Desarrollo de recursos para estudios genómicos en cítricos: creación de una colección de ESTs y una micromatriz de cdna

Transcripción

1 Desarrollo de recursos para estudios genómicos en cítricos: creación de una colección de ETs y una micromatriz de cdna Proyecto de Genómica Funcional de Cítricos Instituto de Agroquímica y Tecnología de Alimentos IBMCP Instituto de Biología Molecular y Celular de Plantas Instituto Valenciano de Investigaciones Agrarias

2 Objetivos Generales 1. Generación de una colección de ETs representativa del conjunto total de genes expresados por los cítricos. 2. Caracterización del transcriptoma de los cítricos durante el crecimiento, diferenciación y desarrollo vegetativo y reproductivo, y en respuesta a diferentes condiciones de estrés biótico y abiótico, mediante el desarrollo y uso de microarrays de cdna. 3. Desarrollo de herramientas genómicas para la mejora de los cítricos

3 29 genotecas a partir de: Genotecas de cdna estándar construidas Diferentes tejidos y estados de desarrollo Tallos vegetativos e internodos ojas Raíces Ovarios (senescentes) Ovarios (sin polinizar) Ovarios (diferentes zona de abscisión) Inflorescencias y flores Flavedo de frutos en maduración Flavedo de frutos senescentes Frutos enteros Diferentes estreses bióticos Infección por viroide de la Exocortis de los citricos (hojas) Infección por viroide Vd Infección por virus de la tristeza (hojas y tallos) Infección por Phytophthora citrophthora (raíces de variedad sensible) Infección por Phytophthora citrophthora (raíces de variedad resistente) Infección por Penicillium digitatum (frutos) Diferentes estreses abióticos Estrés salino corto (hojas) Estrés salino prolongado (hojas) Estrés hídrico (hojas) Estrés hídrico (raíces) Estrés hídrico y rehidratación (hojas) Estrés hídrico y rehidratación (zona abscisión de hojas) Estrés hídrico y rehidratación (raíces) Deficiencia en hierro (hojas) Deficiencia en hierro (raíces) Almacenamiento en frío (frutos) Tratamiento térmico y almacenamiento en frío (frutos)

4 12 genotecas a partir de: Genotecas enriquecidas en clones de longitud completa y/o normalizadas Diferentes tejidos y estados de desarrollo Ovarios Mezcla de diferentes tejidos Diferentes estreses bióticos Infección por viroide de la Exocortis de los citricos (hojas) Infección por viroide Vd (hojas) Infección por virus de la tristeza (hojas) Infección por virus de la tristeza (brotes) Infección por Phytophthora citrophthora (raíces) Infección por Penicillium digitatum (frutos) Diferentes estreses abióticos Estrés salino e hídrico y deficiencia en hierro (hojas) Estrés salino e hídrico y deficiencia en hierro (raíces) Almacenamiento en frío (frutos) Clones de longitud completa Genotecas estándar 19 % Genotecas enriquecidas en clones de longitud completa 54%

5 ETs obtenidas ecuencias con una media de 500 pares de bases de alta calidad singletons contigs putativos genes únicos (UniGenes) (aprox. la mitad del número estimado de genes en cítricos)

6 Anotación funcional de las secuencias con clasificación MIP (Munich Information Center for Protein equences), KEGG (Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes) y GO (Gene Ontologies) el 32% de los unigenes no poseen proteína similar en Arabidopsis thaliana se han identificado genes de cítricos implicados en todas las categorías funcionales descritas por MIP, y en proporción similar a A. thaliana, indicando una colección de ETs representativa del genoma completo de cítricos Metabolism Transcription Cell cycle and DNA processing Protein fate ignal transduction Protein synthesis Energy Cellular transport and transport mechanisms Regulation of / Interaction with environment Cell fate Control of cellular organization Transport facilitation Development (systemic) Transposable elements and viral proteins torage proteins Tissue differentiation Cell type differentiation Unclassified protein Arabidopsis thaliana Citrus spp. No similar protein 31,9% Unclassified 16,0% Transposable elements and viral proteins 0,2% Development 0,4% tructural components 0,5% Cellular differentiation 0,5% Regulation of / Interaction with environment 1,0% Intracellular transport 1,8% Metabolism 22,3% Protein synthesis and processing 8,7% Defense 1,8% Transcription 6,2% Cell cycle and DNA processing 4,9 ignal transduction 2,7% Energy 1,7% % of unigenes

