IDENTIFICACIÓN COPROLÓGICA, HISTOLÓGICA Y MOLECULAR DE CYSTOISOSPORA BELLI EN PACIENTES INFECTADOS CON EL VIRUS DE LA INMUNODEFICIENCIA HUMANA

Transcripción

1 IDENTIFICACIÓN COPROLÓGICA, HISTOLÓGICA Y MOLECULAR DE CYSTOISOSPORA BELLI EN PACIENTES INFECTADOS CON EL VIRUS DE LA INMUNODEFICIENCIA HUMANA Astudillo Osvaldo Germán, Velásquez Jorge Néstor 2, di Risio Cecilia 3, Etchart Cristina 3, Chertcoff Agustín Víctor 2, Perissé Gladys Elisabet 3, Carnevale Silvana,4. Instituto Nacional de Enfermedades Infecciosas - ANLIS Dr. Carlos G. Malbrán. Avenida Vélez Sarsfield 563, (CP 28) Ciudad de Buenos Aires, Argentina 2 Hospital Municipal de Infecciosas Dr. Francisco Javier Muñiz. Uspallata 2272, (CP 282) Ciudad de Buenos Aires, Argentina 3 Hospital Municipal General de Agudos Dr. José María Penna. Pedro Chutro 3380, (CP 437) Ciudad de Buenos Aires, Argentina 4 Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas (CONICET). Avenida Rivadavia 97, (CP 033), Ciudad de Buenos Aires, Argentina parasitologia@anlis.gov.ar Teléfono: (0)

2 RESUMEN La infección con Cystoisospora belli causa diarrea severa, compromiso de vías biliares y diseminación extraintestinal en pacientes con síndrome de inmunodeficiencia adquirida (SIDA). Este estudio incluyó ocho pacientes adultos con SIDA y diarrea crónica diagnosticándose cistoisosporosis en heces (ooquistes) y/o biopsias duodenales (estadíos asexuales y sexuales en epitelio). Se realizó la identificación a nivel molecular mediante una técnica de nested-pcr que amplifica un fragmento del gen de la subunidad pequeña del ARN ribosomal, empleando ADN extraído de heces y biopsias. Los amplicones fueron purificados y se efectuó la secuenciación automática de los mismos siendo en los 8 casos idénticos a los disponibles para C. belli en GenBank. Este trabajo nos permitió realizar el diagnóstico de cistoisosporosis mediante análisis coproparasitológico e histológico, optimizar el protocolo de extracción de ADN a partir de muestras fecales y tisulares e implementar la técnica de nested-pcr para diagnóstico de Cystoisospora belli en muestras biológicas de pacientes infectados. Palabras clave: Cystoisospora belli, PCR, SIDA, ooquiste. 2

3 INTRODUCCIÓN La cistoisosporosis es una infección cosmopolita en distribución, pero es más común en el trópico, zonas subtropicales, algunas áreas del Este medio, Sudeste asiático y Sur de América (). Los estudios de prevalencia muestran que estas infecciones pueden ir desde el % hasta 8%, mientras que en pacientes con SIDA la prevalencia está entre el % y el 5% en países industrializados y 5% en países no industrializados. La severidad de la enfermedad es variable según la edad y el estado inmunológico de los pacientes. La infección con Cystoisospora belli (C. belli)causa diarrea autolimitada en pacientes inmunocompetentes, mientras que puede llegar a ser severa y debilitante en los pacientes inmunocomprometidos (2, 3). Se ha reportado que puede causar también colecistitis (4 6), y en pacientes con SIDA diseminación extraintestinal (7 - ). El diagnóstico de cistoisosporosis se realiza en general por el hallazgo de ooquistes en el examen de materia fecal y de diferentes estadíos en epitelio del intestino delgado o conductos biliares (3, 6, 2). El diagnóstico de C. belli mediante técnicas moleculares ha tenido un desarrollo mínimo. Hasta el presente se ha reportado el uso de un par de primers específicos y una sonda de hibridación complementaria a una región de la subunidad pequeña del ARN ribosomal para la detección mediante PCR y Southern blot en muestras de pacientes infectados (3). También existen publicaciones de métodos moleculares para la diferenciación a nivel de especie de en el género Cystoisospora (4). Los objetivos de este trabajo fueron describir morfológicamente los estadíos de Cystoisospora sp. en fluidos y tejidos de pacientes con SIDA e implementar una técnica de PCR utilizando ADN de C. belli extraído de muestras biológicas de pacientes infectados. 3

