22. Implicancias organolépticas de la fermentación maloláctica

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1 22. Implicancias organolépticas de la fermentación maloláctica Contenidos Bioquímica del proceso... 1 Factores que afectan la fermentación maloláctica... 3 Implicancias organolépticas... 3 Fermentación maloláctica en tanque o en barrica?... 8 Ejercicios recomendados Literatura citada El metabolismo del ácido málico por las bacterias lácticas (BLA) del vino, con la formación de ácido láctico y dióxido de carbono (CO2) es sin duda, luego de la fermentación alcohólica el fenómeno biológico más importante en la elaboración del vino. Mediante este proceso se logra la desacidificación y la estabilidad biológica y en el caso que nos interesa, notables modificaciones en las características sensoriales del vino. Este proceso es indispensable en vinos de regiones frías donde se llega a la cosecha con tenores elevados de ácido málico. En nuestras regiones relativamente cálidas no son elevados los tenores de este ácido, no obstante, y sobre todo en los vinos tintos, se realiza porque estabiliza microbiológicamente al vino (el ácido láctico formado es antiséptico), y por los aportes notables que produce en las características organolépticas del vino (Catania y otros 1994). También es indispensable en la elaboración del Chardonnay en barricas. Parece increíble pero recién en los años 60, con los trabajos de Ribereau-Gayon el fenómeno comienza a ser conocido. Antes de esta época, cuando llegaba la primavera y la fermentación maloláctica (FML) comenzaba, se decía el vino trabaja. La frase de Pasteur las levaduras hacen el vino y las bacterias lo destruyen frenó el desarrollo científico en este tema (Ribereau Gayon y otros 1975). Bioquímica del proceso La así llamada fermentación maloláctica es un proceso (Figura 1) desencadenado por bacterias lácticas y que estaría catalizada por una enzima altamente específica la enzima maloláctica. Esta reacción produce exclusivamente ácido L(+) láctico. El dióxido de carbono (CO2) se desprende en forma de gas creando una efervescencia en el vino. Un gran número de bacterias pueden llevar a 1

2 cabo este proceso. Pertenecen a distintos géneros y se dividen en homofermentarias que atacan solo al ácido málico y heterofermentarias que también atacan las hexosas, con producción de ácido ácetico y ácido D (-) láctico, un isómero diferente al producido por el ataque al ácido málico. Figura 1 Esquema de la fermentación maloláctica. La bacteria deseada en el vino es Oenococcus oeni una bacteria heterofermentaria y que por lo tanto debe actuar en ausencia de azúcar. Es de forma esférica (coco) y puede formar cadenas filamentosas Es preferida por las características organolépticas de los vinos obtenidos. Existen cepas que pueden producir metabolitos secundarios a partir de otros componentes del vino con formación de aromas indeseables; por esta razón se están seleccionando cepas que minimicen este problema. Existen otras BLA que pertenecen a los géneros Lactobacillus, Leuconostoc y Pediococcus que pueden degradar el ácido málico pero en general se consideran indeseables por los metabolitos secundarios originados. Figura 2 Actividades metabólicas primarias de la bacterias lácticas (Adaptado de Bartowsky y Henschke 1995). En la Figura 2 (Bartowsky y 1995) se detallan las principales acciones metabólicas de las diferentes bacterias que pueden producir la FML cuando atacan al ácido cítrico o a los azúcares (hexosas). Se forma como sustrato intermedio el ácido pirúvico y a partir de el se puede formar ácido acético, D (-) láctico, L (+) láctico, etanol, CO2, diacetilo, acetoina y 2-3 butanodiol, todas moléculas de importancia a nivel sensorial. En nuestro país se observó la presencia de lactobacilos al principio de la FML espontánea, aumentando en la conclusión de la misma la presencia de Oenococcus oeni. A partir de ellas se ha realizado una selección adaptada a los vinos de Mendoza (Zorrilla y otros 2002). 2

