantificación del ADN. Diferencias entre espectrofotometría UV y fluorimetría Dr. Andrés C. García Montero. Banco Nacional de ADN Carlos III- Universidad de Salamanca 12 de Noviembre de 2014

3 ABSORBANCIA UV VS FLUORESCENCIA

4 ESPECTROFOTOMETRÍA La Ley Lambert Beer describe cómo disminuye la cantidad de luz que atraviesa una solución (absorbancia) en función de: 1.- La concentración de la muestra (cantidad de material de absorción) 2.- La distancia de la trayectoria óptica 3.- El coeficiente de extinción (probabilidad de que el fotón a esa sea absorbido por el material) A = lc A = = l = c = Absorbancia Coeficiente de extinción Distancia en cm Concentración A 260 nm de, la media del Coeficiente de extinción ( ) : C = A / l dsdna ssdna ssrna Primers (μg/ml)-1 cm-1, (μg/ml)-1 cm-1, (μg/ml)-1 cm (μg/ml)-1 cm-1. Ac. nucleico Concentración (μg/ml) En cubeta 1 cm, 1 unidad OD ( optical density ) a 260nm dsdna 50 ssdna 37 ssrna 40

5 Espectrofotómetros de cubeta Espectrofotómetros en placa Espectrofotómetros de micromuestras

6 ABSORBANCIA A260 VENTAJAS.- barato.- rápido.- (poco volumen).- independiente de estándares de [DNA] conocidos.- detecta contaminación (proteínas, c.aromáticos, sales, ) Espectro típico de un ácido nucleótido Espectro típico de fenol

7 CONTROL DE CALIDAD DEL ADN PUREZA DEL ADN POSIBLES CONTAMINANTES: - ADN degradado, nucleótidos, cebadores, -proteínas - compuestos aromáticos (fenol, ) - alcoholes, - sales (Buffer TE),

8 ABSORBANCIA A260 LIMITACIONES.- detecta tanto DNA íntegro como nucleótidos libres.- límite inferior de detección >3-4 ng/ul.- cuantificación afectada por los contaminantes

9

10

11 CRITERIOS DE PUREZA DEL ADN DETECCIÓN DE CONTAMINANTES Relación de absorbancia 260/280 Se usa para establecer la pureza de una solución de ácidos nucleicos. El ratio 260/280 de cada nucleótido puro, si se mide independientemente, es:** Guanina: 1.15 Adenina: 4.50 Citosina: 1.51 Uracilo: 4.00 Timina: 1.47 (**Leninger, A. L. Biochemistry, 2nd ed., Worth Publishers, New York, 1975) Se acepta que un ratio de ~1.8 se correspondería a un ADN puro; mientras que para el ARN debería ser de ~2.0. Si el ratio es sensiblemente inferior indicaría la presencia de proteínas, fenoles u otros contaminantes que absorben próximos a 280 nm.

12 CRITERIOS DE PUREZA DEL ADN DETECCIÓN DE CONTAMINANTES RELACIÓN DE ABSORBANCIAS A260/A280 Contaminación c. aromáticos < 1,6 (proteínas, fenoles) 1,7 1,9 PUREZA ÓPTIMA > 2,1 Contaminación ARN Espectro típico de un ácido nucleótido Espectro típico de fenol

13 CRITERIO DE INTEGRIDAD DEL ADN ELECTROFORESIS EN GEL DE AGAROSA (0,7%): ADN íntegro ADN degradado

14 FLUORIMETRÍA Emisión de FLUORESCENCIA Picogreen

15 FLUORESCENCIA VENTAJAS.- únicamente ADN íntegro (doble cadena).- necesita cantidades mínimas de ADN (pg)

16 FLUORESCENCIA DESVENTAJAS.- técnica compleja (diluciones, volúmenes pequeños, ).- necesita datos previos de rango de concentración.- cuantificación relativa.- dependiente de estándares de [ADN] conocidos Picogreen Cuantificación relativa! Curvas de calibrado: patrones de concentración conocida!

17 EVALUACIÓN CUANTIFICACIÓN ADN Estudio multicéntrico: BBMRI 64 centros Absorbancia 260nm 37 centros Fluorescencia (Picogreen) 8 muestras (x3) concentraciones conocidas #1 270 ng/ul #2 220 ng/ul #3 140 ng/ul #4 180 ng/ul #5 60 ng/ul #6 40 ng/ul #7 10 ng/ul #8 100 ng/ul

18 Q2C_080 Q 2C_082 Q2C_083a Q2C_083b Q2C_084 Q2C_085a Q2C_086 Q2C_087a Q 2C_087b Q2C_088 Q2C_089 Q2C_091a Q 2C_092a Q2C_094 Q2C_078 Q2C_079a Q 2C_077b Q2C_075a Q 2C_077a Q2C_073b Q2C_074a Absorbance concentrations Absorbancia a 260nm Q2C_044 Q2C_045 Q2C_046 Q2C_050 Q2C_051 Q2C_052 Q2C_054 Q 2C_055a Q 2C_055b Q2C_057 Q2C_058a Q2C_058b Q2C_060 Q2C_061 Q2C_062a Q2C_062b Q 2C_064a Q 2C_064b Q2C_065 Q 2C_066 Q2C_068 Q 2C_069 Q2C_071A Q2C_072 Q2C_073a Q2C_043 Study Centre Fluorescence Concentrations Fluorescencia (Picogreen) A B C D E F G H Q2C_079b Q2C_081 Q2C_085b Q2C_087c Q2C_090a Q2C_090b Q2C_091b Q2C_075b Q2C_071B Q2C_074b Q2C_070 Q2C_067 Q2C_029a Q2C_029b Q2C_029c Q2C_029d ) Q2C_030 Q2C_031 Q2C_039 Q2C_042a Q2C_042b Q2C_047 Q2C_049 Q2C_059 Q2C_060 Q2C_062 Q2C_028 Q 2C_041 Q 2C_034 Q2C_038 Q2C_027b Q2C_027a Q 2C_033b Q2C_033c Q2C_023a Q2C_023c Q 2C_033a Q2C_017 Q2C_023b Q2C_020 Q2C_021 Q2C_016 Q2C_018 Q2C_014 Q2C_015 Q2C_011b Q2C_008 Q2C_011a Q2C_010 Q 2C_005 Q2C_002 Q2C_004 Q2C_004 Q2C_001a Valores esperados: Study Centre 1 A B C D E F G H Q2C_001b Concentrations ng/ul Concentration (ng/ul)