4 MATERIALES Y MÉTODOS Se incluyeron ocho pacientes adultos con SIDA y diarrea crónica (más de un mes de duración) en los que se diagnosticó cistoisosporosis. Descripción morfológica en fluídos y tejidos La materia fecal se procesó mediante los métodos de concentración de Telemann modificado, Willis y Sheather (5-7) y se realizaron extendidos de dichos concentrados que se colorearon con la técnica de Kinyoun (8, 9). A cada paciente se le efectuó una videoesofagogastroduodenoscopía (VEDA) con un equipo Pentax EPM Se tomaron biopsias de la porción distal del duodeno. Dos muestras se fijaron en formalina 0% para su procesamiento por técnicas histológicas de rutina y coloración con hematoxilina-eosina y dos muestras se fijaron en glutaraldehido tamponado, se incluyeron en polibedaraldita y se realizaron cortes ultrafinos coloreados con Azur II. Una de las muestras de biopsia se conservó en solución fisiológica a 20ºC para su posterior estudio molecular. Nested PCR para Cystoisospora belli Las muestras de heces y biopsias fueron procesadas para la extracción de ADN, se aplicaron métodos estándar de digestión con proteinasa K, extracción con fenol-cloroformo y precipitación en etanol. Las muestras de biopsias fueron tripsinizadas antes de la extracción de ADN. El tampón de lisis empleado para ambos materiales contenía Tris-HCl 00 mm ph 8, EDTA 0 mm ph 8, SDS 0.5%, NaCl 50mM, y proteinasa K 200 g/ml. Las muestras de ADN obtenidas fueron empleadas en la amplificación génica para el diagnóstico de Cystoisospora de acuerdo al protocolo descripto por Müller y col. (3). Basado en una técnica de nested-pcr utilizando cebadores (primers) sobre la secuencia del gen de la subunidad pequeña del ARN ribosomal de C. belli (GenBank accession nos. AF06935 and U94787). 4

5 El grupo de cebadores del primer ciclo fue IsoFO/IsoRO y para el segundo ciclo IsoFI/IsoRI, descriptos por Müller y col. (3) empleados para amplificar un fragmento de 396 pares de bases (pb). Las mezclas de reacción fueron optimizadas utilizando tampón conteniendo sulfato de amonio. Los pasos de amplificación fueron los descritos previamente (3). Como control positivo de las reacciones de amplificación se empleó ADN de ooquistes previamente purificados, como control negativo se emplearon muestras de ADN humano y se contó con un control de reacción para descartar la posibilidad de ADN contaminante en cada reacción de amplificación. Los productos de amplificación se visualizaron mediante electroforesis en geles de agarosa 2% teñidos con bromuro de etidio bajo luz UV. Los amplicones de cada paciente fueron recuperados de los geles de agarosa y se efectuó la secuenciación automática de los mismos en equipo Applied Biosystems. 5

6 RESULTADOS En el examen coproparasitológico fue posible la identificación de ooquistes de Cystoisospora. Los mismos se presentaban con su característica forma elíptica, de m de largo x 0-9 m de ancho aproximadamente y con un esporoblasto en su interior (fig.). El esporoblasto presentaba un aspecto granular, el interior del ooquiste era transparente y con una doble pared fácil de observar. Figura. Ooquiste no esporulado de Cystoisospora belli en el pellet de concentración del método de Telemann modificado (aumento 400X). La recuperación fue posible mediante los tres métodos de concentración empleados. La visualización en las concentraciones por flotación permitió una tonalidad más rosada que la observada en la centrifugación. Las características tintoriales de la C. belli en los extendidos coloreados con Kinyoun mostraron un esporoblasto de rojo a fucsia, con el interior del ooquiste transparente y la doble pared (fig. 2). 6

7 Figura 2. Ooquiste inmaduro de de Cystoisospora belli coloreado por la técnica de Kinyoun (aumento 000X). En el epitelio duodenal, las células parasitadas se encontraron deformadas, con sus núcleos desplazados o poco visibles, y los estadíos intracelulares de Cystoisospora se disponían en distintas ubicaciones dentro de la misma. Los merozoítos correspondieron a elementos con forma de banana u ovales, con núcleos con cariosomas visibles y algunos gránulos esparcidos en el citoplasma. Los esquizontes, dependiendo de la incidencia del corte, presentaban forma oval o redondeada con dos o más merozoitos (fig 3). 7

8 Figura 3. Corte ultrafino de biopsia duodenal mostrando esquizonte de Cystoisospora belli con merozoítos en su interior. Coloración Azur II (aumento 000X). Los macrogametocitos maduros eran de forma oval con un núcleo grande que contenía un cariosoma prominente. El citoplasma presentaba granulaciones esféricas que se visualizaban claras y oscuras (fig. 4 y 5). Figura 4. Biopsia duodenal mostrando macrogametos de Cystoisospora belli. Coloración Hematoxilina-eosina (aumento 400X). 8

9 Figura 5. Corte ultrafino de biopsia duodenal donde se observa macrogameto de Cystoisospora belli. Coloración Azur II (aumento 000X). Los microgametocitos maduros se visualizaron como estructuras redondeadas con un cuerpo residual rodeado de microgametas. Estas últimas tenían forma bacilar y su número era extremadamente grande (fig. 6). Figura 6. Microgametocito de Cystoisospora belli visualizado en corte ultrafino de biopsia duodenal coloreada con Azur II (aumento 000X). 9

