MICROPROPAGACIÓN DESINFECCIÓN DE LOS EXPLANTES

Transcripción

1 MICRPRPAGACIÓN DESINFECCIÓN DE LS EXPLANTES Cm se muestra en la Guía 80: Micrprpagación en el labratri educacinal, un de ls pass más crítics en las técnicas de cultiv in vitr es la desinfección de ls explantes, que cmienza cn un buen lavad cn agua y jabón detergente. Una vez que el explante está bien limpi, se prcede a la desinfección cn agentes químics. Ls más ecnómics y fáciles de usar sn el alchl 70º y el hipclrit de sdi, vendid cmercialmente cm agua sanitaria en Brasil, lavandina en Argentina, y agua jan en Chile y trs países latinamericans. Una inmersión de 1 a 2 minuts en alchl 70º permite eliminar burbujas de aire y dislver la capa epicuticular de ls explantes, per n garantiza la esterilización del explante. Esa es la función del agua sanitaria. En muchs países la cncentración del principi activ (NaCl) del agua sanitaria es del 5%, y ls prtcls crrespndientes recmiendan utilizar dilucines de 10 a 20 % (v/v). En Brasil, dnde la legislación determina que la cncentración del principi activ (NaCl) del agua sanitaria sea del 1,5 a 2%, la dilución equivalente para la desinfección del explante se encuentra entre el 25 y 50%. Nstrs preferims fijar en 50% la cncentración de la slución desinfectante del agua sanitaria y mdificar el tiemp de inmersión en función del tip de explante. Cm medida adicinal, la slución desinfectante se prepara en un frasc estéril. Vale la pena destacar que una desinfección externa bien realizada n elimina las cntaminacines internas, que pueden aparecer días más tarde del sembrad del explante. Una vez desinfectad el explante, se retira el hipclrit mediante tres lavads sucesivs cn agua destilada estéril. La duración de ls lavads es de 1, 3 y 5 minuts, pudiend en el últim lavad permanecer pr más tiemp. Para el lavad existen ds técnicas, cuya elección depende del tamañ y del númer de explantes a esterilizar. La primera cnsiste en retirar el material y transferirl a ls recipientes cn agua destilada estéril, un prcedimient práctic si el númer de explantes es pequeñ (Figura 1). La segunda es abrir ligeramente el frasc para descartar el líquid, desechand el cntenid en una pileta en un balde de descarte (Figura 2). Antes y después de este prcedimient, se recmienda limpiar cuidadsamente la tapa y el exterir del frasc de alchl. Esta última es nuestra preferida. Si fuera necesari crtar el material eliminar las partes quemadas pr el hipclrit de sdi, prever la esterilización de ls instruments y de una caja de Petri cnteniend una hja de papel talla dnde se realizará la disección.

2 MICRPRPAGACIÓN / DESINFECCIÓN DE LS EXPLANTES Figura 1. Técnica para desinfectar ls explantes. A. Material Pinza Tres recipientes placas de Petri cn agua destilada estéril Recipiente cn slución desinfectante Explantes B. Prcedimient Primer lavad (1 minut) Segund lavad (3 minuts) Tercer lavad (5 minuts) Explantes limpis

3 MICRPRPAGACIÓN / DESINFECCIÓN DE LS EXPLANTES Figura 2. tra técnica para desinfectar ls explantes. A - Material Frasc estéril para la slución desinfectante 3 frascs cn agua destilada estéril Recipiente de descarte Explantes bservación: Durante el prcedimient, limpiar cuidadsamente ls brdes de la tapa y el exterir de ls frascs cn alchl antes de transferir ls líquids. Esta medida reduce ntablemente el númer de cntaminacines B Prcedimient Esterilizar ls explantes en la slución de agua sanitaria, descartar el líquid y agregar agua destilada estéril para el primer lavad.

4 MICRPRPAGACIÓN / DESINFECCIÓN DE LS EXPLANTES Primer lavad (1 minut) agregar agua destilada estéril para el segund lavad Segund lavad (3 minuts) agregar agua destilada estéril para el tercer lavad Tercer lavad (5 minuts) invertir el frasc para que ls explantes queden en la tapa Ls explantes están lists para el sembrad.

5 MICRPRPAGACIÓN / DESINFECCIÓN DE LS EXPLANTES NUESTR CMENTARI La preparación de numerss frascs de agua destilada estéril cnsume much tiemp, de md que prbams reemplazarla en ls lavads pr una slución de Clr-in 10 (Diclr iscianurat de sdi NaDCC), un prduct que se vende en ls cmercis lcales para desinfectar utensilis y legumbres, en la cncentración y tiemp indicads pr el fabricante. El Clr-in puede prepararse en el mment y n precisa enjuague. El mayr incnveniente es que el material queda un pc pegajs y es puede dificultar la transferencia de ls explantes cn la pinza a ls tubs de ensay. En función de nuestra experiencia, vale la pena destacar que ls ensays de reinfección de explantes sól cn Clr-in 10, sin utilizar agua sanitaria, sól dan resultads aceptables cuand el medi de cultiv n cntiene sacarsa. Para reducir las cntaminacines bacterianas y fúngicas, alguns autres recmiendan agregar NaDCC Nipagin (metilparaben) al medi de cultiv ya esterilizad. Sin embarg, n encntrams infrmación clara sbre las cncentracines utilizadas y preferims prbar el us de dichs prducts en el lavad de ls explantes.