3 Factores que afectan la fermentación maloláctica Los principales factores que afectan el crecimiento de las bacterias lácticas son la graduación alcohólica, el SO2, el ph y la temperatura. El efecto de cada uno de ellos debe ser considerado en función de nivel de los otros tres. Para lograr que la FML arranque, se debe partir con tenores de SO2 libre que sean lo más bajo posible y se debe llevar el vino a 20 a 22 ºC (temperatura, que se considera óptima). Una vez comenzada la FML, las temperaturas más altas la aceleran y las más bajas la retardan. El alcohol tiene un efecto inhibitorio sobre el desarrollo de las bacterias lácticas y que depende de la temperatura. El óptimo de crecimiento y un menor tiempo de latencia se logra con tenores de 10 a 14 % de alcohol en volumen y temperaturas cercanas 18 ºC ya que, temperaturas mas elevadas aumentan la acción inhibitoria del alcohol (Lonvaud 2004). Esta acción también varía con el tipo de bacterias dado que según Ribéreau-Gayon y otros (1975) en conjunto, los cocos son mas sensibles al etanol que los lactobacilos y con 13% de alcohol el 50% de los lactobacilos resisten y solo el 14% de los cocos. El ph es muy importante. En el rango de ph del vino (de 3,00 a 4,00), mientras el ph es más elevado mas adecuado es para el crecimiento bacteriano. A ph bajos se dificulta la FML, pero Oenococcus sp. es mas tolerante a la acidez y por ello la selección exclusiva de las especies de Oenococcus oeni se limita a las condiciones de ph ya que a ph elevados si bien Pediococcus sp. predomina también hay otras bacterias lácticas (Lonvaud 2004). Según Ribéreau-Gayon y otros (1975) a ph mas bajos las BLA consumen preferentemente el ácido málico y a ph más elevados las preferencias es por los azúcares, con producción elevada de ácido acético. Pero por supuesto varía con las cepas de bacterias. El oxígeno también es necesario, aunque muy pequeña cantidad, pues las bacterias lácticas son microerófilas y cuando la aireación del vino es excesiva puede provocar el ataque al ácido tartárico (enfermedad de la tourne ). Pequeñas cantidades de azúcares son necesarias como fuente de energía para las bacterias (0, 2 a 1g.L -1 ). Igualmente son exigentes en nutrientes y necesitan nitrógeno amoniacal y aminoácidos. Las levadura también puede tener un efecto ya sea retardante o estimulante de la FML (Larsen y otros 2003). Algunos pesticidas también tienen un efecto inhibitorio como el los derivados de cobre y el dichlofuanid (Vidal 2001). Por todo ello para lograr una buena FML con el mínimo de desvíos, se deben cuidar los fungidas aplicados, la madurez de la uva, la acidez del vino (muchas veces se impone una acidificación con ácido tartárico), debe haber poco SO2 libre y los azúcares deben estar agotados. Por último, en el caso de que se efectúe una siembra, se debe elegir una buena cepa de Oenococcus sp. Implicancias organolépticas Además de la disminución de la acidez, de la producción de acido láctico y la producción de dióxido de carbono la FML produce otros cambios sensoriales en el vino por la acción las bacterias a otros sustratos.nosotros acá consideraremos los cambios positivos que se logran cuando la FML ha sido bien manejada. Ellos varían mucho en función de la cepa de bacteria láctica y del manejo de la misma y la bibliografía cita una gran cantidad de descriptores aromáticos que aparecen en determinadas circunstancias no bien dilucidadas. Pueden aumentar algunos atributos y disminuir otros dependiendo de la cepa de Oenococcus oeni utilizada. Así Henick-Kling y otros (1993) y Henick-Kling y Acreed (1998) encontraron que el descriptor más común que apareció en la FML fue el mantecoso, mientras que el aumento de los descriptores cuerpo, quemado, citrus, frutal y sudor fue menos intenso. Catania y Avagnina 1998 trabajando con diferentes cepas de Oenococcus oeni encontraron una disminución de la sensación ácida, de los gustos amargos y de los aromas herbáceos en las 6 cepas ensayadas y un aumento den la sensación floral-frutal, mantecosa y miel. (Tabla 1). En la 3

