Procedimientos para el tratamiento de datos de RMN empleando el programa NMRNotebook para usuarios internos del Instituto de Química.
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- Alfonso Contreras Acuña
- hace 7 años
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1 Procedimientos para el tratamiento de datos de RMN empleando el programa NMRNotebook para usuarios internos del Instituto de Química. Procedimientos Generales 11 de noviembre de 2010 Los datos de estos equipos quedarán incluidos en una carpeta con el mismo número de registro con el que se anotaron en la Bitácora de Registro de Recepción de muestras del Laboratorio de RMN. Dentro de cada carpeta vendrán subcarpetas que contienen los resultados de los diferentes espectros que se adquirieron para la muestra (por ejemplo, carpetas 1H, 13C, cosy, hetcor). En las carpetas que corresponden a cada experimento, vienen los datos generados por el equipo en forma de varios archivos (acqu, acqu2, fid, etc. También se incluye una carpeta llamada pdata). Para abrir los resultados de resonancia, en el programa NMRNotebook, abrir el archivo fid para espectros unidimensionales (1H, 13C, dept) en Varian y Bruker o bidimensionales (cosy, hetcor, hmqc, hmbc, etc) en Varian y el archivo ser para espectros bidimensionales en equipos Bruker. Este procedimiento abre los datos del FID del experimento y los despliega (señal de decaimiento de la inducción como función del tiempo, unidimensional o bidimensional). Para todos los espectros de equipos Bruker y los unidimensionales de Varian, para transformar los datos al dominio de frecuencias es suficiente con hacer click en el botón con la imagen de engranes que se encuentra en el menú superior. Este procedimiento genera directamente el espectro unidimiensional o bidimensional en el dominio de frecuencias. Nótese que este procedimiento utiliza parámetros automatizados de apodización y ajuste de fase. Dichos ajustes pueden afinarse previamente o posteriormente a la transformación. Para otros equipos puede ser necesario hacer algunos ajustes a los parámetros del programa antes de hacer la transformación. Estos ajustes (espectros Varian bidimensionales o Jeol) se indican en párrafos posteriores de este documento. Para espectros bidimensionales, la manera de colocar los espectros unidimensionales en los respectivos ejes horizontal y vertical, es necesario en primer lugar abrir los FIDs correspondientes y transformarlos al dominio de frecuencias (por ejemplo un 1H para cosy o un 1H y un 13C (o dept) para hsqc, hmbc, etc.). Nótese que para agregar estos espectros a una sesión es necesario indicar la opción add data del menú file en lugar de la opción open que iniciaría una nueva sesión. Una vez que se tienen listos los espectros unidimensionales, para asociarlos a los ejes vertical u horizontal es necesario ir
2 a la zona de la escala respectiva (vertical u horizontal), dar un click derecho y elegir la opción choose trace, indicando el espectro unidimensional que se desea quede asociado a cada uno de los ejes. En algunos casos será necesario referenciar los espectros, tanto unidimensionales como bidimensionales (asociar un valor de desplazamiento químico a algún pico en los espectros). Para referenciar un pico, es suficiente con indicar el pico con el cursor, hacer un click derecho e indicar la opción reference para indicar el valor de desplazamiento químico (en una o dos dimensiones respectivamente) que se desea asociar al pico que se seleccionó. En el menú que aparece al indicar la opción reference se puede indicar que se trata de algún pico conocido del disolvente o la substancia de referencia (TMS), o bien, es posible indicar el valor del desplazamiento, indicando el valor numérico que corresponda. Casos en los que es necesario hacer ajustes: -Espectros COSY de equipos Varian: Puede ser necesario cambiar a Fourier Transform Algorithm de F1 axis: Phase Modulation con el siguiente procedimiento: Hacer clic en el