Utility of VITEK system for bacterial identification and antimicrobial susceptibility testing isolated from surface waters reservoirs.

Transcripción

1 Utilidad del sistema VITEK en la identificación y determinación de la susceptibilidad antimicrobiana de bacterias aisladas de ecosistemas dulceacuícolas. Utility of VITEK system for bacterial identification and antimicrobial susceptibility testing isolated from surface waters reservoirs. Beatriz Romeu a, Paloma Salazar b, Armando Navarro b, Daysi Lugo a, Ulises Hernández b, Nidia Rojas a and Carlos Eslava b. a Departamento de Microbiología y Virología, Facultad de Biología, Universidad de La Habana, Cuba. bromeu@fbio.uh.cu b Departamento de Salud Pública, Facultad de Medicina, Universidad Nacional Autónoma de México.

2 Utilidad del sistema VITEK en la identificación y determinación de la susceptibilidad antimicrobiana de bacterias aisladas de ecosistemas dulceacuícolas. RESUMEN Durante la última década se han desarrollado sistemas automatizados y semiautomatizados que permiten obtener resultados rápidos (2-7 h) comparado con el tiempo que habitualmente demoran los métodos tradicionales. El sistema automatizado VITEK se emplea para la identificación y el estudio de susceptibilidad antimicrobiana de bacterias clínicamente significativas aisladas de procesos infecciosos u otras fuentes como alimentos y agua. En el presente estudio se evaluó la utilidad de este sistema para la identificación de 92 aislamientos bacterianos provenientes de ecosistemas dulceacuícolas contaminados de la Ciudad de La Habana, en los cuales también se enfrentaron e 15 antibióticos para determinar su respuesta frente a ellos. Los resultados obtenidos con el sistema VITEK se compararon con los obtenidos con el sistema API20E, en el caso de la identificación.el 100 % de los aislamientos fueron identificados hasta el nivel de especie con el sistema VITEK. Del total, el 94 % (87 cepas) correspondieron con la especie Escherichia coli, el 5 % (4 cepas) con la especie Citrobacter freundii y el 1 % (1 cepa) con Lec. adecarboxy. El empleo de las tarjetas GNS-147 para bacilos Gram negativos permitió que cada cepa se enfrentara a 15 antibióticos de manera simultánea. El tiempo promedio para obtener resultados de sensibilidad antimicrobiana fue de 5 h. El uso del sistema automatizado VITEK permitió la obtención de resultados de forma temprana que contribuyeron a la caracterización integral de estos aislados ambientales. Palabras clave: VITEK, identificación, Escherichia coli, susceptibilidad antimicrobiana. ABSTRACT During the last decade automated and semi-automatic systems have been developed that allow to with time obtain fast results (2-7 h) compared that habitually delay the traditional methods. Automated system VITEK is used for the identification and the study of antimicrobial susceptibility of clinically significant bacteria isolated of infectious processes or other sources like foods and water.in the present study the utility of this system was evaluated for the identification of 92 originating bacterial isolations of contaminated surface waters ecosystems of the Havana City, in which also 15 antibiotics faced and to determine their answer in front of them. The results obtained with system VITEK were compared with the obtained ones with system API20E, in the case of the identification.the 100% of the isolations were identified until the level of species with system VITEK. Of the total, 94% (87 strains) corresponded with the specie Escherichia coli, 5% (4 strains) with Citrobacter freundii and 1% (1 strain) with Leclercia adecarboxy. The use of cards GNS-147 for negative Gram bacilli allowed that each stock faced 15 antibiotics of simultaneous way. The time average to obtain results of antimicrobial sensitivity was 5 hour.the use of automated system VITEK allowed the obtaining of results of early form that contributed to the integral characterization of these environmental isolating. Keywords: VITEK, identification, Escherichia coli, antimicrobial susceptibility. INTRODUCCIÓN La identificación de bacterias patógenas aisladas de procesos infecciosos u otras fuentes como alimentos y agua y los resultados de susceptibilidad in vitro constituyen herramientas fundamentales para un manejo eficiente de estos microorganismos. Por tanto el empleo de métodos rápidos y automatizados en microbiología se hace cada vez más frecuente. Estos métodos requieren un tiempo reducido para la obtención de los 1