4 Figura 3 se grafican los cambios producidos por las cepas C1 y C2 en los descriptores que mas cambiaron. Se nota una disminución de la acidez, del gusto amargo y de los aromas herbáceos mientras que existe un aumento de aromas frutales, untuosidad, manteca y miel. Tabla 1 Principales descriptores aromáticos de vinos Chardonnay fermentados con diferentes cepas de bacterias lácticas (C1 a C6 = diferentes cepas de bacterias lácticas) (Catania y Avagnina 1998). C1 C2 C3 C4 C5 C6 Testigo sin FML Fruta seca 0,3 (1) ,6 0 0 Herbáceo 0,4 0,2 0,8 0,9 1 2,2 1,5 Frutal 1,5 1,1 0,9 0,8 0,6 1,4 0,7 Floral 1,8 0,15 0,15 0,35 0,25 0,3 0,25 Ácidez mordiente 0,6 0,5 0,8 1,1 1,7 2,6 3,3 Ácidez láctica 3 2,4 1,3 1,1 0,3 1 0 Manteca 2,1 2 1,4 0,8 0,5 0,6 0 Amargo 0,4 0,4 0,5 0 0,9 0,9 2,2 Miel 0,6 0,1 0 0,1 0 0,4 0 Untuosidad 2,4 1,7 1 0,7 0,5 0,5 0,3 Aceitunas verdes fermentadas 0 0,1 0,3 0,4 0,3 0 0,2 (1) Intensidad de la sensación en una escala de 1 a 5. 4

5 untuoso miel herbáceo 3,5 3 2,5 2 1,5 1 0,5 0 floral-frutal acidez mordiente amargo manteca C1 C2 Testigo Figura 3 Descriptores aromáticos de vinos Chardonnay fermentados con diferentes cepas de Oenococcus oeni y un testigo sin fermentación maloláctica (Adaptado de Catania y Avagnina1998). Intensidad de la sensación en una escala de 1 a 5. Analizaremos ahora algunos cambios que se consideran usuales en la FML. Disminución de la acidez. Teóricamente 134 g de ácido málico producen 90 g de ácido láctico y 44 g de dióxido de carbono. A los efectos prácticos podemos decir que 2 g.l -1 de ácido málico produce la caída de un 1 g.l -1 de acidez total expresada en ácido tartárico. El ácido málico es agresivo de gusto acervo, mientras que el láctico es mucho más suave, transmitiendo esta suavidad al vino. Mejora del volumen y redondez de boca La mejora en la sensación de volumen y la redondez de boca del vino se logra no solo por la disminución de la acidez, sino porque las proteasas y glucanasas aceleran la autólisis de las levaduras presentes cediendo manoproteínas al vino (Lonvaud 2004). Disminución de los aromas herbáceos y de la sensación amarga En general es un hecho comprobado que la FML con Oenococcus oeni produce una disminución de los aromas herbáceos, hecho que se manifiesta sobre todo en vinos tintos, aunque no es conocida la vía por la cual se produce este fenómeno ya sea que actúa sobre las metoxipiracinas o sobre los aldehídos (Trioli 1988). Este hecho es interesante para realzar el carácter frutal de los vinos a veces enmascarado por los aromas herbáceos. La disminución de los amargos que muchas veces aparece en vinos con FML no está explicada, pero indudablemente la disminución de la acidez debe influir ya que la acidez y la sensación amarga se potencian mutuamente. Liberación de aromas a partir moléculas aromáticas glicosidas (G.G.) Ugliano y Moio (2006) encontraron que las cepas de Oenococcus oeni pueden liberar aromas a partir de precursores glicosídicos dependiendo la cantidad liberada de la cepa utilizada. Disminución los compuestos carbonílicos El etanal (acetaldehído) es un importante componente del vino. Pero cuando está en exceso imparte al vino un característico olor a manzana verde u hoja molida (posee un umbral de 5

6 percepción olfativa de 100 mg.l -1 ) (Shinohara 1984). Normalmente la cantidad de etanal disminuye durante la FML siendo metabolizado por las bacterias lácticas aunque no esta claro por que vía (Hood 1983). Disminución del color. La fermentación maloláctica provoca una disminución apreciable de la intensidad colorante del vino tinto. Esta disminución se debe al efecto del aumento de ph que ocurre durante este proceso. Si bien la concentración de antocianos es la misma que en el vino sin FML, el estado de ionizacion es diferente (Paladino y otros 2004). Formación de diacetilo (gusto a manteca) Figura 4 El diacetilo responsable de las notas mantecosas. El olor a mantequilla o a butterscotches (que sería el descriptor de un dulce de manteca o por acá llamado caramelo de dulce de leche) es el descriptor más asociado a la fermentación maloláctica. Aparece por el metabolismo del ácido cítrico por las bacterias lácticas (este es el camino que sigue (Oenoccocus oeni) (Figura 5). También puede provenir del ataque de bacterias lácticas homofermentarias sobre los azúcares (Bartowsky y Henschke 1995). Figura 5 Metabolismo del ácido cítrico por la bacteria Oenococcus oeni. La cantidad de diacetilo normalmente presente en los vinos varía de 0,1 a 2,3 mg.l -1 (Fornachon y otros 1965). La cantidad producida varía mucho. Se considera que desde el punto de vista organoléptico el óptimo de diacetilo ronde alrededor de los 1 a 4 mg.l -1. En general se considera 6

