CK-NAC Liquiform. 01 Español - Ref.: 117. Ref.:117. Instrucciones de Uso

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1 CK-NAC Liquiform Instrucciones de Uso Ref.:117 Finalidad. Sistema para determinación cuantitativa de la actividad de la creatina quinasa total (CK) en modo cinético en suero o plasma. [Solamente para uso diagnóstico in vitro.] 1-3 Principio. La actividad de la creatina quinasa total es determinada en acuerdo a la secuencia de reacciones expuestas a continuación: Creatina Fosfato + ADP ATP + Glucosa HK Glucosa-6-Fosfato + NADP CK Creatina + ATP ADP + Glucosa-6-Fosfato G-6-PDH 6-PG + NADPH La CK cataliza la desfosforilación de la creatina fosfato para producir adenosina trifosfato (ATP), que reacciona con la glucosa en presencia de la hexoquinasa (HK) formando glucosa-6-fosfato. En presencia de glucosa-6-fosfato deshidrogenasa (G-6-PDH), la glucosa-6-fosfato es oxidada a 6-fosfogluconato (6-PG) y reduce el NAD a NADPH. La velocidad de incremento en la absobancia en 340 nm es proporcional a la actividad del CK en la muestra. Características del sistema. El método se basa en las condiciones de reacción optimizadas por Szasz, que incorporó la activación de la CK con N-acetil cisteína (NAC). El método fue exhaustivamente evaluado por la International Federation of Clinical 5 Chemistry and Laboratory Medicine (IFCC), que recomendó su utilización con las concentraciones de los reactivos más favorables a las condiciones cinéticas y a los aspectos técnicos del sistema de medición. El sistema CK NAC Liquiform es trazable al método de referencia del IFCC 5 y al material de referencia ERM -AD455/IFCC del Institute for Reference Materials and Measurements. La utilización del calibrador, que contiene CK-MM y CK-MB humana, corrige la respuesta del sistema de medición, obteniendo exactitud deseable de los resultados. La actividad enzimática del CK a el calibrador 5 es trazable al Procedimiento Primario de Referencia del IFCC y al material de referencia ERM -AD455/IFCC. El sistema CK-NAC Liquiform - Labtest utiliza mediciones en modo cinético y puede ser fácilmente aplicado en ana-lizadores automáticos y semiautomáticos capaces de medir la absorbancia en 340 nm, aplicando método bireactivo o monoreactivo. 4 Metodología. IFCC. Reactivos 1. - Reactivo 1 - Conservar entre 2-8 ºC. Contiene tampón imidazol 125 mmol/l, N-acetil cisteína 25 mmol/l, ADP 2,5 mmol/l, AMP 6,25 mmol/l, diadenosina pentafosfato 12,5 mol/l, acetato de magnesio 12,5 mmol/l, NADP 2,5 mmol/l, hexoquinasa 5000 U/L, G-6-PDH 3500 U/L, azida sódica 0,095% y estabilizador Reactivo 2 - Conservar entre 2-8 ºC. Contiene tampón, glucose 100 mmol/l, creatina fosfato 150 mmol/l, azida sódica 0,095% y estabilizador Calibrador - Armazenar entre 2-8 ºC. Preparación liofilizada contiendo tampón 50 mmol/l, cloruro de sódio 154 mmol/l, albumina bovina 3,5%, CK-MM y CK-MB de origen humano y estabilizadores. Ver en el rótulo del frasco, el valor señalado de la actividad enzimática. Los reactivos no abiertos, conservados en las condiciones especificadas, son estables hasta la fecha de expiración impresa en su rótulo. Durante el manipuleo, los reactivos están sujetos a contaminaciones de naturaleza química y microbiana que pueden provocar disminución de la estabilidad. Precauciones y cuidados especiales No utilizar el Reactivo de Trabajo cuando se muestre turbio o con señales de contaminación. Se deben aplicar los cuidados habituales de seguridad en el manejo del reactivo. Los reactivos contienen azida sódica, que es tóxica. Se debe tomar cuidado para evitar la ingesta y en caso de contacto con los ojos se deben lavar inmediatamente con gran cantidad de agua y procurar auxilio médico. La azida puede formar compuestos altamente explosivos con tuberías de plomo y cobre. Así siendo, utilizar grandes volúmenes de agua para deshacerse los reactivos. Cuidados con el tiempo de reacción, temperatura de trabajo y pipeteos son extremadamente importantes para la obtención de resultados correctos. Los reactivos deben ser manoseados siguiendo las buenas prácticas de laboratorio que indican evitar ingestión y contacto con piel, mucosas y ojos. El Calibrador es preparado a partir de derivados de sangre humana y fue ensayado para determinar la presencia de HBsAg, anticuerpos anti-hcv y anti-hiv presentando resultados negativos. A pesar de haberse utilizado tests validados y aprobados, ninguno de ellos puede asegurar que productos derivados de sangre humana estén libres de agentes infecciosos. 01 Español - Ref.: 117