3 resultados en comparación con los métodos convencionales, son fáciles de usar, precisos y en muchos casos económicamente rentables teniendo en cuenta la relación costo/beneficio. Durante la última década se han desarrollado aparatos automatizados y semiautomatizados que permiten obtener resultados de identificación bacteriana y de sensibilidad en un período que oscila entre 2 y 7 h comparado a las h que habitualmente demoran los métodos tradicionales 1. La rapidez en el diagnóstico y el tratamiento reduce la morbi-mortalidad así como la propagación de la infección lo que se traduce en beneficios para el paciente, cuando se trata de muestras de origen clínico. A su vez, en el área medioambiental el empleo de instrumentos automatizados permite también al laboratorio de microbiología obtener resultados de identificación y antibiograma reproducibles, con rapidez y precisión, ajustándose a guías internacionales actualizadas. El sistema VITEK es un sistema automatizado de identificación bacteriana y estudio de sensibilidad antimicrobiana. La identificación de las bacterias se basa en la inoculación de una suspensión de microorganismos en tarjetas con determinados paneles de reacciones bioquímicas. La sensibilidad antimicrobiana se lleva a cabo en forma similar a través de tarjetas que contienen diluciones estandarizadas de distintos antibióticos correspondientes a los puntos de corte de sensibilidad establecidos por NCCLS 1. Este sistema se ha empleado para el estudio de cepas clínicamente significativas aisladas de muestras clínicas u otras fuentes como alimentos y agua. Teniendo en cuenta lo planteado los objetivos del presente trabajo fueron: 1. Evaluar la utilidad del sistema VITEK en la identificación y determinación de la susceptibilidad antimicrobiana de bacterias aisladas de ecosistemas dulceacuícolas. 2. Comparar los resultados obtenidos utilizando el sistema VITEK con los obtenidos por API 20E para la identificación bacteriana. 3. Comparar los tiempos de demora en la obtención de los resultados utilizando ambas metodologías, tanto para la identificación bacteriana como para la determinación de susceptibilidad antimicrobiana. MATERIALES Y MÉTODOS Muestras empleadas En el presente estudio se evaluaron 92 cepas aisladas de muestras de agua de tres ecosistemas dulceacuícolas contaminados de Ciudad de La Habana. Las cepas se aislaron en el período comprendido entre febrero de 2008 y junio de 2009 empleando agar Chromocult para coliformes (Merck). Se aislaron colonias de la especie E. coli. ( por ser las de mayor interés para el trabajo) y se consideraron como colonias de esta especie aquellas que presentaron una coloración azul oscuro ó violeta en el medio agar Chromocult para coliformes. Identificación bacteriana La identificación se realizó a través de los sistemas API20E (biomérieux) 2 inoculada de acuerdo a las especificidades del fabricante y el sistema automatizado VITEK (biomérioux), empleando tarjetas GNI (por sus siglas en inglés, Gram Negative Identification) para este último. En el caso del sistema API la lectura de las tiras se realizó de forma manual y su interpretación se realizó empleando el sofware apiweb,