19 RECOMENDACIONES Utilizar de rutina espectrofotometría UV.- Lo que si es IMPORTANTE que tengáis en cuenta al medir el UV es: 1º.- Verificar la calibración del espectrofotómetro frecuentemente (p.ej. una vez al mes), para comprobar que mide bien..- En un espectrofotómetro UV de referencia (verificado/calibrado): medid varios ADNs de muy buena calidad (elevada pureza, buena concentración y ausencia de contaminantes proteínas, fenoles, sales -), conservadlos en condiciones óptimas (múltiples alícuotas congeladas), y utilizadlos como muestras de referencia (concentración conocida)..- Una vez al mes sacáis una alícuota de cada ADN y los medís en el Espect. UV que queréis verificar. Haced al menos 10 medidas de cada ADN. Si la precisión y exactitud no se van más allá de entre un 2%- 5%, entonces todo OK.

20

21 Exactitud: es la cualidad de un instrumento para proporcionar resultados (medidas) muy próximas al valor esperado. Precisión: es un término cualitativo que hace referencia a la habilidad de un instrumento para proporcionar resultados (medidas) muy similares entre ellos. También se suele referir como repetitividad o reproductibilidad del equipo. a) Exactitud y precisión buenas. b) Exactitud deficiente y buena precisión, c) Exactitud y precisión deficientes.

22 RECOMENDACIONES Utilizar de rutina espectrofotometría UV.- Lo que si es IMPORTANTE que tengáis en cuenta al medir el UV es: 1º.- Verificar la calibración del espectrofotómetro frecuentemente (p.ej. una vez al mes), para comprobar que mide bien. 2º.- En todas las muestras hacer un gel de agarosa para verificar la integridad del ADN (no está fragmentado). Es muy sencillo, rápido y barato..- Un gel agarosa al 0.8-1%es suficiente..- Migrar 20 minutos a 100V.- Revelar con EtBr (u otro menos tóxico de los que hay en el mercado). Resultado: Banda de gran tamaño y sin arrastre (o muy poco) es que el ADN está perfecto.

23 CONTROL DE CALIDAD DEL ADN INTEGRIDAD DEL ADN ELECTROFORESIS EN GEL DE AGAROSA (0,7%):

24 RECOMENDACIONES Utilizar de rutina espectrofotometría UV.- Lo que si es IMPORTANTE que tengáis en cuenta al medir el UV es: 1º.- Verificar la calibración del espectrofotómetro frecuentemente (p.ej. una vez al mes), para comprobar que mide bien. 2º.- En todas las muestras hacer un gel de agarosa para verificar la integridad del DNA (no está fragmentado). 3º.- Verificar periódicamente la eficiencia del protocolo de extracción de ADN, mediante la comparación de la cuantificación mediante PicoGreen vs Absorbancia 260nm. Con esto podremos conocer nuestra incertidumbre de medida y saber si ésta es aceptable o no

25 CONCENTRACIÓN (ng/ l): CONTROL DE CALIDAD DEL ADN CONCENTRACIÓN -Espectrofotometría: concentración y pureza Nanodrop ND1000 -Fluorimetría: concentración e integridad medida de absorbancia 260 nm todos los nucleótidos PicoGreen unión exclusiva al ADN de doble cadena RELACIÓN PicoGreen / Nanodrop ND1000 R < 1 muestra óptima de ADN: R > 0.8

26 GRACIAS!

27 Taller 3 CONTROLES DE CALIDAD Coordina: Andres C. García Rosa Pinto (Banco Nacional de ADN, Salamanca) María Almeida Parra (Banco Nacional de ADN, Salamanca) María Pérez Caro (Banco Nacional de ADN, Salamanca) Raquel Paternain (Fundación para la Investigación Médica Aplicada, Navarra)

28 Taller 3: CONTROLES DE CALIDAD Evaluación de los métodos de control de calidad de ácidos nucleicos mediante electroforesis capilar y electroferogramas. Dra. María Pérez Caro. Área de Control de Calidad Banco Nacional de ADN Carlos III Universidad de Salamanca 12 de Noviembre de 2014

29 Taller 3: CONTROLES DE CALIDAD Evaluación de los métodos de control de calidad de ácidos nucleicos mediante electroforesis capilar y electroferogramas. El término calidad engloba concentración, pureza e integridad. En el DNA y RNA el análisis de la calidad, tradicionalmente, comprende electroforesis y análisis del ratio 260/280 En el RNA concretamente, se determina la calidad del rrna (>80% ribosómico y 1 3% mrna) Cuando tratamos el control de calidad tenemos que distinguir entre: PUREZA: ausencia de contaminantes INTEGRIDAD: banda única de gran tamaño (DNA) /relación 28S:18S 2:1 (RNA) FUNCIONALIDAD: que la solución sea apta para realizar los ensayos que se propongan. CONCENTRACIÓN

30 Taller 3: CONTROLES DE CALIDAD Evaluación de los métodos de control de calidad de ácidos nucleicos mediante electroforesis capilar y electroferogramas. CONCENTRACIÓN Y PUREZA: RELACIÓN ABSORBANCIAS 1.8 D.O A260/ Pureza aceptable PUREZA ÓPTIMA < 1.8 Contaminación comp. aromáticos D.O A260/230 ~2,0 PUREZA ÓPTIMA < 1.5 (contaminación sales, comp. orgánicos) INTEGRIDAD DNA RNA

