RESULTADOS DEL PROGRAMA DE CONTROL DE CALIDAD DE LA CARGA VIRAL DEL VIH.

Transcripción

1 PROGRAMA DE CONTROL DE CALIDAD DE LA CARGA VIRAL DEL VIH Responsables del programa: Secretaría del Plan Nacional sobre el Sida: Dr. F. Parras, Dr. L. Guerra y Dra J. Del Amo Tl ; fax ; Agradecimientos a Dr J Cañón Centro Nacional de Microbiología del Instituto de Salud Carlos III Dra. A. Bernal, Dr. A. García Saiz,: Tl /01, fax Sociedad Española de Enfermedades Infecciosas y Microbiología Clínica Dr. J. L. Pérez Sáenz: Tl ext 2099/2642. Fax Dra. C. Gimeno Cardona. Tl Fax Patrocinadores del programa: Roche Diagnostics Chiron Diagnostics Las publicaciones de la Secretaría del Plan Nacional sobre el Sida están disponibles en internet. Puede acceder a ellas en la siguiente dirección: Autorizada la reproducción siempre que se cite la fuente RESULTADOS DEL PROGRAMA DE CONTROL DE CALIDAD DE LA CARGA VIRAL DEL VIH. INTRODUCCIÓN (3º Envío. MAY-JUL 1999)

2 El conocimiento de la patogenia de la infección VIH ha progresado de forma importante durante los últimos años. Uno de los avances ha sido el desarrollo de nuevas técnicas moleculares diseñadas para detectar y cuantificar el número de copias de RNA viral. La carga viral tiene un alto valor como marcador de laboratorio, ya que permite realizar el seguimiento clínico y la respuesta terapéutica del paciente infectado por el VIH-1, utilizandose también como variable intermedia en los ensayos clínicos con antiretrovirales. Existen en la actualidad tres tecnologías para cuantificar la carga viral plásmática, AMPLICOR HIV-1 MONITOR, QUANTIPLEX HIV RNA v.3 y NASBA HIV-1 en las cuales se han realizado modificaciones para mejorar la sensibilidad, reducir el volumen de la muestra necesario y mejorar el límite de detección de cada uno de los métodos. En este envío, se ha incorporado la posibilidad de envío de estándares realizados mediante técnicas ultrasensibles para los métodos AMPLICOR HIV-1 Y QUANTIPLEX. La Secretaría del Plan Nacional sobre el Sida (SPNS), el Centro Nacional de Microbiología (CNM) del Instituto de Salud Carlos III y la Sociedad Española de Enfermedades Infecciosas y Microbiología Clínica (SEIMC), con el apoyo de las empresas Roche Diagnostics y Chiron Diagnostics, han puesto en marcha un programa de control de calidad de carga viral desde El programa piloto se ofertó a los centros dependientes del INSALUD, participando en la primera fase 17 laboratorios y 63 laboratorios en la segunda. Se han editado dos documentos, uno en enero de 1998 y otro en junio de 1998, con los resultados obtenidos. En este tercer envío, el programa se ha ofertado a los laboratorios del Sistema Nacional de Salud de todas las CC.AA., así como a los laboratorios privados que desearon participar. Para más detalles sobre las características de este programa revisar el protocolo de trabajo correspondiente, enviado con anterioridad a todos los laboratorios a los que se les ofertó su participación. Este documento así como los resultados los envíos anteriores están disponibles en formato electrónico en la web de la SPNS ( El programa de control de calidad de carga viral tiene como objetivo facilitar y contrastar los resultados obtenidos por los laboratorios participantes respecto al número de copias de RNA del VIH, con el fin de tratar mejorar los resultados de carga viral. El deseo de la organización es que resulte un programa dinámico, de carácter periódico y que pueda servir a todos los participantes para el proceso de mejora continua de su calidad. MATERIAL Y MÉTODOS 1.- Procedimiento de obtención y preparación de los estándares de RNA por el CNM. El virus seleccionado para la preparación de los estándares (diluciones de virus en plasma a una concentración determinada) fue obtenido de los linfocitos de sangre periférica de un niño de 11 años sintomático, con criterios de sida, con 22 linfocitos CD4/ml (aislado nº 302/91, laboratorio de retrovirus del CNM). El virus se obtuvo mediante cocultivo con linfocitos de sangre periférica (PBMCs) humanos, y ha sido caracterizado como fenotipo sincitial y genotipo B. Se replicó en PBMCs humanos y el sobrenadante del cultivo se clarificó mediante centrifugación y se almacenó a -70ºC. Los paneles de estándares se han construido a partir de la dilución del virus 302/91 en plasma humano procedente de donante sano (sangre anticoagulada con citrato y centrifugada a g durante 20 minutos). El plasma utilizado ha sido controlado para detectar la presencia de infección por retrovirus (VIH 1/2, HTLV I/II), Hepatitis B y Hepatitis C, habiendo sido negativos todos los controles. 2.- Composición de los paneles. Cada panel de estándares está compuesto por seis criotubos codificados, cinco de ellos conteniendo una cantidad conocida de copias de RNA/ml y uno con plasma humano negativo para VIH-1. Los estándares con las diferentes concentraciones de virus en plasma han sido realizados partiendo de una concentración de más de un millón de copias de RNA/ml. Tras la preparación de los paneles en el CNM, todos ellos se mantienen a -70ºC. En la tabla 1 se presentan los valores de los estándares enviados. 3.- Laboratorios participantes. En el anexo I, aparecen todos los laboratorios que mostraron su deseo de participar en este programa de control de calidad. Se han recibido resultados de 76 laboratorios de los 82 a los que se les enviaron los estándares. Cada laboratorio tiene un código otorgado por la SEIMC, al que se aludirá en cada una de las tablas donde se presentan los resultados. Tres laboratorios han enviado los resultados sin código; dos utilizaron la técnica de Amplicor

