COLINESTERASA Liquiform
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- Antonia Crespo Santos
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1 COLINESTERASA Liquiform Instrucciones de Uso Ref.:139 Finalidad. Sistema para determinar la actividad de la colinesterasa (pseudocolinesterasa o colinesterasa II) en muestras de suero o plasma por reacción cinética. [Solo para uso diagnóstico in vitro.] Principio. La colinesterasa (CHE) cataliza la hidrólisis de la butiriltiocolina, con formación de butirato y tiocolina. La tiocolina reduce el ferricianuro de potasio, de color amarilla, a ferrocianuro de potasio que es prácticamente incoloro. La reducción de la absorbancia en 405 nm, consecuente con la disminución del ferricianuro de potasio, se monitorea fotométricamente, siendo directamente proporcional a la actividad de la colinesterasa en la muestra. Butiriltiocolina + H O Características del sistema. La metodología cinética para la 1 medición de la actividad de la colinesterasa fue presentada por Dietz et al y modificada posteriormente por Deutsche Gesellschaft für Klinische Chemie (DGKC). El sistema utiliza el sustrato butiriltiocolina, que presenta mayor especificidad para la colinesterasa II, minimizando la interferencia de la acetilcolinesterasa (colinesterasa I), presente en muestras hemolizadas. Los reactivos están listos para el uso, facilitando su aplicación en sistemas semiautomáticos y automáticos, capaces de realizar mediciones en modo cinético longitud de onda de 405 nm. Metodología. Reactivos Cinética - DGKC CHE Reactivo 1 - Almacenar entre - 8 ºC. Contiene tampón pirofosfato 90 mmol/l y ferricianuro de potasio mmol/l. Reactivo - Almacenar entre - 8 ºC. Contiene butiriltiocolina 15 mmol/l. Butirato + Tiocolina Tiocolina+[Fe(CN) ] +OH Ditiobis(colina) +H O+[Fe(CN) ] 6 6 Los reactivos no abiertos, cuando se almacenan en las condiciones especificadas, son estables hasta la fecha de caducidad impresa en la etiqueta. Una vez abiertos, los reactivos deben manejarse de acuerdo con las buenas prácticas de laboratorio para evitar contaminaciones de naturaleza química y microbiana que pueden causar reducción de la estabilidad. Los cuidados habituales de seguridad deben aplicarse en el manejo de los reactivos. En los analizadores automáticos, los reactivos están sujetos a contaminaciones con otros reactivos o con el aire ambiente, que dependen de la característica del equipamiento y de las condiciones de trabajo. Esas contaminaciones pueden resultar en disminución de la estabilidad de los reactivos o modificaciones en su rendimiento. Material necesario y no fornecido 1.. Baño maría mantenido a una temperatura constante de 37 ºC. Fotómetro con cubeta con termostato a 37 ºC capaz de medir, con precisión, la absorbancia a 405 nm Precauciones y cuidados especiales Pipetas para medir muestras y reactivos. Cronómetro. Calibrador - Línea Calibra H - Ref. 80, Labtest. Muestra Se debe generar un Procedimiento Operativo Estándar (POP) para establecer los procedimientos correctos para la recogida, preparación y almacenaje de la muestra. Se hace hincapié en que los errores debido a la muestra, pueden ser mucho mayores que los errores que sobrevienen durante el procedimiento analítico. Utilizar el suero o plasma (EDTA, Heparina). No utilice anticoagulantes que contenga fluoruro, pues inhibe la actividad de la colinesterasa. La actividad enzimática se mantiene estable en las muestras almacenadas durante 15 días a - 8 ºC y 6 meses a 0 ºC negativos. Como ninguna prueba conocida puede asegurar que las muestras de sangre no transmiten infecciones, todas ellas deben considerarse como potencialmente infecciosos. Por lo tanto, al manejarlas, se deben seguir las normas establecidas para la bioseguridad. Para desechar los reactivos y el material biológico sugerimos aplicar las normas locales, estaduales o federales de protección ambiental. Interferencias Concentraciones de bilirrubina hasta 0 mg/dl, hemoglobina hasta 00 mg/dl y triglicéridos hasta 100 mg/dl no producen interferencias significativas. 01 Español - Ref.: 139