31 Taller 3: CONTROLES DE CALIDAD Evaluación de los métodos de control de calidad de ácidos nucleicos mediante electroforesis capilar y electroferogramas. FUNCIONALIDAD Long PCR Múltiple: DNA RT PCR oligos inter exónicos: RNA 5 parejas de oligonucleótidos (primers) simultáneamente amplificación en 6 cromosomas diferentes amplicones entre 17.5 kb y 2.0 kb M

32 Taller 3: CONTROLES DE CALIDAD Evaluación de los métodos de control de calidad de ácidos nucleicos mediante electroforesis capilar y electroferogramas. Técnicas de microfluídos Agilent 2100 bioanalyzer combina técnicas de electroforesis capilar y fluorescencia. Evalúa calidad e integridad. Requiere de muy poca cantidad de muestra. Da valores numéricos a las imágenes que se ven habitualmente RIN (RNA Integrity Number) RIN < 4 RNA baja calidad RIN > 7 RNA alta calidad (arrays) RIN 4 7 RNA calidad media (qrt PCR)

33 Taller 3: CONTROLES DE CALIDAD Evaluación de los métodos de control de calidad de ácidos nucleicos mediante electroforesis capilar y electroferogramas. Tapestation Agilent Uso de geles multi línea y microfluidos que permiten un ensayo semi automático. Simplifica el manejo de muestras y reduciendo los tiempos de ensayo.

34 Taller 3: CONTROLES DE CALIDAD Evaluación de los métodos de control de calidad de ácidos nucleicos mediante electroforesis capilar y electroferogramas. OBJETIVO: Comprobar fiabilidad y repetitividad: RIN y concentración TÉCNICAS DE MICROFLUÍDOS Control de calidad del RNA 5 muestras RNA (diluciones) extraídas por métodos diferentes analizadas por duplicado yendías distintos

35 Taller 3: CONTROLES DE CALIDAD Evaluación de los métodos de control de calidad de ácidos nucleicos mediante electroforesis capilar y electroferogramas.

36 Taller 3: CONTROLES DE CALIDAD Evaluación de los métodos de control de calidad de ácidos nucleicos mediante electroforesis capilar y electroferogramas. Well RIN e Conc. [ng/µl] Sample Description Replicas Datos Bioanalyzer A1 7,2 168 ladder [1]/[2] RIN [] B1 6, patol ng/ul C1 6, patol D1 6,3 61, patol 1/ ng/ul E1 6,4 55, patol 1/2 F1 6, patol 1/ ng/ul G1 6, patol 1/4 H1 1,8 75, patol ng/ul A2 2,1 79, patol B2 1,8 52, patol 1/ ng/ul C2 1,7 41, patol 1/2 D2 1,4 27, patol 1/ ng/ul E2 1,7 28, patol 1/4 F2 6, norm ng/ul G2 6,5 94, norm H2 6 56, norm 1/2 0.9 N/A 14ng/ul A3 6,3 61, norm 1/2 B3 6, norm 1/4 1 N/A 7ng/ul C3 6,5 26, norm 1/4 D3 7, neutro ng/ul E neutro F3 8, neutro 1/ ng/ul G3 8,1 97, neutro 1/2 H3 7,8 55, neutro 1/ ng/ul A4 7, neutro 1/4 B4 7, mono ng/ul C4 7, mono D4 8,2 61, mono 1/ ng/ul E4 8,2 58, mono 1/2 F4 7, mono 1/ ng/ul G4 8 33, mono 1/4

37 Taller 3: CONTROLES DE CALIDAD Evaluación de los métodos de control de calidad de ácidos nucleicos mediante electroforesis capilar y electroferogramas. El análisis de las medidas de concentración aportada por bioanalizador y tapestation de las mismas muestras, por duplicado yendías distintos, determinó la baja reproducibilidad entre ambas técnicas, resultando ser la medida más estable la aportada por el nanodrop. DIA 1 DIA 2 DIA 1 DIA 2 Tape 1 Tape 2 Tape 1 Tape 2 Agilent Agilent muestras concentración concentración concentración concentración concentración concentración patol patol 1/2 61,4 55,7 46, patol 1/ ,7 38, patol 75,8 79,2 50,5 78, patol 1/2 52,4 41,4 48,2 50, patol 1/4 27,5 28,5 16,8 31, norm ,7 55,2 42, norm 1/2 56,3 61,4 62,6 31, norml 1/ ,9 16,9 32, neutro neutro 1/ , , neutro 1/4 55, ,1 29, mono , mono 1/2 61,5 58,2 34,6 28, mono 1/ ,9 19,3 12,

38 Taller 3: CONTROLES DE CALIDAD Evaluación de los métodos de control de calidad de ácidos nucleicos mediante electroforesis capilar y electroferogramas. Well RIN e Conc. [ng/µl] Sample Description RIN e /RIN Observations A1 7,2 168 ladder RIN [] B1 6, patol 0, ng/ul C1 6, patol D1 6,3 61, patol 1/2 0, ng/ul E1 6,4 55, patol 1/2 F1 6, patol 1/4 0, ng/ul G1 6, patol 1/4 H1 1,8 75, patol ng/ul A2 2,1 79, patol B2 1,8 52, patol 1/ ng/ul C2 1,7 41, patol 1/2 D2 1,4 27, patol 1/ ng/ul E2 1,7 28, patol 1/4 F2 6, norm ng/ul G2 6,5 94, norm H2 6,0 56, norm 1/ N/A 14ng/ul A3 6,3 61, norm 1/2 B3 6, norm 1/ N/A 7ng/ul C3 6,5 26, norm 1/4 D3 7, neutro ng/ul E3 8, neutro F3 8, neutro 1/ ng/ul G3 8,1 97, neutro 1/2 H3 7,8 55, neutro 1/ ng/ul A4 7, neutro 1/4 B4 7, mono ng/ul C4 7, mono D4 8,2 61, mono 1/ ng/ul E4 8,2 58, mono 1/2 F4 7, mono 1/ ng/ul G4 8,0 33, mono 1/4

39 Taller 3: CONTROLES DE CALIDAD Evaluación de los métodos de control de calidad de ácidos nucleicos mediante electroforesis capilar y electroferogramas.