7 Construcción del primer microarray de cítricos puntos Unigenes (5403 singletons contigs) - 18 genotecas - 35% hojas - 27% flores - 22% raíces -16% flavedo

8 Análisis de la respuesta a estrés hídrico en Citrus spp. (Cinta Gimeno, Ramón errano) Caracterización del transcriptoma en C. clementina injertada sobre C. reshni Estrés hídrico Diseño de referencia 3-4 réplicas biológicas por tiempo 20 hibridaciones 0 h 5 h, 10 h, 24 h Raíces/ojas 5 h, 10 h, 24 h Inducción progresiva Inducción rápida Riego Inducción transitoria Dehidrina Inositol P sintasa Proteína LEA 0h 5h 10h 24h Aumento significativo de genes en la categoría funcional Defensa

9 Análisis de la respuesta a infección por el virus de la Tristeza de los cítricos (Mónica Gandía, José Guerri) GRUPO FUNCIONAL CONTIG OBREEXPREADO GRUPO FUNCIONAL CONTIG OBREEXPREADO GRUPO FUNCIONAL CONTIG OBREEXPREADO A B tress Germin-like protein Miraculin-like protein Metabolis mo Cooper chaperone -adenosyl-lmethionine: salicylic acid carboxyl Control Ribosomal protein 40 ribosomal protein 9 Cytosolic class I small heat-shock protein P1 Lipid transfer protein 40 ribosomal protein 11 Putative Pi starvationinduced protein Lipoxygenase Chlorophyll a/b-binding protein type III precursor Aldehyde dehydrogenase 1 precursor Anthranilate phosphoribosyltransfer ase Ribosomal protein RL5 Experimento con 5 plantas de lima infectadas con el aislado agresivo de CTV T-305 frente a 4 plantas control sanas Cada planta infectada es hibridada frente a un pool de todas las plantas control realizando un marcaje reverso en cada caso 5 réplicas biológicas 10 hibridaciones Transporte Glutathione - transferase GT 14 Dehydrin tress related protein Thioredoxin -type Lethal leaf spot 1-like protein Putative ABC transporter family protein odium/dicarboxylate cotransporter Putative glutathione - transferase T3 ACC oxidase Cooper/zinc superoxide dismutase G-dependent dehydroascorbate reductase 1 Geranyl diphosphate synthase small subunit LYTB-like protein precursor Glutathione - transferase GT 22 istone deacetylase-like protein 40 ribosomal protein ribosomal protein 3A Chlorophyllase 1 60 ribosomal protein L31 Tubulin beta-2 chain 60 acidic ribosomal protein P1 ABC transporter family protein

10 Identificación de genes diferenciales durante el desarrollo vegetativo y genes específicos de tejido Material vegetal y diseño experimental (Laura uertas, José Luis García-Martinez) 2-3 cm cm 1 E1 E5 1 E1 5 E5 Diseño en bucle con doble marcaje 8 micromatrices Confirmación de datos mediante análisis Northern hojas entrenudos E1 E2 E3 E4 E N5 P5 E1 E2 E3 E4 E N5 P5 C01011D02 C C20005D04 C08002D06 C20003D02 C08004D02 rrna rrna E: entrenudos; : ojas; N: Nervios; P: Peciolos.