7 un defecto cantidades mayores de 5 a 7 m.l -1 por excesivo gusto mantecoso (Ranking y otros 1969). El umbral de percepción olfativa varía según sean vinos blancos como el Chardonnay (alrededor de 0,2 mg.l -1 ) o tintos (alrededor de 2,8 mg.l -1 ) y por supuesto es modificado por otros componentes del vino (Martinau y otros 1995).Vemos que se percibe más en los blancos que en los tintos. La formación del diacetilo y su degradación posterior está muy ligado al desarrollo de las bacterias lácticas y al metabolismo de los azúcares, del ácido cítrico y del ácido málico (Figura 6) Se observa que la producción de este compuesto pasa por un máximo y luego disminuye cuando ya el ácido cítrico y el ácido málico ha sido metabolizado (Shimazu y otros 1985). Log 10CFU/mL. Diacetilo (mg/l) Log10 CFU/mL Diacetilo Acido malico Acido cítrico Días después de la inoculación con bacterias lácticas 3 2,5 2 1,5 1 0,5 0 Acido málico&acido cítrico( g/l) Figura 6 Desarrollo de la fermentación maloláctica en vinos Cabernet Sauvignon por la cepa de Bacteria Viniflora oenos y formacion de diacetilo ( Adaptado de Shimazu y otros 1985). CFU= unidades de bacterias formadoras de colonias. El diacetilo formado, posteriormente se reduce y disminuye, pasando a acetoína y 2,3-butanediol (Figura 5) con umbrales de percepción olfativa elevada y por ello sin importancia a nivel aromático en el caso del vino. El dióxido de azufre (SO2) combina al diacetilo lo vuelve sensorialmente inactivo pero es una reacción reversible y exotérmica volviendo a aparecer cuando este disminuye.debido a la naturaleza exotérmica de esta reacción cuando el vino se sirve a mayor temperatura la percepción es mayor. Situaciones de anaerobiosis contribuyen a disminuir el nivel de diacetilo en el vino. Es por ello que la separación de las borras (antioxidantes enérgicos) permite que quede más cantidad en el vino (Nielsen y Richelieu 1999 citado por Bartowsky y Henschke 2000). En la bibliografía sobre le tema se citan numerosas causas que podrían influir sobre la cantidad de diacetilo. Resumimos en la Tabla 2 (adaptado de Martineau y otros 1995) algunos factores que pueden tener efecto sobre la concentración de diacetilo y por ende en su percepción sensorial. Tabla 2 Factores que pueden afectar el contenido de diacetilo en los vinos (Adaptado de Martineau y otros Citado por Bartowsky y Henschke 2000). 7