40 Taller 3: CONTROLES DE CALIDAD Evaluación de los métodos de control de calidad de ácidos nucleicos mediante electroforesis capilar y electroferogramas.

41 Taller 3: CONTROLES DE CALIDAD Evaluación de los métodos de control de calidad de ácidos nucleicos mediante electroforesis capilar y electroferogramas. CONCLUSIONES: Resultados obtenidos en el BNADN muestran cómo las mismas muestras de RNA analizadas en días diferentes, en ambas plataformas, NO reproducen la concentración entre réplicas (a pesar del que cumplen con las especificaciones del aparato) pero SÍ reproduce los valores de RIN/ RIN e en el RNA, siendo la diferencia entre ambos ~1

42 Taller 3: CONTROLES DE CALIDAD Evaluación de los métodos de control de calidad de ácidos nucleicos mediante electroforesis capilar y electroferogramas. TÉCNICAS DE MICROFLUÍDOS Control de calidad del DNA TAPESTATION AGILENT

43 Taller 3: CONTROLES DE CALIDAD Evaluación de los métodos de control de calidad de ácidos nucleicos mediante electroforesis capilar y electroferogramas. Sample Description Ratio Picogreen/ TapeStation Ratio Nanodrop/ TapeStation Ratio Picogreen/ Nanodrop 1 1,1 1,2 0,91 2 1,2 1,2 0,94 3 1,3 1,3 0,97 4 1,2 1,2 0,98 5 1,1 1,1 0,96 6 1,2 1,4 0,87 7 1,3 1, ,3 1,4 0,93 9 1,2 1,4 0, ,5 1,7 0,89

44 Taller 3: CONTROLES DE CALIDAD Evaluación de los métodos de control de calidad de ácidos nucleicos mediante electroforesis capilar y electroferogramas. CONCLUSIÓN: Cada sistema de análisis aporta resultados diferentes, NO COMPARABLES, de ahí la importancia de utilizar siempre la misma plataforma, conociendo sus ventajas e inconvenientes.

45 DIRECCIÓN: Prof. Dr. Alberto Orfao de Matos COORDINACIÓN TÉCNICA: Dr. Andrés García Montero Dra. María Almeida Parra GESTIÓN DE CALIDAD: Ana Regalado Mayordomo CONTROL DE CALIDAD: Dra. Rosa Pinto Labajo Dra. María Pérez Caro SECRETARÍA y ADMINISTRACIÓN: Elena Chamorro Castro PERSONAL DE LABORATORIO: Javier García Palomo Teresa Malvar Ferreras Mª Teresa Márquez de Sousa Sheila Mateos Domínguez Mª Isabel Morante Arroyo

46 GRACIAS!

47

48 Objetivo inicial./,*0 $1221/(**)!"#$% &'()*+(,* ' -

49 Metodología. 31(*+1*4 1 / 5&. 6! 1*!$ 7. "$"8/1***!." 7' $$ 9*:/5 ( *8

50 Resultados iniciales %1(*1* Pureza* Rendimiento** N A2 60/280 < 0,1 0,1-1 > 1 Es ófago-estómago 7 1,86± 0, G anglio 5 1,92± 0, Hígado 6 1,93± 0, Intestino 27 1,93± 0, Mama 24 1,58± 0, O vario 7 1,81± 0, P.blandas y hueso 11 1,83± 0, Pulm ón 8 1,79± 0, Riñón-vejiga 20 1,91± 0, Útero 5 1,79± 0, TOTAL 120 * Media +/- Desviación estándar ** Nº de muestras cuyo rendimiento de RN A es (ug/mg tejido) : <0,1, >0,1 y >1, y >1 $;$