4 Sensibilidad antimicrobiana En los estudios de sensibilidad se empleó el sistema VITEK (biomérioux) y se usaron las tarjetas GNS-147 para bacilos Gram negativos. El procedimiento empleado fue el siguiente: se tomó una asada de cultivo fresco que se resuspendió en 1.8 ml de solución salina estéril (0.45%) para obtener una concentración correspondiente al tubo 1 en la escala de Mac Farland, para esto se utilizó un nefelómetro. Se hidrataron los pozos con 100 µl de la suspensión del microorganismo equivalente a 1x10 6 ufc/ml, incubándolos a 37 C. Los antibióticos probados fueron: ampicilina, amikacina, aztreonan, cefazolina, cefepima, ceftazidima, ceftriazona, ciprofloxacina, ertapenen, gentamicina, imipenen, levofloxacina, nitrofurantoina, piperacilina/tazobactan y trimetropin/sulfametoxazol. Los resultados de susceptibilidad y resistencia así como los de identificación realizados por el sistema VITEK fueron interpretados por el sistema experto del VITEK. Los resultados obtenidos en la identificación con los dos sistemas comerciales empleados se compararon entre sí. Se compararon los tiempos de demora en la emisión de los resultados de identificación y sensibilidad obtenidos por ambos métodos. El tiempo de demora se definió como el tiempo necesario, en horas, para emitir un informe de los resultados de identificación y sensibilidad antimicrobiana. RESULTADOS Y DISCUSIÓN Las bacterias coliformes constituyen un grupo heterogéneo de amplia diversidad en términos de género y especie. Todas ellas pertenecen a la familia Enterobacteriaceae. La mayoría de las definiciones de bacterias coliformes están basadas en sus características bioquímicas comunes. El grupo coliforme abarca los géneros Klebsiella, Escherichia, Enterobacter, Citrobacter y Serratia. Cuatro de estos géneros (Klebsiella, Enterobacter, Citrobacter y Serratia) se encuentran en grandes cantidades en el ambiente (fuentes de agua, vegetación y suelos), no están asociados necesariamente con la contaminación fecal y no representan obligatoriamente un riesgo evidente para la salud 3, 4. Sin embargo la presencia de Escherichia coli se asocia a contaminación de origen fecal por lo que esta especie se considera el microorganismo indicador de contaminación fecal por excelencia 4. Teniendo en cuenta que los ecosistemas en los que se trabajó son ríos contaminados 5, y que la presencia de este microorganismo en sus aguas es elevada y que la misma representa un riesgo a la salud para aquellas personas que, ya sea de forma directa o indirecta, utilizan estas aguas contaminadas se identificaron solo las colonias correspondientes a esta especie. La concordancia en la identificación bacteriana entre el sistema VITEK y el sistema API 20E fue de 94.5 % en género y especie (Tabla 1). Con el sistema API 20E todos los aislados evaluados fueron identificados como Escherichia coli sin embargo por el sistema VITEK se encontraron 5 resultados discordantes de identificación entre el sistema API20E y este ultimo sistema, obteniéndose el siguiente resultado: 87 cepas de Escherichia coli, 4 cepas de Citrobacter freundii y 1 cepa Leclercia adecarboxy. El tiempo de obtención de los resultados para la identificación por el sistema API 20E y el sistema VITEK fue de 24 h y 6 h respectivamente. 3

5 Tabla 1. Comparación entre los resultados de identificación obtenidos por el sistema VITEK y el sistema API 20E. Sistema API 20E Sistema VITEK Microorganismo No. Microorganismo No. Escherichia coli 92 Escherichia coli 87 Citrobacter freundii 4 Leclercia adecarboxy 1 Total de muestras En la evaluación de los sistemas automatizados en microbiología otros autores han utilizado cepas de origen clínico o de colección, lo cual debe ser tomado en cuenta, ya que los resultados de ambos tipos de evaluaciones pueden ser muy diferentes 6. Por otro lado, la evaluación con cepas aisladas de otras fuentes, tales como agua, tiene utilidad en los laboratorios que se dedican a la evaluación de la calidad microbiológica de las aguas, debido a que permite la obtención de resultados rápidos y confiables, imprescindibles en este tipo de servicio. Fue con base en lo anterior que en esta evaluación se emplearon cepas de origen ambiental, específicamente aisladas de ecosistemas dulceacuícolas contaminados. Entre los sistemas miniaturizados de identificación microbiana disponibles en la actualidad, basados en el metabolismo de sustratos específicos por parte de los microorganismos y su detección mediante diversos sistemas indicadores, destacan el sistema API y el VITEK 1. Los resultados de este trabajo mostraron que el método VITEK resulta confiable en la identificación de enterobacterias, específicamente Escherichia coli. Los resultados de identificación correcta fueron mejores que los reportados por O Hara y cols, 86% para las enterobacterias. Son diversos los estudios que han evaluado el rendimiento del sistema VITEK en la identificación bacteriana de aislamientos clínicos. La concordancia encontrada en el presente estudio entre ambos sistemas comerciales empleados fue buena a pesar de existir algunas discrepancias. No está reportado cual es el número de cepas a evaluar para llegar a conclusiones de concordancia, ni tampoco cual es el estándar o método de referencia más adecuado 6. VITEK realizó la identificación correcta a nivel de especie en el 100 % de los aislamientos evaluados, definiendo géneros y especies más comunes en este tipo de aislamiento ya que los tres géneros encontrados en las muestras corresponden con microorganismos frecuentes en este tipo de muestras. Estos resultados indican una buena precisión de este instrumento, si se tienen en cuenta los criterios indicados en la 8 va Edición del Manual of Clinical Microbiology 8, que señalan que cuando la identificación es superior al 90 % de los aislamientos comunes, el sistema de identificación es preciso. En este sentido Funke y cols, reportan para VITEK un 97. 3% de identificación correcta a nivel de especie en gramnegativos. Diversos autores han evaluado a los sistemas API y VITEK para la identificación bacteriana, y los han comparado con otros sistemas automatizados tales como el sistema Phoenix. Eigner y cols compararon el sistema Phoenix con VITEK en la identificación de 141 aislamientos clínicos de enterobacterias utilizando API como método de referencia 4