8 Cepa de bacteria utilizada Cantidad de bacterias La temperatura El ph El ácido cítrico Acido málico Cantidad de azúcar presente El SO2. Contacto con el aire Contacto con las borras de levaduras Según la cepa utilizada puede variar la cantidad de diacetilo producido. Menores cantidades de bacterias (10 4 vs 10 6 ) favorecen la formación de diacetilo Comparando una fermentación maloláctica a 18 ºC versus otra a 28 ºC la formación de diacetilo es mayor a 28 ºC El ph más bajo podría favorecer la formación de diacetilo Con más ácido cítrico se produce más diacetilo. Pero atención, también produce algo de acético Con más málico se forma más diacetilo inicialmente Con mayor cantidad de azúcares residuales se podría disminuir la cantidad de diacetilo Dado que el SO2 se combina con los carbonilos, podría combinar el diacetilo y volverlo sensorialmente inactivo. Con mucho SO2 podríamos no oler el diacetilo. Pero es una reacción reversible y reaparece cuando el SO2 disminuye Una pequeña aireación durante la fermentación maloláctica puede aumentar el diacetilo al favorecer la oxidación del ά-acetolactato en diacetilo Sacharomyces cerevisae puede producir diacetilo y también degradarlo. Por lo tanto dejar mucho tiempo el vino con las borras podría disminuir la cantidad El manejo de los efectos secundarios no deseados de la FML Las bacterias lácticas pueden producir anormalidades organolépticas al atacar otros sustratos. Este tema lo veremos en defectos del vino. Fermentación maloláctica en tanque o en barrica? En los años 60 del siglo pasado la llegada de los tanques de acero inoxidable y de las piletas de cemento con resinas epoxídicas y también una notable mejora en la higiene y en el uso del SO2 permitió separar netamente la etapa de fermentación alcohólica, de la fermentación maloláctica y de la crianza. Fue así como se pudo volver a la práctica de la FML en barrica, que por otra parte no había sido nunca abandonada por los productores de la Borgoña en Francia. Los vitivinicultores de esta región observaban mejores condiciones para vinos de largo tiempo en botella, cuando la FML ocurría en barricas. Actualmente esta práctica está muy difundida y con ella se elaboran los grandes vinos del mundo (Vivas 1994). La comparación organoléptica de vinos tintos obtenidos con la fermentación maloláctica en tanques o en barrica es generalmente a favor de estos últimos. Los vinos aparecen en la degustación más suaves, más viscosos, amplios, con notables diferencias aromáticas, mejor 8

9 estructurados, envejeciendo mejor y con menor intensidad en la sequedad que aparece en los primeros meses de conservación en barricas (Vivas y otros 1994). Diversos trabajos experimentales se han realizado para dar un fundamento científico a estas aseveraciones. Ducruet 1997 (Figura 7) encontró que las bacterias se desarrollan más rápido en tanques que en barricas nuevas y que sin embargo la FML termina un poco más rápidamente en las cubas. Los taninos son menos astringentes (índice de gelatina) y menos condensados (índice DMACH). El color es más estable por tener una mayor combinación entre taninos y antocianas. En la degustación los vinos aparecen más suaves y menos agresivos. Log. del número de bacterias viables/ml barrica tanque tiempo en días luego de la fermentación alcohólica Figura 7 Influencia del tipo de recipiente sobre la cantidad de bacterias lácticas indígenas presentes durante la fermentación maloláctica (Adaptado de Ducruet 1997). Uno de los trabajos más completos fue realizado por Vivas y otros (1994). Dicha experiencia mostró resultados muy interesantes que detallamos a continuación. En tanque la población de BL alcanza mayor magnitud teniendo una más rápida fase estacionaria pero la población disminuye más rápidamente que en barrica (en recipientes de idénticos volumen). Esto confirmó la experiencia de Ducruet (1997).No hay diferencias en cuanto a acidez volátil, ph y azúcares reductores. En barricas aumenta notablemente las antocianas combinadas a taninos (mayor índice de pvpp), aumenta el IPT (índice de polifenoles totales), disminuye la astringencia (menor índice de gelatina) y aumenta el grado de condensación de los taninos (aumento del índice de ClH). En barricas hay un aumento muy marcado de los polisacáridos (PS) combinados (son los PS que ceden las barricas) y también de los PS libres aunque menos marcado (que son los que ceden las levaduras y bacterias). En cuanto a la influencia sobre la calidad general de los vinos, en la mayoría de los casos los vinos con FML en barricas son preferidos a los de tanque y las preferencias se mantienen a los largo del tiempo (2 a 3 años en botellas). Al análisis descriptivo los vinos aparecen mas coloreados, a veces más oscuros, con taninos más suaves, más viscosos y amplios, con buen equilibrio entre los aromas de la madera y los del vino madera conformando un bouquet armonioso de Revel y otros (2005) encontraron mayor contenido de compuestos volátiles como la oak-lactona, eugenol y vainillina cuando la FML ocurría en barricas. Es decir que hay una mayor extracción de sustancias aromáticas. Esto se confirma con el punto de vista de los enólogos que afirman cuando se realiza la FML en barricas estas duran menos de 5 años es decir se agotan mas rápidamente. Una nota aromática típica de los vinos con FML en barrica es el olor a torrado que recuerda al café tostado siendo la molécula odorante responsable el 2-metilfuranotiol con un umbral de percepción olfativa de 5 ng.l -1 en vinos tintos y cuyo origen se debería a la acción de las BLA 9