2 Por lo tanto, los cuidados habituales de seguridad deben ser aplicados en la manipulación del producto, el que no debe ser pipeteado con la boca. Se recomienda manipularlo como siendo potencialmente infectivo. Material necesario y no suministrado 1. Fotómetro con cubeta termostatizada capaz de medir con exactitud la absorbancia en 340 nm. 2. Pipetas para medir muestras y reactivos. 3. Cronómetro. Influencias preanalíticas. Inyecciones intramusculares pueden aumentar en hasta 5 veces la actividad de la creatina quinasa. El ejercicio físico puede elevar los valores de la CK en hasta 3 veces, con la consiguiente regresión de los valores 24 horas después. En casos de ejercicio prolongado, la actividad puede aumentar hasta 24 veces. Este aumento es menos significativo en individuos mejor condicionados físicamente. En el embarazo normal ocurre una disminución significativa de la actividad de la CK entre la octava y vigésima semana. Fue observado que la variación biológica individual puede alcanzar los 30% y que la enzima se reduce con la edad, después los 70 años, en individuos del sexo masculino. El uso prolongado del torniquete puede producir resultados falsamente elevados. Muestra Se debe crear un Procedimiento Operacional Estándar (POE) que establezca procedimientos adecuados para la recogida, preparación y almacenamiento de la muestra. Subrayamos que los errores debidos a la muestra pueden ser bastante más grandes que los errores acaecidos durante el procedimiento analítico. Usar suero o plasma obtenido con EDTA o heparina. La actividad enzimática es estable 24 horas entre C, 7 días entre 2-8 ºC y 4 semanas entre -15 ºC y -25 ºC. La muestra debe ser protegida de la acción de la luz. Muestras fuertemente hemolisadas no son adecuadas porque pueden contener niveles elevados de adenilato quinasa, ATP y glucosa-6-fosfato, capaces de producir resultados falsamente elevados. Como ningún test conocido puede asegurar que muestras de sangre no transmiten infecciones, todas deben ser consideradas como potencialmente infectantes. Así siendo, al manejarlas se deben seguir las normativas establecidas para bioseguridad. Para deshacerse de los reactivos y del material biológico, sugerimos aplicar las normativas locales, regionales o nacionales de protección ambiental. Valores de triglicéridos más altos que 1000 mg/dl producen resultados falsamente disminuidos. Valores de hemoglobina hasta 1 mg/dl no producen interferencias significativas. Muestras con valores superiores no deben ser utilizadas porque pueden contener niveles elevados de adenilato quinasa, ATP y glucosa-6-fosfato, capaces de producir resultados falsamente elevados. Preparo del reactivo de trabajo. Mezclar 4 volúmenes de Reactivo 1 e 1 (un) volumen de Reactivo 2. El reactivo de trabajo es estable 14 días entre 2-8 ºC y 24 horas entre ºC, mantenido en recipiente cerrado, mientras no suceda contaminación química o microbiana. Para preparar el volumen de reactivo necesario para realizar un test, mezclar 0,8 ml del Reactivo 1 y 0,2 ml del Reactivo 2. Identificar el frasco como Reactivo de Trabajo y fecha de preparación. Para preservar su desempeño el reactivo debe permanecer fuera del frigorífico únicamente el tiempo necesario para obtenerse el volumen a ser utilizado. Evitar exposición a la luz solar directa. Reconstitución del calibrador Ver Observaciones2 y 3 Remover el cierre de aluminio y retirar cuidadosamente la tapa de goma. Utilizando una pipeta volumétrica calibrada, añadir al frasco del calibrador el volumen de agua tipo II indicado en el rótulo. Recolocar la tapa de goma, dejar en reposo durante 10 minutos y homogeneizar suavemente por