3 HIV1 Monitor (ver tabla 2) y otro utilizó NASBA (resultados no incluidos en este informe). Dos laboratorios (códigos 13 y 43) no especificaron la técnica utilizada por lo que no se han incluido en los análisis. 5.- Criterios de evaluación Las comparaciones de los resultados enviados con los valores de referencia se realizan expresados en Logaritmos en base 10 (log 10 ), asumiendo que las diferencias de los log 10 del número de copias se distribuyen de forma normal. El estándar marcado como AES3, verdadero control negativo, preparado con plasma humano negativo se analizó de forma cualitativa, considerando como correcto los resultados que los laboratorios remitían como por debajo de sus límites de detección. El resto de los estándares se analizó de forma cuantitativa como se describe a continuación. El valor considerado de referencia con la técnica estándar de AMPLICOR HIV-1 MONITOR, para cada uno de los estándares fue la media de todos los laboratorios participantes para el mismo estándar tal y como se lee en la tabla 4 (AAS copias/ml, ACS copias/ml, ABS copias/ml y ADS3 692 copias/ml. El estándar AFSE tenía menos de 200 copias /ml y el estándar AES3 era el verdadero control negativo). Para este cálculo, se excluyeron del análisis los valores de los laboratorios 2, 51, 54 y 68 por presentar valores extremos con el fin de obtener una mejor estimación y una menor dispersión de los valores, medida por la DS. Los márgenes aceptados de diferencia interlaboratorios son de 0,2 log 10. Sumando y restando esta cifra al valor de referencia construiremos unos limites en el entorno del valor aceptado como correcto de cada uno de los estándares. El escaso número de laboratorios que han realizado la técnica de QUANTIPLEX HIV RNA V.3 y de AMPLICOR HIV-1 MONITOR ultrasensible nos lleva a comparar los resultados obtenidos con el laboratorio de referencia del CNM. Los márgenes aceptados de diferencia respecto al valor considerado como estándar es también de 0,2 log 10. Las fases del análisis fueron: a. Determinar para cada uno de los laboratorios participantes si el valor obtenido para cada uno de los estándares está dentro de los márgenes aceptados. b. Calcular el porcentaje de laboratorios que se encuentra dentro de los márgenes aceptados para cada uno de los estándares. c. Hallar la distribución de las copias obtenidas por los laboratorios en cada uno de los estándares y calcular su media y su desviación estándar. d. Analizar la correlación de los resultados intralaboratorio. Los estándares rotulados como AAS3 y ACS3 corresponden a la misma dilución, por lo que se puede determinar la correlación o el grado de concordancia dentro de un mismo laboratorio. RESULTADOS En la tercera etapa de este programa han participado 76 laboratorios, tres de ellos han realizado el análisis con dos técnicas diferentes. La técnica estándar de AMPLICOR HIV-1 MONITOR se utilizó por 56 laboratorios, 3 utilizaron la técnica ultrasensible de AMPLICOR HIV-1 MONITOR, 8 usaron la técnica de QUANTIPLEX HIV RNA v.3, y 7 la técnica NASBA HIV-1 QT (Nuclisens HIV-1 QT). Dos laboratorios (13 y 43) no especificaron la técnica utilizada. El informe correspondiente a los resultados de los laboratorios que utilizaron la técnica de NASBA HIV-1 QT (Nuclisens HIV-1 QT) se ha remitido a los interesados de forma individual, no formando parte de este documento. Los resultados cuantitativos del análisis para los laboratorios que utilizaron la técnica estándar de AMPLICOR HIV-1 MONITOR se presentan en la tabla 2. En la tabla 3 se muestran los resultados de aquellos que utilizaron la técnica ultrasensible de AMPLICOR HIV-1 MONITOR. En el gráfico 1 se observa que el 96,4 % de las muestras analizadas se encuentran dentro de los márgenes de seguridad en el estándar AES3 (control negativo), el 91,1% en el estándar AFS3 (<200 copias), el 55,4% en el ADS3 (692 copias), el 76,8% en ACS3 ( copias), el 66,1% en el ABS3 (3.388 copias) y el 63,6% en el AAS3 ( copias).