51 Resultados en tejido mamario % () )< MUESTRA EXTRACCIÓN NANODROP EXPERION # BIOPSIA AÑO CAJA HUECO TEJIDO CLASE FECHA EXTR. Peso (mg) RENDIMIENTO (ug/mg tejido) ng/ul ug RNA A260/280 CALIDAD 28S/18S RQI CLASE mama NT 08/02/ ,50 0, ,6000 7,9920 1,76 1 0,22 3, mama NT 16/02/ ,60 0,0078 9,8700 0,1974 1, mama NT 16/02/ ,20 0, ,7100 0,6342 1, mama NT 16/02/ ,50 0,0053 6,2500 0,1250 1, mama NT 16/02/ ,10 0, ,4400 0,2887 1, mama NT 16/02/ ,00 0, ,0000 1,6000 0, mama NT 16/02/ ,30 0,0057 9,0000 0,1799 0, mama NT 24/02/ ,60 0, , ,1692 1, mama NT 24/02/ ,50 0, ,8050 4,7761 1,89 1 0,62 6, mama NT 24/02/ ,50 0,0028 4,1400 0,0828 0, mama NT 04/03/ ,80 0, ,6650 0,7133 1, mama NT 05/05/ ,10 0, , ,9642 1,86 1 0,16 3, mama NT 11/05/ ,20 0, ,0300 3,2206 1, mama NT 23/05/ ,80 0, ,6950 2,3939 1,66 1 0,72 2, mama NT 23/05/ ,30 0, ,3650 2,9273 1,77 0 3,04 1, mama NT 23/05/ ,80 0, ,5400 0,4908 1, mama NT 18/05/ ,70 0, ,9750 2,2795 1, mama NT 18/05/ ,80 0, ,7750 1,2555 1, mama NT 18/05/ ,00 0, ,2050 2,5241 1, mama NT 23/05/ ,90 0, ,7550 3,8151 1, mama NT 23/05/ ,60 0, ,7500 0,5150 0, mama NT 18/05/ ,40 0, ,5150 0,9903 0, mama NT 18/05/ ,50 0, ,2300 1,0646 0, mama NT 18/05/ ,60 2, , ,9723 1,86 1 0,93 N/A Low con mama NT 31/05/ ,20 0, ,1700 3,4034 0, mama NT 31/05/ ,50 0, ,5200 2,3904 1, mama NT 31/05/ ,20 0, ,7600 5,6352 1,78 1 0,24 2, mama NT 31/05/ ,50 0, ,9300 1,6386 1, mama NT 31/05/ ,10 0, ,4100 2,1082 1, mama NT 31/05/ ,20 0, ,2600 7,7052 1,81 1 1,04 7, mama NT 31/05/ ,70 0, ,3200 2,2864 1, mama NT 31/05/ ,50 0, ,4400 3,9088 1, mama NT 31/05/ ,30 0, ,9100 2,4182 1, mama T 16/02/ ,10 0, ,6300 1,2100 1,60 0 1,28 8, mama T 16/02/ ,10 0, ,0000 2,3599 1, mama T 16/02/ ,30 0, , ,9071 2,01 1 1,44 9, mama T 24/02/ ,00 0, ,9300 5,7586 1,45 0 0,29 3, mama T 21/02/ ,90 0, , ,0138 1,95 1 1,25 9, mama T 21/02/ ,30 1, , ,9403 1,91 1 1,14 7, mama T 08/03/ ,40 1, , ,8774 1,98 1 1, mama T 03/05/ ,60 1, , ,2589 1,95 1 1,05 7, mama T 17/05/ ,50 1, , ,2163 1,94 1 0,19 2, mama T 11/05/ ,50 0, ,1400 1,4428 0, mama T 23/05/ ,30 2, , ,3105 1,96 1 1,36 8, mama T 18/05/ ,80 0, , ,9618 1,95 1 0,68 5, mama T 23/05/ ,10 0, ,8400 4,9168 1, mama T 23/05/ ,80 2, , ,2283 1,97 1 1, mama T 23/05/ ,70 1, , ,2466 1,96 1 1,72 9, mama T 23/05/ ,60 0, , ,7744 1,96 1 0,77 6, mama T 23/05/ ,70 0, , ,5366 1,98 1 0,85 2, mama T 23/05/ ,80 0, , ,5433 1,93 1 0,75 3, mama T 18/05/ ,30 0, , ,9886 1,73 1 1,08 8, mama T 18/05/ ,70 0, , ,8022 1,87 1 0,83 6, mama T 23/05/ ,90 1, , ,6751 1,98 1 1,00 7, mama T 31/05/ ,80 0, , ,6344 1,88 1 0,02 2, mama T 31/05/ ,60 1, , ,4972 1,97 1 0,80 6,6 2

52 Metodología. Comparar distribución frecuencias entre las muestras T y NT 1 / 5&. 6! 1*!$ 7. "$"8/1***!." 7' $$ 9*:/5 ( *8

53 Resultados en tejido mamario "# $% = <()!311>?:4 = <<)<!3?(>@:4 $%&'&" 70 Rendimiento RNA Cantidad RNA insuficiente para Experion Cantidad RNA suficiente para Experion 60 Número de muestras Total N=26 Insuficiente N=3 Total N=63 Insuficiente N=33 0 TUMOR NO TUMOR

54 Resultados en tejido mamario (3()*+(,*A1>9?4 )# *+ =?()!312>(:4 $%&'&" 70 Pureza RNA (A260/280) A260/280 < 1,74 A260/280 > 1,75 60 Número de muestras Total N=26 < 1,74 N=5 Total N=63 < 1,74 N=41 0 TUMOR NO TUMOR

55 Resultados en tejido mamario,# -!! -B93.$4 )3()>1:4 (139*:4 $%&'&" Integridad RNA (Análisis de RQI ) Mama TUMOR Mama NO TUMOR 23% 26% 12% 33% 13% 52% 17% 53% 19% 22% 46% 70% 8% 6% RQI > 7 4 < RQI > 7 RQI < 4 NO APTO RQI > 7 4 < RQI > 7 RQI < 4

56 Conclusiones = $$.!/$. "> = C $& # " 7$(!$ >.$(!!0!12$2 $1!34 5

57 Perspectivas G.!..#;$ F $ $D7!."!$.. 34 E$D7

58 GRACIAS! Biobanco Universidad de Navarra H; I& GI FF J

59 Taller 3 CONTROLES DE CALIDAD Coordina: Andres C. García Rosa Pinto (Banco Nacional de ADN, Salamanca) María Almeida Parra (Banco Nacional de ADN, Salamanca) María Pérez Caro (Banco Nacional de ADN, Salamanca) Raquel Paternain (Fundación para la Investigación Médica Aplicada, Navarra)

60 Taller 3. CONTROLES DE CALIDAD Controles de calidad en los sistemas de gestión de muestras para garantizar el seguimiento e identificación de muestras María Almeida Parra Banco Nacional de ADN Carlos III. Universidad de Salamanca Palma de Mallorca, 12 noviembre

61 MARCO JURÍDICO Ley 14/2007, de 3 de julio, de Investigación Biomédica Un biobanco tiene que estar organizado como una unidad técnica con criterios de CALIDAD, orden y destino Art. 66 ORGANIZACIÓN DEL BIOBANCO: Tiene que haber un responsable del fichero, un registro de actividades del mismo, y se debe garantizar la CALIDAD, la SEGURIDAD y la TRAZABILIDAD de los datos y muestras biológicas almacenadas y de los procedimientos asociados al funcionamiento del biobanco.

62 QUÉ ES LA TRAZABILIDAD? Ley 14/2007, de 3 de julio, de Investigación Biomédica (Art. 3. Definiciones): Capacidad de asociar un material biológico determinado con información registrada referida a cada paso en la cadena de su obtención, así como a lo largo de todo el proceso de investigación.