inversión. Antes de utilizar, homogeneizar suavemente y retirar la cantidad necesaria para uso. Tapar inmediatamente y almacenar entre 2-8 ºC. Después de la reconstitución, el calibrador es estable 30 días se almacenado entre 2-8 ºC, bien vedado y protegido de la luz. Para almacenamiento por periodo superior a 30 días sugerimos, después de reconstitución, separar el calibrador en alícuotas y congelar en temperatura inferior a -10 ºC por hasta 90 días en recipiente hermeticamente cerrado, protegido de la luz. Para evitar evaporación del material durante el periodo de almacenamiento es fundamental utilizar frascos adecuados para congelación (criotubos). Las alícuotas del calibrador deben ser congeladas solamente una vez. Para preservar el desempeño, mantener el calibrador fuera de la temperatura de almacenamiento solamente por el tiempo mínimo necesario para obtenerse el volumen a ser utilizado. El Calibrador debe ser manoseado de acuerdo con las buenas prácticas de laboratorio para evitar contaminaciones de naturaleza química y microbiana que pueden provocar reducción de la estabilidad. Interferencias Valores de bilirrubina hasta 38 mg/dl y triglicéridos hasta 1000 mg/dl no producen interferencias significativas. 02 Español - Ref.: 117

3 Ver Observaciones1,2 y 3. Condiciones de reacción Longitud de onda: 340 nm. Cubeta termostatizada a 370,2 ºC. 1. En uno tubo conteniendo 1,0 ml del Reactivo de Trabajo añadir 0,02 ml de muestra o Calibrador, homogeneizar y transferir inmediatamente a la cubeta termostatizada a 37 ºC. Esperar por 2 minutos. 2. Hacer la lectura de la absorbancia inicial (A ) disparando el 1 cronómetro simultáneamente. Repetir la lectura después de 2 minutos (A ). 2 Para verificar la linealidad de la reacción, hacer también una lectura con intervalo de 1 minuto y verificar si la diferencia de absorbancia en cada minuto es constante. El procedimiento sugerido para la medición es adecuado para fotómetros cuyo volumen mínimo de solución para lectura es igual o menor que 1,0 ml. Se debe hacer una verificación de la necesidad de ajuste del volumen para el fotómetro utilizado. Los volúmenes de muestra y reactivo pueden ser modificados proporcionalmente sin perjuicio para el desempeño de la prueba y el procedimiento de cálculo se mantiene inalterado. En caso de reducción de los volúmenes es fundamental que se observe el volumen mínimo necesario para la lectura fotométrica. Volúmenes de la muestra menores que 0,01 ml son críticos en aplicaciones manuales y deben ser usados con cautela porque aumentan la imprecisión de la medición. Cálculos. Ver linealidad. A - A A - A A/minuto Test = A/minuto Calibrador = 2 2 Actividad de la CK (U/L) = CCal: concentración del calibrador Ejemplo Test Procedimiento A = 0,350 A = 0, A/min Test A/min Calibrador 0,378-0,350 A/min Test = = 0,014 2 Calibrador A = 0,316 A = 0, x CCal Concentración del Calibrador(U/L): 268 0,014 Actividad de la CK (U/L) = x 268 = 114 0,033 Obtención del factor FACTOR = Ccal A/min Calibrador Actividad de la CK (U/L) = A/min Test x Factor Ejemplo 268 Factor = = ,033 Actividad de la CK (U/L) = 0,014 x 8121 = 114 Calibración. Usar el Calibrador Ref La actividad enzimática de la CK en el calibrador es trazable al Procedimiento Primario de Referencia de la IFCC, y al material de referencia ERM -AD455/IFCC. Calibraciones manuales Obtener el factor de calibración al usar nuevo lote de reactivos o cuando el control interno de la calidad indicar. Sistemas automáticos. Intervalo de calibración Calibración de 2 puntos (blanco y calibrador) al cambiar el lote; Calibración de 2 puntos (blanco y calibrador) cuando el control interno de la calidad indicar. Linealidad El resultado de la medición es lineal hasta 00 U/L Para valores más altos, diluir la muestra con NaCl 150 mmol/l (0,85%), realizar nueva medición y multiplicar el resultado obtenido por el factor de dilución. Control interno de la calidad. El laboratorio debe mantener un programa de control interno de calidad que defina con claridad los reglamentos aplicables, objetivos, procedimientos, criterios para especificaciones de la