6 para la resolución de discrepancias, obteniendo un 96% de identificación correcta, similar a lo obtenido en este estudio. Menozzi y cols. evaluaron la identificación en Phoenix empleando 387 aislamientos clínicos y 109 cepas de colección de enterobacterias y bacilos no fermentadores, comparándolos con VITEK y API, obteniendo una identificación correcta del 98% y 99%, respectivamente para ambos grupos bacterianos. En este estudio, los errores de identificación observados en API para bacilos gramnegativos se presentaron en 5 cepas y se observaron a nivel de género. Esto puede estar dado porque no existen marcadas diferencias en la identificación bioquímica de los géneros encontrados, sobre todo entre Escherichia spp. y Citrobacter spp., ambos miembros del grupo de los coliformes. Debemos señalar que aunque el mayor número de reportes en el empleo de estos métodos está dado para el análisis de muestras de origen clínico, los resultados de este trabajo indican que tanto el sistema VITEK como el sistema API resultan confiables para el análisis de muestras ambientales ya que el aislamiento de las mismas se realizó a partir de un medio de cultivo selectivo y diferencial para microorganismos coliformes. Es de destacar que durante el período de evaluación se pudo constatar las ventajas que ofrece este instrumento en cuanto al tiempo de obtención de los resultados. El tiempo promedio fue de 6 h para el sistema VITEK y de 24 h para el sistema API, ambos constituyen resultados satisfactorios teniendo en cuenta que fue posible llegar hasta especie empleando ambos sistemas y sin emplear pruebas complementarias para alcanzar este resultado en un solo día de trabajo. Los resultados obtenidos en los ensayos de sensibilidad antimicrobiana se muestran en la figura 1. Figura 1. Proporción porcentual de los aislados bacterianos aislados según su susceptibilidad antibiótica frente a los diferentes antibióticos empleados. Del total de cepas el 79% fueron sensibles a los antimicrobianos probados, el 21% resistente al menos un antibiótico. Las cepas aisladas mostraron susceptibilidad a los antibióticos ampicillina (12 cepas), trimetropin/sulfametoxazol (10 cepas), levofloxacina (7 cepas), ciprofloxacina (8 cepas), gentamicina (3 cepas), nitrofurantoina (2 cepas), cefazolina (2 cepas). Los patrones de resistencia encontrados se muestran en la tabla 2. 5