2 Para valorar la concentración de la hemoglobina en una muestra hemolizada puede llevarse a cabo de la siguiente forma: Disolver 0,05 ml de la muestra en,0 ml de NaCl 150 mmol/l (0,85%) y medir la absorbancia en 405 o 415 nm ajustando el cero con el agua desionizada o destilada. Hemoglobina (mg/dl) Absorbancia405 x 601 Hemoglobina (mg/dl) Absorbancia x 467 Procedimiento Parámetros para los analizadores automáticos Parámetros Tipo de Reacción Dirección de Reacción λ primario λ segundario Temperatura Calibración Modelo de Calibración* Volumen de Muestra** Volumen de R1** Volumen de R** Adición de R Lectura 1 (Absorbancia 1) Lectura (Absorbancia ) R1: 00 µ L Muestra: 4 µ L 37 ºC *La definición del modelo de calibración debe adecuarse a cada modelo del equipamiento. En caso de dudas, por favor, póngase en contacto con el Servicio de Apoyo al Cliente Labtest. **Los volúmenes de las muestras y de los reactivos pueden modificarse proporcionalmente sin afectar el rendimiento de la prueba. En caso de reducción de los volúmenes, es fundamental que se observe el volumen mínimo requerido para la medición fotométrica. 415 Aplicación Cinética Decreciente 405 nm 700 nm 37 ºC ( puntos) Punto 0: Blanco (Agua desionizada/salina) Punto 1: Calibrador 1 Lineal 4 µ L 00 µ L 50 µ L 300 segundos tras la adición de R1 + muestra 10 segundos tras la adición de R 300 segundos tras la adición de R R: 50 µ L nm 5 7 A1 10 min A Procedimiento manual Condiciones óptimas de reacción: Longitud de onda: 405 nm; Cubeta termostatizada a 37 ± 0, ºC con 1,0 cm de espesor de solución; Banda de pasaje nm; Luz espuria 0,1. Tome tubos de ensayo y proceda de la siguiente manera. Parte 1 *Se recomienda la utilización de calibrador Calibra H - Labtest. Homogeneizar e incubar en Baño maría a 37 ºC durante 3 minutos. El nivel de agua en el baño debe ser superior al nivel del reactivo en los tubos de ensayo. Parte Añadir a los tubos 1. Homogeneizar y transferir inmediatamente para la cubeta termostatizada a 37 ± 0, ºC. Esperar minutos.. Realizar la lectura de la absorbancia inicial (A ) en 405 nm disparando al mismo tiempo el cronómetro. Repetir la lectura después de 3 minutos (A ). Prueba Calibrador Muestra 0,0 ml ---- Calibrador* ,0 ml Reactivo 1 1,0 ml 1,0 ml Prueba Calibrador Reactivo + 0,5 ml + 0,5 ml Al igual que en toda medición de actividad enzimática, la estricta observación del tiempo y de la temperatura de incubación es de gran importancia para la calidad de los resultados obtenidos. Con el objetivo de evaluar la linealidad de la reacción, se debe registrar la absorbancia con intervalos de 1 minuto y verificar si las diferencias de absorbancia en cada minuto son equivalentes. Los procedimientos sugeridos son adecuados para fotómetros cuyo volumen mínimo de reacción para la medición es igual o menor que 1,0 ml. Se debe efectuar una verificación sobre la necesidad de ajuste del volumen para el fotómetro utilizado. Los volúmenes de las muestras y reactivos pueden modificarse proporcionalmente sin afectar el rendimiento de la prueba, además el procedimiento del cálculo permanece sin cambio. En el caso de reducción de los volúmenes, es fundamental que se observe el volumen mínimo requerido para la medición fotométrica. Volúmenes de muestra menores que 0,010 ml son críticos en aplicaciones manuales y se debe usar con precaución ya que aumentan inexactitud de la medición. 1 0 Español - Ref.: 139
3 Cálculos. Como en la mayoría de las veces no se puede trabajar bajo condiciones óptimas de reacción, las buenas prácticas del laboratorio recomiendan realizar la calibración del ensayo con el empleo del calibrador indicado por el fabricante del reactivo. Labtest indica el calibrador Calibra H - Ref. 80 para calibración del sistema COLINESTERASA Liquiform. A/minuto Prueba o Calibrador = (A -A )/3 Factor = Calibración. Actividad del Calibrador A/min Calibrador COLINESTERASA (U/L) = A/min Prueba x Factor Ejemplo Prueba A = 1,733 A = 1, ,733-1,606 A/min Prueba = = 0,04 3 Calibrador A = 1,716 A = 1,55 1 1,716-1,55 A/min Calibrador = = 0,055 3 Actividad del Calibrador (U/L) = Factor = = ,055 Actividad de la COLINESTERASA (U/L) = 0,04 x = 3131 U/L Si se cumple las condiciones óptimas de reacción mencionadas previamente, se puede optar por la utilización del factor Intervalo operativo. Usar calibrador Calibra H - Ref. 80, Labtest. Intervalo de calibraciones Cuando indica el control interno de la calidad. Cuando se utiliza un nuevo lote de reactivos. Cuando se utiliza nuevos envases de reactivos de un mismo lote, si se ha realizado una nueva calibración durante la utilización del envase anterior. El resultado de la medición es lineal entre 80 y 0000 U/L. Para valores mayores, disolver la muestra con NaCl 150 mmol/l (0,85%). Realizar una nueva medición y multiplicar el resultado obtenido por el factor de dilución. Control interno de calidad. 