4 La media y la desviación estándar (DS) de las copias (y log 10 ) obtenidas por los laboratorios, se presentan en la tabla 4 (no se ha calculado estas medidas en los estándares negativos). Los resultados del análisis para los ocho laboratorios que utilizaron la técnica QUANTIPLEX HIV RNA v.2 se presentan en la tabla 5. En el gráfico 2 se representa cada uno de los estándares así como la dispersión relativa respecto a los márgenes establecidos. Los estándares codificados como AAS3 y ACS3 tienen idéntico número de copias. La media de copias para todos los laboratorios en estos dos estándares fue muy similar en ambos (4,54 y 4,52 respectivamente). Se excluyeron los valores de 2 laboratorios; laboratorio 30 ya que no había realizado el estándar AAS3 y el laboratorio 54 por presentar valores muy extremos. La correlación intralaboratorio medida por "r" fue de 0,73 y una "r 2 " de 0,53. La tendencia lineal de estos datos se puede observar en el gráfico 3. CONCLUSIONES La evolución del control de calidad de la carga viral viene marcada por un aumento del número de laboratorios participantes, así como por unos resultados globales aceptables y mantenidos en los tres estudios realizados hasta el momento. La técnica estándar AMPLICOR HIV-1 MONITOR ha seguido siendo la más utilizada por la mayoría de los laboratorios. El porcentaje de muestras dentro de los márgenes fue 72,6% en el primer envío, 73,4% en el segundo y de 74,9% en el envío actual. Las técnicas ultrasensibles están siendo introducidas en los laboratorios, empleándose tanto la de AMPLICOR HIV-1 MONITOR como QUANTIPLEX V3. Así, 10 de los 11 laboratorios que analizaron el estándar AFS con técnicas ultrasensibles, detectaron un menor número de copias de RNA. El análisis de los resultados y la forma de expresarlo está, obviamente, sujeto a las posibles mejoras que se consideren pertinentes y abierto a críticas y comentarios de todos, especialmente de los laboratorios participantes. Código Quantiplex V 3.0 Cobas Amplicor HIV-1 Monitor Ensayo Estándar Ensayo Ultrasensible Log 10 Copias/ml Log 10 Copias/ml Log 10 Copias/ml AAS3 4, , , ABS3 3, , , ACS3 4, , , ADS3 3, , , AFS3 2, <2,3 <200 1,53 34 AES3 <1,7 < 50 <2,3 <200 <1,7 Estándares analizados por el laboratorio del Servicio de Diagnóstico y Referencia de Retrovirus, CNM, España CÓDIGO ANÁLISIS DE CONCORDANCIA DE LAB* AAS ACS ABS ADS AFS AES** dentro fuera % <200 <200 (4,54) (4,52) (3,53) (2,84) (<2.3) (<2.3)