63 CALIDAD, SEGURIDAD y TRAZABILIDAD de muestras y datos SISTEMA INFORMÁTICO DE GESTIÓN DE MUESTRAS Y DATOS (LaboratoryIntegrated Management System) Características: Herramienta óptima, flexible y multifuncional: gestión muestras biológicas y datos, incremento eficiencia del biobanco y calidad de los productos. Cumplimiento requerimientos ético legales y técnicos. Ventajas: Incrementa la eficacia ylacalidad del trabajo en biobancos Reduce errores de tipo humano Aumenta el rendimiento de los procesos Control de la trazabilidad de las muestras y datos asociados

64 CALIDAD, SEGURIDAD y TRAZABILIDAD de muestras y datos ACCESO al LIMS ACCESO RESTRINGIDO (usuario y contraseña) Medidas de seguridad: Histórico registros de acceso. Control claves de entrada, autorizaciones y accesos no deseados. Bloqueo acceso con contraseña errónea. Tiempos de caducidad para contraseñas. Desconexión LIMS tiempo máximo de espera excedido.

65 REGISTRO de muestras y datos asociados LIMS: Identificación única e inequívoca de las muestras y de su información asociada como requisito básico de funcionamiento. Registro Manual AUTOMÁTICO NO RECOMENDADO Etiquetas/lectores código barras

66 Datos asociados

67 ADJUNTAR DOCUMENTOS

68

69 PROCESAMIENTO de muestras La correcta gestión de las muestras biológicas es un punto crítico y esencial El LIMS debe: Adaptarse a tipos de muestras y líneas de procesamiento, pero siempre manteniendo la trazabilidad de las muestras y de su información asociada. Proporcionar al usuario un seguimiento completo de la ejecución de todos los procesos que tiene que seguir una muestra de acuerdo al esquema previamente diseñado. Permitir su conexión al equipamiento del biobanco.

70 PROCESAMIENTO muestras: Sistemas AUTOMATIZACIÓN Etiquetas y lectores de código de barras Evitar rotular tubos a mano!!!

71 PROCESAMIENTO muestras: Sistemas AUTOMATIZACIÓN Automatización procesamiento (ROBOTS)

72 ALMACENAMIENTO de muestras y datos El LIMS debe: Tener perfectamente localizada cada alícuota almacenada en el sistema.

73 Laboratory Integrated Management System (LIMS)

74 ALMACENAMIENTO de muestras y datos Información disponible/alícuota almacenada Listado detallado de alícuotas que alberga cada almacén. Lugar exacto de almacenamiento. Código de la alícuota. Código de la muestra de procedencia. Información asociada (datos epidemiológicos, clínicos, etc. del donante de procedencia). Centro de procedencia. Fecha y hora de obtención de la muestra original. Tipo de muestra de procedencia. Tipo de subproducto que alberga la alícuota. Cantidad que contiene. Fecha y hora de almacenamiento. Proyectos de investigación que la han utilizado. etc.

75 ALMACENAMIENTO de muestras y datos El LIMS debe: Tener perfectamente localizada cada alícuota almacenada en el sistema. Controlar movimientos muestras (cambios de posición, proyectos de investigación que las han utilizado, etc.).

76 ALMACENAMIENTO de muestras y datos

77 ALMACENAMIENTO de muestras y datos

78 ALMACENAMIENTO de muestras y datos El LIMS debe: Tener perfectamente localizada cada alícuota almacenada en el sistema. Controlar movimientos muestras (cambios de posición, proyectos de investigación que las han utilizado, etc.). Gestionar sistemas de almacenamiento y espacios. Gestionar la información almacenada

79 ALMACENAMIENTO de muestras Sistemas de identificación de muestras almacenadas Tubos rotulados/etiquetados amano Tubos identificados con código alfanumérico de posición en caja/gradilla Tubos identificados mediante etiquetas con código de barras Tubos identificados con código bidimensional fijo y único

80 Almacenamiento muestras TUBOS código 2D

81 TRAZABILIDAD Etiquetas Lectores código barras LIMS Automatización Tubos código 2D

82 Gestión de SOLICITUDES de muestras y datos 1. Búsqueda de muestras

83 Gestión de SOLICITUDES de muestras y datos 1. Búsqueda de muestras

84 Gestión de SOLICITUDES de muestras y datos 2. Generación solicitud muestras y/o datos

85 Gestión de SOLICITUDES de muestras y datos 2. Generación solicitud muestras y/o datos Posiciones muestras

86 Gestión de SOLICITUDES de muestras y datos 2. Selección muestras a enviar

87 Gestión de SOLICITUDES de muestras y datos 3. VALIDACIÓN de muestras a enviar (Código bidimensional) Ideal para mantener trazabilidad (96)

88 Gestión de SOLICITUDES de muestras y datos 3. VALIDACIÓN de muestras a enviar Microtubos con código bidimensional

89 Gestión de SOLICITUDES de muestras y datos 3. VALIDACIÓN de muestras a enviar

90 Gestión de SOLICITUDES de muestras y datos 3. VALIDACIÓN de muestras a enviar

91 Gestión de SOLICITUDES de muestras y datos 3. VALIDACIÓN de muestras a enviar

92 Gestión de SOLICITUDES de muestras y datos 4. CONTROL DE CALIDAD de muestras a enviar A qué muestras hay que hacer el control de integridad?

93 Gestión de SOLICITUDES de muestras y datos 4. CONTROL DE CALIDAD de muestras a enviar Código 2D

94 Gestión de SOLICITUDES de muestras y datos 5. ALICUOTADO AUTOMÁTICO de muestras a enviar

95 CONCLUSIÓN Los sistemas informáticos de gestión de muestras y datos y de automatización constituyen una herramienta de trabajo imprescindible para el correcto funcionamiento de un biobanco, ya que permiten garantizar la TRAZABILIDAD de todos los procesos e incrementar la CALIDAD de los productos que éste ofrece a sus usuarios.