1 El laboratorio debe mantener un programa de control interno de la calidad que defina claramente los reglamentos aplicables, objetivos, procedimientos y criterios para los pliegos de la calidad y límites de tolerancia, acciones correctivas y registro de las actividades. Materiales de control deben utilizarse para monitorear la inexactitud de la medición y desviaciones de la calibración. Se propone que los pliegos para el coeficiente de variación y error total se 3, 4, 5 basan en los componentes de la variación biológica (VB). 6 Intervalo de referencia. Estos valores se deben usar apenas como guía Se recomienda que cada laboratorio establezca su propio intervalo de referencia en la población atendida. Conversión: Unidades Convencionales (U/L) x 16,7 = Unidades SI (nkat/l). Características del rendimiento Estudios de recuperación. Muestras con actividades de colinesterasa conocida fueron probadas con el sistema COLINESTERASA Liquiform, en el que se obtiene los siguientes resultados: Actividad (U/L) Adultos Mujeres Hombres Esperada El error sistemático total medio obtenido fue igual al,83%. El error sistemático total obtenido es menor que el error sistemático total de la especificación deseable basada en los componentes da Variación Biológica que es ± 4,8%. Estudios de comparación de métodos. El método propuesto fue contrastado con otro producto de metodología análoga, y se obtuvieron los siguientes resultados: Número de muestras Intervalo de concentraciones (U/L) Ecuación de regresión Coeficiente de correlación Utilizando la ecuación de la regresión, el error sistemático (sesgo) estimado es igual al 1,01% para una muestra con actividad de colinesterasa igual a U/L, 0,5% para una muestra con actividad de colinesterasa igual a U/L y 0,39% para una muestra con actividad de colinesterasa igual a U/L. Esos errores son menores que el error sistemático analítico de la especificación deseable basada en la variación biológica que es ± 4,8%. 7 Encontrada Método Contrastivo 40 Valores (U/L) Recuperación (%) 101,6 103,7 103,1 103, Colinesterasa Liquiform Método Labtest = 0,9978x Contrastivo - 3,8 0, Español - Ref.: 139
4 Estudios de precisión. Los estudios de precisión se han realizado con la utilización de muestras con valores de actividad iguales a 881, 8080 y 1395 U/L. Repetibilidad - Imprecisión intraensayo Muestra 1 Muestra Muestra 3 La imprecisión total obtenida para las muestras cumple con la especificación deseable para la inexactitud total basada en la variación biológica que es 3,1%. El error total (error aleatorio + error sistemático) estimado en actividades de 881, 8080 y 1395 U/L son iguales al,9,,04 y al,17%, respectivamente. Los resultados señalan que el método cumple con la especificación deseable para el error total ( ± 9,8%) basada en los componentes deseables de la Variación Biológica. Sensibilidad metodológica. N Se ha utilizado una muestra que no contenía colinesterasa para calcular el límite de detección del ensayo, en la cual se ha encontrado un valor igual a 76,3 U/L correspondiente al promedio de 10 ensayos, más tres desviaciones estándar. 8 Significado clínico. Promedio DP (U/L) CV (%) ,8 0, ,4 0, ,3 0,36 Reproducibilidad - Imprecisión total Muestra 1 Muestra Muestra 3 N Promedio DP (U/L) CV (%) ,7 1, ,7 0, ,8 1,08 El término colinesterasa se refiere a dos enzimas relacionadas: la acetilcolinesterasa, llamada también colinesterasa verdadera (EC ) y la acilcolinesterasa, también llamada pseudocolinesterasa o colinesterasa sérica (EC ). La colinesterasa verdadera se encuentra en los eritrocitos, pulmones, bazo, terminaciones nerviosas y en la materia gris del cerebro. La pseudocolinesterasa se encuentra en el hígado, páncreas, corazón, materia gris del cerebro y en el suero. A pesar de que su función biológica es desconocida, la pseudocolinesterasa es una enzima clínicamente relevante. Valores disminuidos de colinesterasa en el suero son relatados en la hepatitis aguda, hepatitis