Determinación de Tetrahidrocannabinol y Cocaína en muestras de sangre seca. Su posible aplicación en el tráfico rodado

Transcripción

1 Determinación de Tetrahidrocannabinol y Cocaína en muestras de sangre seca. Su posible aplicación en el tráfico rodado Grupo de investigación Servicio de Toxicología Forense Instituto of Ciencias Forenses Universidad of Santiago de Compostela Prof. Manuel López-Rivadulla Catedrático de Toxicología

2 MARCO LEGAL Real Decreto Legislativo 6/2015, de 30 de octubre, por el que se aprueba el texto refundido de la Ley sobre Tráfico, Circulación de Vehículos a Motor y Seguridad Vial Artículo 14Bebidas alcohólicas y drogas 1. No puede circular por las vías objeto de esta ley el conductor de cualquier vehículo con tasas de alcohol superiores a las que reglamentariamente se determine. Tampoco puede hacerlo el conductor de cualquier vehículo con presencia de drogas en el organismo, de las que se excluyen aquellas sustancias que se utilicen bajo prescripción facultativa y con una finalidad terapéutica, siempre que se esté en condiciones de utilizar el vehículo conforme a la obligación de diligencia, precaución y no distracción establecida en el artículo El conductor de unvehículoestáobligadoasometersealaspruebasparaladeteccióndealcohol o de la presencia de drogas en el organismo, que se practicarán por los agentes de la autoridad encargados de la vigilancia del tráfico en el ejercicio de las funciones que tienen encomendadas. Igualmente quedan obligados los demás usuarios de la vía cuando se hallen implicados en un accidente de tráfico o hayan cometido una infracción conforme a lo tipificado en esta ley. 3. Las pruebas para la detección de alcohol consistirán en la verificación del aire espirado mediante dispositivos autorizados, y para la detección de la presencia de drogas en el organismo, en una prueba salival mediante un dispositivo autorizado y en un posterior análisis de una muestra salival en cantidad suficiente. No obstante, cuando existan razones justificadas que impidan realizar estas pruebas, se podrá ordenar el reconocimiento médico del sujeto o la realización de los análisis clínicos que los facultativos del centro sanitario al que sea trasladado estimen más adecuados. 4. El procedimiento, las condiciones y los términos en que se realizarán las pruebas para la detección de alcohol o de drogas se determinarán reglamentariamente. 5. A efectos de contraste, a petición del interesado, se podrán repetir las pruebas para la detección de alcohol o de drogas, que consistirán preferentemente en análisis de sangre, salvo causas excepcionales debidamente justificadas. Cuando la prueba de contraste arroje un resultado positivo será abonada por el interesado.

3 MARCO LEGAL CONTROLES DE DROGAS ILICITAS EN SALIVA CON DISPOSITIVOS INDICIARIOS Obligación de obtener una segunda muestra de saliva que confirme el resultado del test. Sanción penal Sanción administrativa Bajo influencia Tolerancia cero

4 MARCO LEGAL POSIBILIDAD DE QUE EL CONDUCTOR PUEDA REALIZAR UNA PRUEBA DE CONTRASTE EN SANGRE Vía penal Vía administrativa Bajo influencia Tolerancia cero

5 LA INTERPRETACIÓN DE LOS VALORES CUANTITATIVOS EN LA SALIVA ES COMPLICADA Gran variabilidad del producto en el mercado Gran variabilidad en la respuesta de los consumidores Consumidores habituales Consumidores esporádicos LA TOXICOLOGIA A DIA DE HOY NO TIENE UNA RESPUESTA CLARA A ESTE PROBLEMA

6 LA INTERPRETACIÓN DE LOS VALORES CUANTITATIVOS EN LA SALIVA ES COMPLICADA Menor importancia en la vía administrativa Presencia de drogas en el organismo Importante en la vía penal Bajo Influencia