96 DIRECCIÓN: Prof. Dr. Alberto Orfao de Matos COORDINACIÓN TÉCNICA: Dr. Andrés García Montero Dra. María Almeida Parra GESTIÓN DE CALIDAD: Ana Regalado Mayordomo CONTROL DE CALIDAD: Dra. Rosa Pinto Labajo Dra. María Pérez Caro SECRETARÍA y ADMINISTRACIÓN: Elena Chamorro Castro PERSONAL DE LABORATORIO: Javier García Palomo Teresa Malvar Ferreras Mª Teresa Márquez de Sousa Sheila Mateos Domínguez Mª Isabel Morante Arroyo

97 MUCHAS GRACIAS!! /BancoNacionalADN

98 Taller 3 CONTROLES DE CALIDAD Coordina: Andres C. García - Rosa Pinto (Banco Nacional de ADN, Salamanca) María Almeida Parra (Banco Nacional de ADN, Salamanca) María Pérez Caro (Banco Nacional de ADN, Salamanca) Raquel Paternain (Fundación para la Investigación Médica Aplicada, Navarra)

99 Taller 3: Controles de Calidad Identificación y trazabilidad de las muestras mediante marcadores genéticos Dra. Rosa María Pinto Labajo. Área de Control de Calidad Banco Nacional de ADN Carlos III- Universidad de Salamanca

100 Laboratory Integrated Management System - Etiquetas y lectores de códigos de barras - Microtubos 2D-coded - Automatización (Robots)

101 IDENTIFICACIÓN DE INDIVIDUOS DE DIFERENTE SEXO PCR de Sexo: Utiliza una pareja de oligonucleótidos que amplifica en una región conservada en ambos cromosomas X e Y pero que da lugar a un fragmento de diferente tamaño en cada cromosoma Gen AME: AMEX y AMEY: diferencia de 6 pb por deleción en cromosoma X

102 IDENTIFICACIÓN DE SEXO: PCR de Sexo SEXO: amplificación gen ZF (Fredsten y Villesten, 2004) cromosoma X: inserción de un elemento Alu de 423 pb cromosoma Y: no existe elemento Alu PCR sexo l-hind III pb B pb hombre mujer

103 PERFIL GENÉTICO por MICROSATELITES o STR s STR s: Short Tandem Repeats -secuencias cortas de 2-7 pb que se repiten a lo largo de todo el genoma -el número de repeticiones es único en cada individuo -la amplificación de estas regiones constituye el perfil o huella genética del individuo kits comerciales con combinaciones de 15 y 18 STR s - medicina forense son caros - pruebas de paternidad requieren secuenciación

104 . - AmpFSTR Profiler Plus PCR Amplification Kit (Applied Biosystems) Amplificación de 9 loci STRs: D3S1358, D5S818, D7S820, D8S1179, D13S317, D18S51, D21S11, FGA, y vwa, y el locus del gen de la amelogenina para la identificación del sexo del individuo. -STR analysis using the Promega PowerPlex 16 System. Amplificación de 16 loci (15 loci STR y 1 para el gen de la amelogenina): Penta E, D18S51, D21S11, TH01, D3S1358, FGA, TPOX, D8S1179, vwa, Amelogenin, Penta D, CSF1PO, D16S539, D7S820, D13S317 y D5S818. La detección de la fluorescencia de los genotipos es compatible con los equipos ABI PRISM 310, 3100 y 3100-Avant Genetic Analyzers, Applied Biosystems 3130 and 3130xl Genetic Analyzers and ABI PRISM 377 DNA Sequencer.

105 EPICENTRE Forum 5 (3) Multiplex PCR Amplification of STRs from DNA Isolated with the MasterAmp Buccal Swab DNA Extraction Kit Haiying Grunenwald, Epicentre Technologies CHLC (Cooperative Human Linkage Center) markers Sheffield JC et al (1995), Gastier JM et al (1995) 5 pares de oligonucleótidos PCR MÚLTIPLE 5 parejas de oligonucleotidos: agarosa 3% marcadores: DXS7132 GATA31E08 DYS390 GATA175D03 DXS6789 tamaño producto PCR pb pb pb pb pb carriles 3, 5, 7, 100 bp DNA ladder 2: muestra mujer 4, 6, 8 : muestras hombres

106 VALIDACIÓN DEL PROTOCOLO AND molde 100 ng 50% Hi-Gel Matrix (Biotools) y 0,7% agarosa estándar 4 individuos en dos reacciones de PCR diferentes una con Tm a 55ºC y otra con Tm a 58ºC x174 HaeIII /

107 Tipo de Muestras Sangre EDTA Plasma ADN Sangre Procesamiento/ alicuotado automático Sangre ACD Leucocitos Inmortalización Líneas celulares Microtubos con código bidimiensional (Micronic ) -80ºC Papel FTA 15-30ºC N 2 líquido -196ºC

108 . Amplificación diferentes tipos de muestra: muestras obtenidas con diferentes protocolos

109 . muestras de distintos orígenes Muestras ADN de sangre (100 ng ADN molde) Muestras ADN papel FTA (2 discos de 1.2 mm ADN molde) A B C D A B C D A = D B = C

110 No permite diferenciar hermanos pero sí grado madre/ padre de hijos/as H1 H2 H3 M H M H1 H2 H3 P pb H1 H2 H3: tres hermanos M: madre H: hijo M: marcador tamaño molecular: φ X174 DNA-Hae III H1 H2 H3: tres hermanos P: padre

111 Pérdida de trazabilidad durante el procesamiento de muestras de sangre en EDTA 1- En un momento durante el procesamiento de la muestra de sangre en EDTA se sospecha un posible cruce entre la muestras 2708 y Se continua el procesamiento 3- Se compara el ADN de las muestras procesadas en EDTA con el ADN obtenido a partir de la línea celular (en ACD) 4- Se confirma el error en la codificación de la muestra 5- Se procede al cambio de codificación previamente al proceso de normalización