calidad y límites de tolerancia, acciones correctivas y registro de las actividades. Controles deben ser utilizados para evaluar la imprecisión e desviaciones de calibración. Se sugiere que las especificaciones para el coeficiente de variación máximo y el error 6,7,8 total sean basados en los componentes de la variación biológica (VB). Se sugiere utilizar las preparaciones estabilizadas de la línea Qualitrol - Labtest para el control interno de la calidad en ensayos de química clínica. Intervalo de referencia. Los intervalos deben ser usados sólo como orientación. Se recomienda que cada laboratorio establezca su propio rango de valores de referencia en la población atendida. 0,316-0,381 A/min Calibrador= = 0, Español - Ref.: 117

4 Niños e Adolescentes 9 Adultos Conversión: Unidades Convencionales (U/L) x 0,0167 = Unidades SI ( kat/l). Características del desempeño 10 Estudios de Recuperación. En dos muestras con concentraciones de CK iguales a 328 y 1233 U/L fueron adicionadas cantidades de la enzima, obteniéndose los siguientes resultados: Actividad (U/L) Inicial Edad meses meses meses años años años Mujeres Hombres Adicionada Esperada Encontrada El error sistemático proporcional medio estimado es igual a 0,5 U/L para el nivel de decisión 122 U/L y 1,0 U/L para el nivel de decisión 241 U/L. Estudios de Comparación de Métodos. El método propuesto fue comparado con el método de referencia de la IFCC, obteniéndose los siguientes resultados: Número de muestras Intervalo de concentraciones (U/L) Media de las estimativas (U/L) Ecuación de regresión Coeficiente de correlación Maculino (U/L) Método Comparativo Utilizando la ecuación de regresión, el error sistemático total (bias) estimado es igual a 3,5% para un nivel de decisión igual a 241 U/L y 1,2% para un nivel de decisión igual a 1245 U/L. Estos errores son menores que el error sistemático analítico de la especificación deseable basada en la variación biológica que es 5,8%. Estudios de precisión. Los estudios de precisión fueron realizados en el sistema Labtest/Labmax 240, utilizando muestras con valores de actividad iguales a 122 y 241 U/L , Feminino (U/L) (U/L) (U/L) 5 Recuperación (%) 99,8 99,3 Método Labtest ,6 Método Labtest = 0,996 x Método Comparativo - 6,851 0,999 Repetitividad - Imprecisión intra-ensayo Muestra 1 Muestra 2 Muestra 1 Muestra 2 N N Media Reproducibilidad - Imprecisión total Media DE (U/L) 0,65 1,50 DE (U/L) 1,48 2,53 CV (%) 0,54 0,62 CV (%) 1,22 1,05 Sensibilidad metodológica. Limite de detección: 6,2 U/L. Corresponde a 3 desviaciones estándar obtenidos de una muestra con actividad de CKM igual a 117 U/L. Utilizándose como parámetro la absorbancia mínima detectable, lo limite de detección fotométrica es de 8,1 U/L, correspondiendo a una diferencia de absorbancia igual a 0,001. Efectos de la dilución de la matriz. Dos muestras con valores iguales a 1535 y 1844 U/L fueron utilizadas para evaluar la respuesta del sistema en las diluciones de la matriz con NaCl 150 mmol/l (0,85%). Utilizando factores de dilución que variaron de 2 a 16 se hallaron recuperaciones de entre el 103 y 104%. Significado clínico. La creatina quinasa es un dímero compuesto de subunidades B y M y se presenta en tres formas isoenzimas: MM (Ck3), MB (CK2) y BB (CK1). La enzima se encuentra en altas concentraciones en el músculo esquelético, el músculo cardíaco, el cerebro y el tracto gastrointestinal. Los estudios de distribución tisular indican que el músculo esquelético se compone casi en su totalidad de la isoenzima MM con cantidades mínimas de la isoenzima MB. El cerebro y el tracto gastrointestinal contienen principalmente isoenzima BB, mientras que el músculo del corazón es de aproximadamente 80% de la isoenzima MM y % de la MB. El CK total comienza a subir 6 horas después de la aparición de infarto agudo de miocardio (IAM) y alcanza un máximo después de 12 a 24 horas y mantiene elevada hasta 72 horas cuando no hay un nuevo infarto. Los valores en el pico pueden alcanzar más de 10 veces el límite superior de los valores de referencia. En pacientes sometidos a terapia trombolítica la