10 En los ocho casos estudiados fue posible la amplificación del fragmento esperado de 396 pb (fig. 7). La secuencia de los fragmentos producidos del gen 8S en los 8 casos fueron idénticos con aquéllos reportados para C. belli. Figura 7. Electroforesis en gel de agarosa teñido con bromuro de etidio, donde se visualizan productos de amplificación de 396 pb. Calle M, marcador 00 bp ladder; calles a 8, muestras de pacientes, calle 9, control positivo; calle 0, control negativo; calle, mezcla de reacción. 0

11 DISCUSION C. belli es un protozoario perteneciente al phylum Apicomplexa, clase Coccidia, orden Eucoccidiorida, suborden Eimeriorina, familia Sarcocystidae (3, 20). La infección se adquiere por la ingestión de ooquistes esporulados que se desenquistan en el intestino delgado liberando los esporozoítos que penetran en las células epiteliales. Allí se produce la multiplicación asexual (merogonia o esporogonia) y sexual (gametogonia), dando origen a la formación de ooquistes que son eliminados con las heces (8, 20, 2). El estudio de materia fecal debe ser el procedimiento inicial, no invasivo, en la búsqueda de C. belli, teniendo en cuenta que durante la fase de multiplicación asexual el examen coproparasitológico no es adecuado. El conocimiento de las diferentes técnicas de concentración y/o coloración permite elegir, según sus características y los recursos disponibles, el método apropiado para cada centro de diagnóstico (22). La VEDA con toma de las biopsias duodenales es otro método que posibilita diagnóstico específico (23-25). El examen histológico de cortes ultrafinos coloreados con azur II permite visualizar los distintos estadíos del ciclo de C. belli en el citoplasma de las células epiteliales (26). El conocimiento y la correcta identificación de estas estructuras es imprescindible pues el hallazgo de cualquiera de ellas es diagnóstico de cistoisosporosis (27). La indicación de la VEDA está sujeta a variables tales como el estado general del paciente, contraindicaciones, y disponibilidad de recursos, que pueden limitar su utilización. El estudio sistemático del duodeno con la toma de biopsias debe ser considerado el procedimiento invasivo a tener presente en aquellos casos de diarrea crónica en que no se llega al diagnóstico y es necesario descartar cistososporosis (24, 25). Este trabajo nos permitió además optimizar el protocolo de extracción de ADN a partir de muestras fecales y tisulares e implementar la técnica de nested-pcr para diagnóstico de C. belli en material biológico de pacientes infectados con virus de la inmunodeficiencia humana.

12 La aplicación de diferentes técnicas de diagnóstico etiológico y molecular para la identificación parasitaria en pacientes con SIDA mejora el pronóstico ya que posibilita la administración de tratamientos específicos (4). 2

13 REFERENCIAS. Lindsay DS, Dubey JP, Blagburn L. Biology of Isospora spp. from humans, nonhuman primates and domestic animals. Clin Microbiol Rev 997; 0: Brandborg LL, Glodberg SB, Breidenbach WC. Human coccidiosis - a possible cause of malabsorption: the life cycle in small-bowell mucosal biopsies as a diagnostic feature. N Engl J Med 970; 283: Trier JS, Moxey PC, Schimmel EM, Robles E. Chronic intestinal coccidiosis in man: intestinal morphology and response to treatment. Gastroenterology 974; 66: Pape JW, Verdier RI, Johnson WD. Treatment and prophylaxis of Isospora belli infection in patients with the acquired immunodeficiency syndrome. N Engl J Med 989; 320: Curry A, Smith HV. Emerging pathogens: Isospora, Cyclospora and microsporidia. Parasitology 998; 7: Benator DA, French AL, Beaudet LM, Levy CS, Orenstein JM. Acalculous cholecystitis associated with Isospora belli in a patient with AIDS. Ann Intern Med 994; 2: Restrepo C, Macher AM, Radany EH. Disseminated extraintestinal isosporiasis in a patient with acquired immune deficiency syndrome. Am J Clin Pathol 987; 87: Comin CE, Santucci M. Submicroscopic prolife of Isospora belli enteritis in a patient with acquired immune deficiency syndrome. Ultrastuct Pathol 994; 8: Michiels JF, Hofman P, Bernard E, St.Paul MC, Boissy C, Mondain V, LeFichoux Y, Loubiere R. Intestinal and extraintestinal Isospora belli infection in an AIDS patient. Pathol Res Practice 994; 90: Velásquez JN, Carnevale S, Mariano M, Kuo LH, Caballero A, Chertcoff A, Ibáñez C, Bozzini JP. Isosporosis and unizoite tissue cysts in patients with acquired immune deficiency síndrome. Hum Pathol 200; 32:

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