10 sobre los furanos de la madera. Cuando el vino ya terminó la FML y se ha agregado SO2 su formación se debería a su combinación con el SO2 en medio reductor. Disminuye con los trasiegos y aumenta con el agregado de SO2 (Tominaga y otros 2000 y Dubourdieu y Tominaga 2004). En nuestro país la mayor parte de las veces la FML se realiza en tanques pero se está imponiendo la costumbre de realizarla en barrica con argumentos similares. Resta efectuar una experimentación local para hablar con más certeza sobre este proceso. Ejercicios recomendados Degustar vinos blancos y tintos antes y después de la fermentación maloláctica. Degustar vinos tintos con fermentación maloláctica en barricas y en tanques. Literatura citada Bartowsky E.J., P.A. Henschke Malolactic fermentation and wine flavor. The Australian Grapegrower&Winemaker. Annual Tecnical Issue: Bartowsky, E.J., P.A. Henschke Management of maloláctic fermentation for the "buttery" diacetyl flavour in wine. The Australian Grapegrower Winemaker: Catania C.D., S.Avagnina de del Monte Fermentación Maloláctica. Revista UVA. nro 50: Catania C.D., S. Avagnina de del Monte Inoculo di preparati commerciali di batteri lattici ed effetti sulle caratteristiche del vini. Vignevini nro 7/8: de Revel, G., A. Bloem, M. Augustin, M.A. Lonvaud-Funel, A. Bertrand Interaction of Oenococcus oeni and oak wood compounds. Food Microbiology 22: Dubourdieu, D.T., Tominaga Evolución del aroma tostado de los vinos tintos a lo largo de su crianza en toneles. Enología. Revista Técnica paa la industria vitivinícola. Año I: Ducruet J Incidence du mode de logement lors de la fermentation malolactique sur la qualité des vins rouges. J. Sci. Tech.Tonnellerie. nro 3: Fornachon, J.C.M., B. Lloyd Bacterial production of diacetyl and acetoin in wine. J. Sci. Food 16: Henick-Kling T, T.E. Acree. B. Gavitt, S.A. Krieger y M.H Laurent Sensory aspects of malolactic fermentation. C.S.Stockley, R.S. Johnston,. P.A. Leske, T H. Lee. eds. Proceedings of the eigth Australian wine industry technical conference: Henick-Kling T., T.E. Acree Modification of wine flavor by malolactic fermentation.la fermentazione malolattica: conoscenze attuali e prospettive. Convegno internazionale aprile. Provincia de Verona. Italia. Hood, A Inhibition of grow of wine lactic acid bacteria by acetaldehide-bound sulphur dioxide. Aust. Grapegrower Winemake nro 232: Larsen, J.T., J.C. Nielsen,.B. Kramp, M. Richelieu, P. Bjerring, M.J. Riisager, N. Arneborg,.C.G. Edwards Impact of Different Strains of Saccharomyces cerevisiae on Malolactic Fermentation by Oenococcus oeni. Am. J. Enol. Vitic. 54: Lonvaud, A Bacterias lácticas y fermentación maloláctica. El vino y su industria.nro 5: Martineau, B., T. Henick-Kling, T. Acree Reassessment of the Influence of Maloláctic Fermentation on the Concentration of Diacetyl in Wines. Am. J. Enol. Vitic. 46: Nielsen, J.C., M. Richelieu Control of flavor developement in wine during anf after malolactic fermentation by Oenococcus oeni. Appl. Environ. Microbiol. 65: Rankine, B.C., J. Fornachon, D.A. Bridson Diacetyl in Australian dry red wines and its significance in wine quality. Vitis 8: Ribéreau-Gayon, J., E. Peynaud., P. Ribéreau-Gayon, P. Sudreau IN Traité d OEnologie. Sciences et Technique du vin. Vol.2. Dunod.Paris. Paladino, S., H. Galiotti, J.C. Formento Efecto de la fermentación maloláctica sobre el color de los vinos tintos. El vino y su industria. Año 3: Shimazu, Y., M. Uehara, M. Watanabe Transformation of citric acid to acetic acid, acetoin and diacetyl by winemaking lactic acid bacteria. Agric. Biol. Chem. 49:

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