crónica de larga duración, cirrosis y carcinoma metastático. Los insecticidas órganofosforados también causan disminución de los valores de colinesterasa, debido a la inhibición directa de la enzima. Por lo tanto, en personas que entran en contacto con órganofosforados, el monitoreo de los niveles de colinesterasa en el suero es fundamental. Hay personas con actividades reducidas de la enzima en suero debido a la existencia de diversos genes ligados a la producción de colinesterasa. Dependiendo de la combinación de estos genes, los niveles de colinesterasa pueden variar desde los límites normales hasta cero. Por ello, conocer el nivel basal de colinesterasa en el suero de un individuo es importante para determinar su sensibilidad a drogas que son rotas por esta enzima, como los relajantes musculares cloruro de suxametonio y mivacurium. Valores ligeramente aumentados de colinesterasa son relatados en pacientes con síndrome nefrótico, tirotoxicosis, hemocromatosis, en pacientes diabéticos obesos y en pacientes con ansiedad y otros estados psíquicos. Observaciones 1. La limpieza y secado adecuados del material utilizado son factores fundamentales para la estabilidad de los reactivos y obtención de resultados correctos.. El laboratorio clínico tiene como objetivo fornecer resultados exactos y precisos. La utilización de agua de calidad inadecuada es una causa potencial de errores analíticos. El agua desionizada o destilada utilizada en el laboratorio debe tener la calidad adecuada para cada aplicación. Así, para preparar reactivos y usar en las mediciones y para su uso en enjuague final de la vidrería, debe tener resistividad 1 megaohm.cm o conductividad 1 microsiemens/cm y concentración de silicatos <0,1 mg/l. Cuando la columna desionizadora está con su capacidad saturada, se produce agua alcalina con liberación de varios iones, silicatos y sustancias con gran poder de oxidación o reducción que deterioran los reactivos en pocos días o incluso horas, alterando los resultados de modo imprevisible. Por lo cual es fundamental establecer un programa de control de la calidad del agua. Referencias 1. Dietz AA, Rubinstein HM, Lubrano T. Clin Chem 1973; 19(11): Proposal of standard methods for the determination of enzyme catalytic concentrations in serum and plasma at 37 degrees C. II. Cholinesterase (acylcholine acylhydrolase, EC ). Working Group of Enzymes, German Society for Clinical Chemistry. Eur J Clin Chem Clin Biochem 199; 30(3): Ricos C, Desirable Specifications for Total Error, Imprecision, and Bias, derived from intra- and inter-individual biologic variation. Disponível em: (acesso em 10/09/01). 4. Basques JC. Especificações da Qualidade Analítica. Labtest Diagnóstica Westgard JO, Barry PL, Hunt MR, Groth T. Clin Chem 1981; 7: Recommendation of the German Society for Clinical Chemistry. Standardization of methods for the estimation of enzyme activities in biological fluids: Standard Method for the determination of Cholinesterase activity. JClin Chem Clin Biochem 199;30: Labtest: Dados de arquivo. 04 Español - Ref.: 139
5 8. Burtis CA, Ashwood ER. Tietz Textbook of Clinical Chemistry,.ed. Philadelphia: W.B. Saunders Company, p Presentación Producto Colinesterasa Liquiform Referencia 139-1/30 1 Contenido 1 X 4 ml 1 X 6 ml Informaciones al consumidor [Términos y Condiciones de Garantía] Labtest Diagnóstica garantiza el desempeño de este producto dentro de las especificaciones hasta la fecha de expiración indicada en los rótulos, siempre que los cuidados de utilización y almacenamiento indicados en los rótulos y en estas instrucciones sean seguidos correctamente. Están disponibles aplicaciones para sistemas automáticos y semiautomáticos. El número de ensayos en aplicaciones automáticas depende de los parámetros de la programación. Labtest Diagnóstica S.A. CNPJ: / Av. Paulo Ferreira da Costa, Vista Alegre - CEP Lagoa Santa. Minas Gerais Brasil - Servicio de Apoyo al Consumidor sac@labtest.com.br Edición: Abril, 013 Ref.: 4014 Copyright by Labtest Diagnóstica S.A. Reproducción bajo previa autorización 05 Español - Ref.: 139
6 06 Español - Ref.: 139
1. Baño-maría mantenido a temperatura constante (37ºC). 2. Fotómetro capaz de medir con exactitud absorbancias entre 530 y 550 nm.
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