7 Tabla 2. Patrones de resistencia encontrados en las cepas de Escherichia coli evaluadas. # Patrones # Antibióticos Combinación Antibióticos Total de cepas 1 1 TM/SXT CN TM/SXT-AMP CN- TM/SXT AMP-CZ AMP-CIP-LVX AMP-CIP-LVX-FD AMP-CIP-LVX- TM/SXT AMP-AMP/SUL-PRL-CN AMP-CIP-LVX-CZ- TM/SXT AMP-AMP/SUL-CIP-PRL- TM/SXT 1 Leyenda:TM/SXT-Sulfametoxazol-trimetropim, CN-Gentamicina, AMP-Ampicillina AMP/SUL- Ampicillina Sulbactan, PRL- Piperacilina, CIP-Ciprofloxacina, CZ- Cefazolina, LVX- Levofloxacina, FD- Nitrofurantoina La resistencia observada en este estudio fue baja al compararla con la encontrada en otros trabajos como los realizados por Zambrano y colaboradores en el Se ha determinado que el 90% de las cepas de E. coli aisladas de aguas impactadas por descargas fecales de origen humano presentan resistencia al menos a uno o dos antibióticos. En este estudio sin embargo, solo el 21 % de las cepas aisladas de los tres ecosistemas dulceacuícolas contaminados evaluados presentaron resistencia al menos frente a un antibiótico. Solo el 10 % de éstas presentaron resistencia a tres o más antimicrobianos. Al analizarlos resultados se observa que las cepas evaluadas mostraron uno de los mayores valores de resistencia frente al antibiótico trimetropin-sulfametoxazol, resultados similares a los descritos por Zambrano y colaboradores (2002) en una investigación realizada en aguas residuales crudas y tratadas de lagunas de estabilización de la Universidad de Zulia, donde se encontraron niveles de 16,12% y 46,87 % de resistencia en aguas crudas y tratadas respectivamente. En Cuba, el sulfametoxazol + trimetoprim, la ciprofloxacina y la ampicilina, entre otros, se indican con mucha frecuencia en las consultas de atención primaria de Salud, motivada como terapéutico antimicrobianos por su eficacia en el tratamiento de múltiples procesos infecciosos, su disponibilidad habitual en el mercado y bajo costo 13. Por otra parte, se ha demostrado la eficacia del uso del sulfametoxazol + trimetoprim en las infecciones urinarias bajas no complicadas, debido a las concentraciones bactericidas del antibiótico que suelen alcanzarse en este sitio. Los tres ecosistemas evaluados reciben aguas residuales provenientes de comunidades e instituciones de salud cercanas, lo que probablemente contribuya a la presencia de cepas resistentes a algunos de los antibióticos evaluados. La resistencia a ampicilina fue la otra de mayor porcentaje (14 %). Andersen (1993) registró la resistencia a ampicilina como la mayor encontrada en un sistema de tratamiento de efluentes urbanos en Copenhague, Dinamarca. Harwood, en el año 2000, detectó un porcentaje significativo de cepas coliformes de origen humano que fueron resistentes a los antibióticos de la familia de los betalactámicos, entre ellos ampicilina, a diferencia de cepas de origen animal, las cuales presentaban resistencia frente a tetraciclina y sus derivados. 6

8 Los patrones de resistencia se han propuesto como parámetros para el estudio de la calidad de las aguas, sobre todo en aquellos casos donde es necesario establecer si el origen de la contaminación es humana o animal. La diferencia en la resistencia entre cepas de origen humano es significativamente diferente de aquellas que provienen de animales de sangre caliente, ya que los antimicrobianos y las dosis utilizados en los tratamientos de infecciones bacterianas en humanos y en animales son diferentes; además, en animales se emplean grandes cantidades de antibióticos, para su engorde 12, 16,17. La multirresistencia observada en este estudio fue muy baja, solo 2 cepas mostraron resistencia a tres o más antibióticos. Sin embargo, la presencia en las aguas de estos ríos de cepas multirresistentesmuestra la importancia de realizar monitoreos continuos de estos ecosistemas. La diferencia en los patrones de resistencia entre cepas provenientes de muestras clínicas y ambientales podría significar que el ambiente está influyendo directamente en este comportamiento. Se ha encontrado resistencia adquirida a antibióticos como el ácido nalidíxico en cepas de enterobacterias y del género Aeromonas en un porcentaje mayor en esta última, lo cual podría explicar la variabilidad de los patrones de resistencia en cepas de origen ambiental 18. Otros autores, sin embargo, afirman que las poblaciones de bacterias multirresistentes en ecosistemas acuáticos contaminados pueden incrementarse o disminuir, debido a los distintos fenómenos de intercambio genético promovido por plásmidos transmisibles por conjugación 14. En diversos estudios realizados en estos ecosistemas, de acuerdo al grado de contaminación microbiológica que presentan estas aguas (concentraciones de coliformes totales y fecales superiores 5x10 3 ufc/100ml) su empleo representa un riesgo potencial para la salud 5. Estos valores son reflejo de los constantes efluentes que reciben a lo largo de sus recorridos, por lo que es difícil que se observen procesos de autodepuración. En la prueba de susceptibilidad antimicrobiana se considera que hubo buenos resultados pues se logró realizar la evaluación de la susceptibilidad a todas las cepas de Escherichia coli identificadas, aunque estos resultados no fue posible compararlos con los obtenido con otro método. La mediana del tiempo de demora por el sistema VITEK fue 8 h, lo que constituye una ventaja de este método con relación a los métodos convencionales de difusión en disco. Además la misma tarjeta que se utiliza para el antibiograma realiza la detección de las Beta-lactamasas de expectro extendido (BLEE), aunque en el presente estudio ninguna de las cepas evaluadas resultó positiva a esta prueba. Por tanto, este método es potencialmente más apto que los de dilución para la detección de ciertos mecanismos de resistencia. Por último, la obtención de resultados antes de las 10 h de realizada la prueba es un beneficio indiscutible que ofrece este sistema automatizado en el análisis de cualquier tipo de muestra. Los resultados obtenidos en el presente trabajo indican la utilidad del sistema VITEK para la identificación bacteriana y el antibiograma de bacterias de origen ambiental, específicamente aquellas aisladas de ecosistemas de agua dulce contaminados. CONCLUSIONES 1. El sistema VITEK constituye una herramienta útil en la identificación bacteriana y la determinación de la susceptibilidad antimicrobiana de bacterias aisladas de ecosistemas dulceacuícolas. 2. Se obtuvo un 94,3% de concordancia en la identificación hasta especie entre los sistemas API 20E y VITEK. 7