triángulo que está a la derecha del ícono de los engranes, clic en Spectral Analysis, seleccionar en Fourier Transform Algorithm: Phase Modulation, dar clic en apply. -En el caso de los espectros cosy y noesy de equipos Varian: Es necesario simetrizar una vez que se ha transformado el espectro, con el siguiente procedimiento: en el menú principal, hacer clic en Process, 2D Symmetrization, compute, validate. -Espectros Hetcor de equipo Varian300: Puede ser necesario cambiar a Fourier Transform Algorithm de F1 axis: Phase Modulation. -Espectros HSQC de equipo Varian500: Puede ser necesario indicar Echo/Antiecho en FID preparation e indicar Reverse Spectrum en Fourier Transform Algorithm de F1 axis. -Espectros HMBC de equipo Varian500: Puede ser necesario cambiar a Fourier Transform Algorithm de F1 axis: Phase Modulation. -Espectros NOESY de equipo Varian500: Puede ser necesario indicar Reverse Spectrum para F1 en Spectral Analysis, y Phase Sensitive Spectrum (algo: apmin2d) en Post Processing. -Espectros de equipos Jeol, 1 H, 13 C, dept: Puede ser necesario el siguiente ajuste: En Spectral Analysis, indicar Reverse Spectral Axis e indicar en Post Processing, Phase Correction: Phase Sensitive Spectrum, algorithm: apmin. Para espectros bidimensionales adquiridos en el equipo Jeol, únicamente hay la posibilidad de trabajarlos con el software de Delta, proporcionado gratuitamente por Jeol en su página de internet.
3 Para la presentación final de los espectros. Espectro de Protón (Hidrógeno-1). -Fase: Hacer clic en el 7 ícono (Aplicar fase manual), colocar el cursor en la señal que se va a modificar; en el recuadro de la izquierda, seleccionar corse o fine y mover en orden cero, sin soltar el botón izquierdo del mouse y después en orden 1, al final hacer clic en validate. -Frecuencias: Hacer clic en el 8 ícono de Display PeaK Table Listing, en la ventana de la izquierda seleccionar Add Peak o Delete Peak por zona o individual, sobre el espectro seleccionar la zona y hacer clic dentro de ella, al final hacer clic en validate. -Integrales: Si el espectro aparece con integrales, borrar las no deseadas (por ejemplo las del disolvente), hacer clic derecho sobre la integral y seleccionar delete. Para las demás integrales, ajustar primero la extensión de las mismas, haciendo clic izquierdo al principio o final de la integral por debajo de la línea del espectro y moviendo la flecha horizontal de doble sentido a la izquierda o a la derecha sin soltar el botón izquierdo del mouse. Para corregir la fase de la integral, hacer clic derecho sobre la integral, seleccionar en el menú Show Correction, hacer clic izquierdo sobre el punto en la base del espectro, al principio o al final de la integral (aparece una flecha vertical de doble sentido), mover hacia arriba o hacia abajo sin soltar el botón izquierdo del mouse. Al final desactivar Show Correction. Para la intensidad de las integrales poner la manita sobre una de ellas y con el botón central del mouse, ajustar la altura deseada. Para normalizar, hacer clic derecho sobre una de las integrales, en el menú desplegado seleccionar reference, establecer el valor requerido y dar enter. -Texto: Sobre el espectro hacer clic derecho, del menú seleccionar Add note, aparece la indicación de la nota, sobre ella, hacer clic derecho, seleccionar Property y en Label escribir el texto deseado, por último seleccionar el color del texto en la misma ventana en Text color y hacer clic en OK. -Impresión: Hacer clic en el ícono Preview a la izquierda del ícono de la impresora. En el menú de la ventana que se despliega, hacer clic en Page format, seleccionar carta y horizontal, hacer clic en Aceptar. En Composant no palomear ninguna opción. En Spectrum palomear las siguientes opciones: Custom, X Axis, Peaks, Integrals, Annotations, Only current View. En la misma ventana hacer clic en more, ajustar el grueso de la línea de la gráfica en line spectrum width, dando un valor de 0.7 y ajustar el tamaño de la escala en Police size con un valor de 1, dar OK y mandar la impresión o bien exportar la imagen obtenida a algún formato gráfico (jpeg, png, etc.) y editar el archivo gráfico para borrar los letreros no deseados de la imagen. Espectro de Carbono-13