11 Identificación de genes diferenciales durante fructificación (Raquel Arribas, M.Angel Pérez-Amador) Evolución temporal de frutos +GA 3 4 réplicas biológicas Análisis con referencia común 0-2 At1g70540 Unknown Log 2 Ratio (635/532) AAA-type ATPase Rubisco y CBP Dias +GA3 Ov F1 F2 Ov F1 F2 Cuantificación de los niveles de mrna durante el desarrollo del fruto de 6 genes mediante micromatrices o en geles de RNA C20007E03 C20001C03 C01006G06 C20006G11 C02015B09 C20010B07 EtBr EtBr

12 Identificación de genes diferenciales durante maduración (Manuel Cercós, Manuel Talón) -Diseño de referencia -Réplicas biológicas: 4 por muestra -Identificación de genes diferencialmente expresados mediante análisis de diferencias de medias (p<0.001) 100 -Flavedo: verde frente a breaker GROWT (%) I II III -Pulpa: fase II frente a fase III DAY AFTER ANTEI leucine-rich repeat protein beta-d-xylosidase glycosyl-transferase thioredoxin MajorallergenPruar1 phenylcoumaran benzylic ether reductase lipid-transfer protein glycine-rich protein chalcone synthase 2 peroxidase L-ascorbate oxidase cytochrome P450 cellulose synthase early light induced protein vacuolar processing enzyme acid phosphatase wound-induced basic protein 40 ribosomal protein 16 miraculin-like protein lectin-related protein log 2 ( fase III / Fase II ) log 2 ( breaker / verde )

13 Identificación de genes diferenciales durante almacenamiento en frío en períodos post-cosecha (Carolina Royo, Antonio Granell) Frutos de Clementina de Nules almacenados a 2ºC 0 h d tc 24 9d 14d 28d 56d Tiempo a 2ºC 0días 2, 4, 6 h 24 h 9 d 14 d 28 d 56 d Referencia Referencia común: 0, 2, 4, 6 y 24h, y 9, 14, 28 d. 4 réplicas/ muestra

14 Diferenciación varietal en Clementinas (I) (Gema Ancillo, José Guerri, Luis Navarro) Clemenules 20 Fina ernandina 20 Marisol variedades en el banco de Germoplasma del IVIA Diferencias en tamaño y época de maduración del fruto Invernadero 1 (Avasa-Alcocebre) Invernadero 2 (Vinaroz) Julio de 2003 Octubre de 2003 Julio de 2003

15 Diferenciación varietal en Clementinas (II) Muestras del primer vivero. Julio 2003 Agrupamiento génico supervisado a) Elaboración del modelo (aprendizaje del algoritmo) b) Validación del modelo con muestras ciegas (Gema Ancillo, José Guerri, Luis Navarro) MUETRA PREDICCION MUETRA PREDICCION MUETRA PREDICCION N37 N N37 N 5 N21 N N20 N 21 N20 N21 N 31 N27 N N27 N 32 N33 N N33 N Clemenules/ernandina Clemenules/Marisol Marisol/ernandina Las variedades Nules, Marisol y ernandina pueden ser diferenciadas en base a su perfil de expresión génica utilizando modelos de agrupamiento supervisado.

16 Trabajo en curso Incrementar la colección de ETs - alcanzar unigenes a finales de aumentar la proporción de ETs procedentes de clones de longitud completa - aislar ETs procedentes de genes de muy baja expresión mediante el uso de genotecas normalizadas Caracterizar el transcriptoma de los cítricos usando el microarray de cdna construido - experimentos de análisis del transcriptoma durante la infección por el hongo Phytophthora, en variedades sensibles y tolerantes - experimentos de análisis del transcriptoma durante estrés salino, en variedades sensibles y tolerantes - experimentos de análisis del transcriptoma en condiciones de deficiencia de cloruro (hambre prolongada y hambre más aplicación de cloruro) - experimentos de análisis del transcriptoma durante la infección por viroides (CEVd) Construcción de un microarray de segunda generación - representando un mayor número de genes de cítricos (>15.000) - con selección de los mejores representantes de cada contig - con resecuenciación de una determinada proporción de los clones depositados en el chip

17 Agradecimientos Instituto de Agroquímica y Tecnología de Alimentos Instituto de Biología Molecular y Celular de Plantas Instituto Valenciano de Investigaciones Agrarias

18 Desarrollo de recursos para estudios genómicos en cítricos: creación de una colección de ETs y una micromatriz de cdna Proyecto de Genómica Funcional de Cítricos Instituto de Agroquímica y Tecnología de Alimentos IBMCP Instituto de Biología Molecular y Celular de Plantas Instituto Valenciano de Investigaciones Agrarias