elevación de CK puede ocurrir antes mediante el aumento de la isoenzima MB en resultado a la reperfusión del miocardio isquémico. En el IAM, CK está elevada en los casos de necrosis del músculo del corazón producida por la miocarditis grave. Las causas de la elevada CK consecuente a la necrosis o atrofia aguda del músculo estriado son: cirugía de tórax o del corazón (los valores vuelven a su nivel dentro de 24 a 48 horas), la cardioversión, distrofia muscular progresiva, la esclerosis amniotrófica, polimiositis, la distrofia miotónica lateral, traumatismos y quemaduras, extensa rabdomiolisis, hipertermia maligna, hipotermia, estado epiléptico, miopatía endocrina (hipotiroidismo, acromegalia, hipoparatiroidismo de miopatía) y de consumo de cocaína. 04 Español - Ref.: 117

5 Observaciones 1. La limpieza y secado adecuados del material utilizado son factores fundamentales para la estabilidad de los reactivos y obtención de resultados correctos. 2. El agua utilizada en el laboratorio debe tener la calidad adecuada a cada aplicación. Por ello, para preparar los reactivos y usarla en las mediciones, debe tener resistividad 1 megaohm o conductividad 1 microsiemens y concentración de silicatos <0,1 mg/l (agua tipo II). Para el enjuague de la vidriería el agua puede ser del tipo III, con resistividad 0,1 megaohms o conductividad 10 microsiemens. En el enjuague final utilizar agua tipo II. Cuando la columna desionizadora está con su capacidad saturada ocurre la producción de agua alcalina con liberación de varios iones, silicatos y sustancias con gran poder de oxidación o reducción que deterioran los reactivos en pocos días o incluso horas, alterando los resultados de modo imprevisible. Por ello, es fundamental establecer un programa de control de la calidad del agua. 3. Varios factores alteran el desempeño del calibrador. De entre estos factores están los errores de reconstitución, homogeneización inadecuada, contaminación del agua o del material de vidrio y almacenamiento incorrecto. Sugerimos el cumplimiento de las buenas prácticas de laboratorio y la verificación de las instrucciones del fabricante del instrumento y de los reactivos utilizados, relacionadas con las limitaciones del procedimiento. 4. Para una revisión de las fuentes fisiopatológicas de interferencia en los resultados y en la metodología se sugiere consultar: < Referências 1. Oliver IT. J Lab Clin Med 1963;62: Sociedad Española de Bioquímica Clínica y Patología Molecular, Base de Datos de Variación Biológica. Disponível em:< (acesso em 04/06). 8. Basques JC. Especificações da Qualidade Analítica. Labtest Diagnóstica Soldin SJ, Brugnara C, Wong EC: Pediatric Reference Intervals, 5.ed. Washington: AACC Press, 05. p Labtest: Dados de Arquivo. Presentación Producto CK-NAC Liquiform Referencia 117-2/30 Están disponibles las aplicaciones para sistemas automáticos y semiautomáticos. El número de ensayos en aplicaciones automáticas, depende de los parámetros de programación. Informaciones al consumidor [Términos y Condiciones de Garantía] Labtest Diagnóstica garantiza el desempeño de este producto dentro de las especificaciones hasta la fecha de expiración indicada en los rótulos siempre que los cuidados de utilización y almacenamiento indicados en los rótulos y en estas instrucciones sean seguidos correctamente. 1 2 Contenido 2 X 24 ml 2 X 6 ml 1 X 1 ml 2. Rosalki SB. J Lab Clin Med 1967;69: The Committee on Enzymes of the Scandinavian Society for Clinical Chemistry. Scand J Clin Lab Invest 1979;39:1. 4. Szasz G, Gruber W, Bernt E. Clin Chem 1976;22: IFCC. Part 2. Reference Procedure for the Measurement of Catalytic Concentration of Creatine Kinase. Clin Chem Lab Med 02; 40 (6): Westgard JO, Barry PL, Hunt MR, Groth T. Clin Chem 1981;27: Labtest Diagnóstica S.A. CNPJ: / Av. Paulo Ferreira da Costa, Vista Alegre - CEP Lagoa Santa. Minas Gerais Brasil - Servicio de Apoyo al Consumidor sac@labtest.com.br Revisión: Mayo, 14 Ref.: Copyright by Labtest Diagnóstica S.A. Reproducción bajo previa autorización 05 Español - Ref.: 117

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