112 Muestras codificadas erróneamente en el centro de obtención de la muestra 1- Se reciben dos muestras rotuladas con el mismo código 0152 pero con 2 cuestionarios distintos: 0151 y En la aplicación se registran los dos códigos del cuestionario: 0151: A 0152: B 3- Se confirma que A y B son dos individuos distintos como indicaba el cuestionario 4- Se solicita al hospital que contacte M A B con uno de los dos donantes para obtener muestra de nuevo bien pb codificada A B M Se comparan los tres ADN: 0151: B 0152: A 6- Se cambia la relación de códigos en la aplicación

113 Muestras codificadas erróneamente en el centro de obtención de la muestra 1- Se reciben de un mismo centro dos muestras con el mismo código origen 269 C.O 269 = A C.O 270 = B 2- Vuelven a enviar desde el hospital la muestra C.O 269 M A B pb C.O 269= A C.O 269= B C.O 270= A 3- Se cambian los códigos en la aplicación

114 Muestras codificadas erróneamente en el centro de obtención de la muestra 1- Se recibe desde el hospital tres muestras de un proyecto correspondiente a un trío: padre, madre e hija. Estas muestras estas contenidas en tubos no identificados 2- Las muestras se procesan y se lleva a cabo una PCR de sexo para identificar al padre La muestra 2 es el padre 3- Se solicita al hospital una muestra de saliva de cada individuo identificado. 4- Se comparan los perfiles genéticos de las muestras procesadas de sangre (no identificadas) y de saliva (identificadas)

115 muestras saliva P: padre M: madre H: hija muestras sangre 2: padre 1 y 3: madre, hija? pb M H M P 1 = H 2 = P 3 = M 1 H 2 P 3 M

116 Confirmación de las placas alicuotadas previamente al envío de muestras Réplicas de dos cajas micronic A02801 y A01068 En dos placas de 96 pocillos S901CWNJ y S901CWNI

117 Identificación de cajas de envío tras el alicuotado A02801 S901CWNJ A01068 S901CWNI H1 H2 H1 H2 H1 H2 H1 H A02801 = S901CWNJ 1 = 3 2 = 4 * * A01068 = S901CWNI 5 = 7 6 = 8 * * H1 H2 1 = 3 5 = 7 2 = 4 6 = 8

118 Confirmación de las placas alicuotadas previamente al envío de muestras Réplicas en dos placas de muestras de tejido normal y tumoral 1 N 1T 2N 2T 3N 3T N: normal T: tumoral

119 Incidencia durante la inmortalización de líneas celulares (sangre ACD) ALÍCUOTAS LINFOBLASTOS EXTRACCIÓN ADN INFECCIÓN VIRUS EPSTEIN- BARR CULTIVO ALÍCUOTAS LINFOBLASTOS 1- Durante el proceso de inmortalización se sospecha de un cruce entre dos muestras (cada muestra se realiza por duplicado). Los códigos de las muestras son y Las muestras se denominan temporalmente como: a b a b2

120 Incidencia durante inmortalización de líneas celulares 3- Se realiza un perfil genético entre las 4 muestras problema y las muestras y procesadas a partir de sangre EDTA almacenadas en tubos micronic El técnico que realiza la inmortalización sugiere que las muestras a2 y b2 podrían corresponderse a la muestra almacenada en micronic Se cumple que las muestras a2 y b2 son el individuo y las muestras a1 y b1 son el individuo

121 Incidencia durante el proceso de normalización (1) Xxxx muestra de ADN en solución a 4ºC para ser normalizada Xxxx : muestra ya normalizada y alicuotada en micronic Xxxx = Xxxx?? M Xxxx = Xxxx La muestra Xxxx se normaliza y se alicuota en micronic

122 Incidencia durante el proceso de alicuotado Durante el proceso de alicuotado de muestras la aplicación informática detecta que uno de los códigos (11030) correspondiente a una muestra que va a ser alicuotada, y que hasta el momento se ha mantenido en la nevera a 4ºC, se corresponde a una muestra ya almacenada en caja micronic micronic ºC 1- La muestra fue procesada en dos tubos uno de ellos ha sido encontrado en la nevera pero su perfil genético no se corresponde con la muestra del mismo código alicuotada en micronic. 2- En la nevera también se ha encontrado un solo tubo de la muestra (código muy similar) mientras que el otro tubo no ha sido encontrado ni existe registro de que haya sido alicuotado. 3- Se sospecha que uno de los tubos de la muestra se ha mezclado con uno de los tubos de la muestra previamente al alicuotado de la muestra y que probablemente la mezcla de ambos sea la muestra alicuotada en caja micronic correspondiente al código

123 1º eliminamos la muestra del tubo micronic 2º inmortalizan las líneas celulares de y para obtener ADN de cada de una de ellas 3º se comparan los perfiles genéticos de las muestras a 4ºC y el ADN obtenido de la línea celular inmortalizada 4º para cada una de las muestras se unen el ADN almacenado a 4ºC y el ADN obtenido de la línea celular inmortalizada 5º ambas muestras (correspondientes a los códigos y 11130) se normalizan POR SEPARADO!! y se alicuotan en tubos micronic para su almacenamiento a -80ºC

124 Conclusión: Los cinco marcadores STR pertenecientes a Cooperative Human Linkage Center (CHLC) permiten diferenciar mediante PCR múltiple y electroforesis en gel de agarosa de alta resolución perfiles genéticos de diferentes individuos siempre y cuando dichos individuos no sean hermanos entre sí.

125 GRACIAS!

126 DIRECCIÓN: Prof. Dr. Alberto Orfao de Matos COORDINACIÓN TÉCNICA: Dr. Andrés García Montero Dra. María Almeida Parra GESTIÓN DE CALIDAD: Ana Regalado Mayordomo CONTROL DE CALIDAD: Dra. Rosa Pinto Labajo Dra. María Pérez Caro SECRETARÍA y ADMINISTRACIÓN: Elena Chamorro Castro PERSONAL DE LABORATORIO: Javier García Palomo Teresa Malvar Ferreras Mª Teresa Márquez de Sousa Sheila Mateos Domínguez Mª Isabel Morante Arroyo