7 PREVALENCIA DEL USO DE DROGAS EN CONDUCTORES ESULTADOS PROYECTO DRUID (

8 Estudio de prevalencia en España, Principales Resultados Total Sexo Rango edad Total (N=3302) Hombre (N=2690) Mujer (N=612) años (N=708) años (N=1144) años (N=995) > 50 años (N=414) Porcentaje de casos positivos en sustancias/agrupaciones de sustancias THC Cocaína Benzodiacepinas Anfetaminas Opiáceos Medicamentos (codeína, metadona) 7,69 3,51 1,60 0,21 0,45 0,41 9,11 4,09 1,64 0,19 0,56 0,00 1,47 0,98 1,47 0,33 0,00 0,33 15,11 3,53 0,28 0,57 0,00 0,00 9,35 4,55 0,70 0,17 0,52 0,26 3,62 3,62 2,21 0,00 0,80 0,70 0,24 0,72 4,83 0,00 0,00 0,00 Opiáceos Ilícitos

9 MARCO LEGAL POSIBILIDAD DE QUE EL CONDUCTOR PUEDA REALIZAR UNA PRUEBA DE CONTRASTE EN SANGRE Requiere que la persona que lo solicite acuda a un Centro hospitalario Problemas: Transcurre un tiempo entre el hecho acaecido y la llegada al hospital Se producen los fenómenos de biotransformación en el organismo, que contribuyen a eliminar las sustancias a las que se ha estado expuesto, o convertirlas en otras. Puede desaparecer la sustancia, o puede transformase en otra

10 SANGRE Por qué se utiliza como muestra biológica? La concentración de la sustancia analizada se correlaciona con el efecto producido Corta ventana de detección, informa de consumo reciente INCONVENIENTES: Adición de conservantes Composición compleja Técnica invasiva

11 Gotas secas de sangre (DBS) Muestras de sangre recogidas mediante punción capilar sobre una tarjeta. VENTAJAS: Toma de muestras sencilla y no invasiva Fácil transporte y almacenamiento Mayor estabilidad Menor riesgo biológico Obtención inmediata

12 Gotas secas de sangre (DBS)

13 Aplicaciones de las DBS Metabolopatías Estudios farmacocinéticos y farmacodinámicos Monitorización terapéutica de fármacos ANÁLISIS TOXICOLÓGICO Tratamientos de deshabituación Detección de drogas en el trabajo Controles en carretera

14 Objetivos El desarrollo y validación de un método analítico para la determinación de Δ 9 -tetrahidrocannabinol (THC), cannabidiol (CBD) y cannabinol (CBN) en gotas secas de sangre mediante cromatografía líquida asociada a espectrometría de masas en tándem(lc-ms/ms). El desarrollo y validación de un método analítico para la determinación de Cocaína y sus metabolitos en gotas secas de sangre mediante cromatografía líquida asociada a espectrometría de masas en tándem(lc-ms/ms).

15 Preparación de la muestra Adición de 50 µl de sangre en DMS card Agilent Bond Elut Se dejan secar 24h a Tª ambiente (20-25 ºC) Extracción

16 Extracción EXTRACCIÓN Cortamos la gota seca y se añaden: 2 ml metanol:nh4oh (95:5) + 25 μl PI a 0,1 ng/ml Agitación horizontal durante 30 min a 280 rpm Recogida del eluyente EVAPORACIÓN En corriente de N 2 a 35ºC. CROMATOGRAFÍA Inyección de 35 µl en el LC-MS/MS CENTRIFUGACIÓN 10 min 4500 rpm RECONSTITUCIÓN 75 μl Ácido Fórmico 0,1%: Acetonitrilo (90:10)

17 Condiciones de la cromatografía líquida Atlantis T3 3 µm 2,1x50 mm (Waters), 35 C Tiempo (min) %Ácido fórmico 0,1% en agua % ACN Flujo (ml/min) , , , , , , ,3