4 -Fase: igual que protón. -Correccion de la línea base: Si es necesario corregir la línea base, haciendo clic en el menú principal en Process, Baseline correction, en la parte inferior de la ventana Display, palomear la opción Base line y hacer clic en la línea base del espectro sobre los diferentes valles y crestas de la curva para ajustarla a una línea recta; al palomear la opción Spectrum Result en display nos permite ver el ajuste; cuando se considera que éste ya es adecuado, hacer clic en validate. -Escala en ppm: En los espectros obtenidos con los equipos Varian puede ser necesario transformar las unidades de la escala a ppm, no así en los que provienen de los equipos Bruker. Para transformar la escala hacer clic derecho sobre el espectro, seleccionar Display parameter en Axis seleccionar ppm, clic en OK. -Referencia: Igual que en protón. -Frecuencias: Igual que en protón. -Posición del espectro: Ajustar la separación del espectro y su escala (mínima separación), con la manita sobre la escala vertical. -Escala vertical: Para ocultar la escala vetical, hacer clic derecho sobre el espectro y seleccionar la opción Display parameter, en Axis desactivar la opción intensity, hacer clic en Apply y después en OK. Texto: Una vez que se seleccionó la zona que se va a imprimir, escribir el texto igual que en Hidrógeno-1. Impresión: Igual que en Hidrógeno-1. Espectro DEPT de 135 : -Fase: igual que en protón, respetando las señales negativas. -Referenciar: igual que en protón, seleccionando una señal con desplazamiento conocido previamente por el espectro de 13 C. -Frecuencias: Igual que en protón, teniendo cuidado de indicar todas las frecuencias. -Posición del espectro: subir la línea del espectro a una altura media en la pantalla con la manita sobre la escala vertical.
5 Espectro DEPT de 90 : Abrir el espectro, hacer fase y referenciar con la misma señal que en el dept de 135, ocultar frecuencias. En el dept de 135, hacer clic derecho sobre el espectro, seleccionar superimpose y palomear la opción del espectro correspondiente al dept de 90 ya trabajado previamente. El dept de 90 aparece sobre la misma hoja que el de 135. Al espectro de 90 se le da una posición tal que quede en la base de la hoja, cerca de la escala, moviéndolo verticalmente con la manita sobre el punto que aparece al extremo izquierdo del mismo. Si es necesario ajustar la escala del dept de 90, haciendo clic izquierdo sobre el nombre que lo identifica y con la manita sobre el espectro sobreponer las escalas (desactivar la opción mostrar escala, volviendo a hacer clic sobre el nombre del espectro). Seleccionar el color del espectro haciendo clic derecho sobre el nombre que lo identifica (de preferencia usar color negro). -Texto: Igual que en protón. -Impresión: Igual que en protón. Espectro COSY (Una vez simetrizado y referenciado). -Ajustar color de los contornos: Sobre el espectro hacer clic derecho, seleccionar Display, Color, black and white, llevar a 0 las escalas de color y dar OK. -Seleccionar zona de interés: En el menú principal, seleccionar Display, Define Region, colocar los mismos valores en los ejes X y Y. -Tamaño de las proyecciones: Situarse sobre la proyección y hacer clic derecho, llevar el valor de trace size a 16 % aproximadamente, hacer clic sobre el espectro. La intensidad de las señales, ajustarlas con el botón central del mouse. -Texto: Igual que en protón. -Impresión: En Preview todas las opciones igual que en protón, sólo agregar Trace y Y Axis. Los otros espectros en 2D se trabajan de manera similar al cosy pero no se simetrizan y no se ponen los mismos valores en los ejes X y Y al seleccionar la zona de interés.
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