9 3. Los tiempos de demora en la obtención de los resultados, tanto en la identificación como en la determinación de la susceptibilidad, fueron menores a las 10 h por el sistema VITEK lo que avala el uso de este sistema en el diagnóstico microbiológico. BIBLIOGRAFÍA 1. Jordá L, Vila A, Lanza A, Bonvehi P, Nazar J, Mikietuk A, Labat R, Smayevsky J. Utilidad del sistema VITEK en la identificación bacteriana y estudios de susceptibilidad antimicrobiana. Acta Bioquím Clín Latinoam 2005; 39 (1): Shoeb H. Bacterial identification by the analytical profile index system- Analytical profile index E20 for Enterobacteriaceae. Visual Resources, Microbe Allen M. La importancia para la salud pública de los indicadores bacterianos que se encuentran en el agua potable. Reunión sobre la calidad del agua potable.1996; CEPIS. OPS. OMS. Lima, Perú. 4. Edberg SC, Rice EW, Karlin RJ, Allen MJ. Escherichia coli: the best biological drinking water indicator for public health protection. Symp Ser Soc Appl Microbiol 2000; 29, Chiroles S, González Ma I, Torres T, Valdés M, Domínguez I. Bacterias indicadoras de contaminación fecal en aguas del río Almendares (Cuba). Hig. Sanid. Ambient 2007;7: Fagundo-Sierra R, Cerros Santos MA, Pérez-Jáuregui J. Evaluación del instrumento automatizado Phoenix en la identificación y antibiograma de bacterias de origen clínico. Bioquimia 2007; 32(2): O Hara CM, Westbrook G, Miller M. Evaluation of VITEK GNI+ and Becton Dickinson Microbiology Systems Crystal E/NF Identification Systems for Identification of members of the family Enterobacteriaceae and other gramnegative, glucose-fermenting and non-glucosefermenting bacilli. J Clin Microbiol 1997; 35: O Hara, CM. Evaluation of the Phoenix 100 ID/AST System and NID panel of identification o Enterobacteriaceae, Vibrionaceae, and commonly isolated nonenteric gram negative bacilli. Clin Microbial Rev 2005; 18: Funke G, Funke-Kissling P.Evaluation of the new VITEK 2 card for identification and of clinically relevant gram negative rods. J Clin Microbiol 2004; 42: Eigner U, Schmid A, Wild U, BerstchD, Fahr A. Analysis of a comparative workflow and perfomance characteristics of the Vitek 2 and Phoenix Systems. J Clin Microbiol 2005; 43: Menozzi MG, Eigner U, Covan S, Rossi S, Somenzi P, et al. Two center collaborative evaluation of performance of the BD Phoenix automated microbiology system for identification and antimicrobial susceptibility testing of gram negative bacteria. J Clin Microbiol 2006; 44: Zambrano JL, Botero L, Cavazza ME, Avila M. Resistencia a antimicrobianos y presencia de plásmidos en cepas de Escherichia coli aisladas de aguas residuales crudas y tratadas de lagunas de estabilización con fines de reuso en agricultura. Rev Soc Ven Microbiol 2002; 22: Muiños Andersen S. Effects of waste water treatment on the species composition and antibiotic resistance of coliform bacteria. Current Microbiol 1993; 26: Harwood, V., Whitlock, J., Withington, V. Classification of antibiotic resistance patterns of indicator bacteria by discriminant analysis: use in predicting the source 8

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