18 Condiciones de la espectrometría de masas Quattro Micro API ESCI (Waters) Electrospray en modo positivo (ESI+) Parámetro Voltaje del capilar Temperatura de la fuente Temperatura del gas de desolvatación Flujo del gas de desolvatación Flujo del gas del cono Valor 5,00 kv 150ºC 400ºC 800 L/h 60 L/h

19 Cocaína Límite de cuantificación (LOQ) Concentración más baja del analito que se puede cuantificar con adecuada impresión (%CV 20%) y exactitud (80-120%), y con relación S/N 10 Se estudiaron 5 replicados al valor mas bajo de la recta 1 ng/ml

20 Aplicación a casos reales Se analizaron 7 muestras reales, previamente positivas a cocaína y metabolitos Cocaína (ng/ml) BE(ng/mL) Cocaetileno(ng/mL) Casos Sangre total DBS Sangre total DBS Sangre total DBS ,5 195, ,6 40,3 959,3 1103,1-43,5 3 2, , , ,6 1120, ,4 16, ,9 105,7-0

21 1400 Relación concentración BE R² = 0,9926 DBS (ng/ml) Sangre total (ng/ml)

22 THC Límite de cuantificación (LOQ) Concentración más baja del analito que se puede cuantificar con adecuada impresión (%CV 20%) y exactitud (80-120%), y con relación S/N 10 Se estudiaron 5 replicados al valor mas bajo de la recta 50 ng/ml

23 Aplicación a casos reales El método se aplicó a 9 muestras reales positivas recogidas entre 2013 y Muestra Sangre total (ng/ml) 1 1,2 Resultado: No se obtuvo ningún resultado positivo en ninguna de las muestras reales analizadas. 2 2,8 3 1,1 4 2, ,8 8 10,2 9 15,7

24 Conclusiones Se ha desarrollado un método analítico para la determinación cocaína y dos de sus metabolitos en muestras de sangre obtenidas por DBS y posterior análisis mediante cromatografía líquida acoplada a espectrometría de masas. Siguiendo los criterios establecidos, el método ha sido satisfactoriamente validado, demostrando ser un método sensible (LOQ = 1ng/mL) y específico., Su utilidad en los casos reales también fue demostrada, pues las concentraciones encontradas mediante las DBS fueron muy similares a las determinadas empleando métodos rutinarios para el análisis de muestras biológicas de sangre total. El método analítico propuesto para la determinación de cocaína y metabolitos mediante DBS ofrece una alternativa claramente aceptable y con unos resultados prometedores.

25 Conclusiones Se ha desarrollado un método analítico para la determinación TETRAHIDROCANNABINOL, CBN Y CBD, en muestras de sangre obtenidas por DBS y posterior análisis mediante cromatografía líquida acoplada a espectrometría de masas. Siguiendo los criterios establecidos, el método ha sido satisfactoriamente validado, demostrando ser un método específico pero poco sensible (LOQ = 50ng/mL) Por esta razón no hemos podido comprobar su efectividad, aunque con nuevos equipos más sensibles podría lograrse.

26 PREVISONES DE FUTURO IMPLEMENTAR MARCO JURIDICO QUE PERMITA LA OBTENCIÓN DE LAS MUESTRAS DE SANGRE SECA. La voluntariedad del solicitante La rapidez en su obtención que evite la desaparición de la droga. SUGERIR, CON CRITERIOS TOXICOLOGICOS LOS VALORES DE UNOS NIVELES EN SANGRE, QUE ESTEN CLARAMENTE RELACIONADOS CON LA INFLUENCIA (VÍA PENAL). MANTENER EL CRITERIO DE TOLERANCIA CERO PARA LA VIA ADMINISTRATIVA, HOMOGENEIZANDO LOS VALORES DE CUTOFF DE LOS DISPOSITIVOS SALIVARES UTILIZADOS.

27 Gracias por su atención!