5 < % *** (5,8) (5,7) (4,8) (4,1) (<2.3) 4, <200 < % (4,3) (4,6) (3,0) (2,65) (<2.3) (<2.3) <200 < % (4,76) (4,43) (3,52) (2,79) (<2.3) (<2.3) <200 < % (4,4) (4,4) (3,33) (2,63) (<2.3) (<2.3) <200 < % (4,45) (4,27) (3,18) (2,64) (<2.3) (<2.3) <200 < % (4,75) (4,6) (3,5) (2,7) (<2.3) (<2.3) <200 < % (4,76) (4,61) (3,72) (2,87) (<2.3) (<2.3) <200 <200 < % (4,29) (4,45) (3,29) (<2,3) (<2.3) (<2.3) <200 < % (4,32) (4,54) (3,62) (2,9) (<2.3) (<2.3) <200 < % (4,62) (4,54) (3,53) (2,89) (<2.3) (<2.3) < % (4,73) (4,81) (3,39) (2,97) (2.75) (<2.3) <200 < % (4,4) (4,47) (3,45) (2,9) (<2.3) (<2.3) <200 < % (4,35) (4,43) (3,41) (2,85) (<2.3) (<2.3) <200 < % (4,44) (4,35) (3,7) (2,79) (<2.3) (<2.3)

6 < % (4,54) (4,57) (3,74) (2,83) (2.53) (<2.3) <200 < % (4,77) (4,67) (3,93) (3,01) (<2.3) (<2.3) < % (4,78) (4,66) (4,04) (2,56) (2.36) (<2.3) 30 * <200 <200 * % (4,04) (3,56) (2,3) (<2.3) (<2.3) <200 < % (4,6) (4,82) (3,63) (3,08) (<2.3) (<2.3) <200 < % (4,59) (4,52) (3,73) (3,07) (<2.3) (<2.3) <200 < % (4,46) (4,53) (3,41) (2,83) (<2.3) (<2.3) <200 <200 < % (4,54) (4,54) (3,51) (2,3) (<2.3) (<2.3) <200 < % (4,4) (4,72) (3,41) (2,68) (<2.3) (<2.3) <200 < % (4,4) (4,34) (3,61) (2,77) (<2.3) (<2.3) <200 < % (4,71) (4,64) (3,61) (3,11) (<2.3) (<2.3) <200 < % (4,45) (4,55) (3,4) (2,73) (<2.3) (<2.3) <200 < % (4,62) (4,61) (3,46) (2,97) (<2.3) (<2.3) <200 < % (4,89) (4,48) (3,64) (2,68) (<2.3) (<2.3)

7 <200 < % (4,56) (4,57) (3,85) (2,82) (<2.3) (<2.3) <200 < % (4,12) (4,16) (3,19) (2,42) (<2.3) (<2.3) < % (4,43) (4,49) (3,39) (3,0) (2.39) (<2.3) <200 < % (4,44) (4,63) (3,51) (2,71) (<2.3) (<2.3) <200 < % (4,53) (4,49) (3,42) (2,71) (<2.3) (<2.3) <200 <200 < % *** (5,37) (4,85) (3,78) (<2,3) (<2.3) (<2.3) <200 < % (4,54) (4,69) (3,82) (2,67) (<2.3) (<2.3) <200 < % (4,61) (4,59) (3,68) (3,3) (<2.3) (<2.3) <200 < % *** (5,73) (4,8) (3,51) (3,04) (<2.3) (<2.3) <200 < % (4,83) (4,9) (3,67) (3,08) (<2.3) (<2.3) <200 < % (4,77) (4,6) (3,51) (2,3) (<2.3) (<2.3) <200 < % (4,74) (4,57) (3,88) (3,13) (<2.3) (<2.3) <200 < % (4,41) (4,51) (3,56) (2,77) (<2.3) (<2.3) <200 < % (4,29) (4,34) (3,04) (2,88) (<2.3) (<2.3)

8 <200 < % (4,51) (4,46) (3,5) (3,05) (<2.3) (<2.3) <200 < % (4,55) (4,37) (3,5) (2,53) (<2.3) (<2.3) <200 < % (4,6) (4,52) (3,44) (3,15) (<2.3) (<2.3) < % *** (5,11) (4,86) (3,24) (3,07) (<2.3) (3,28) <200 < % (4,45) (4,53) (3,53) (2,95) (<2.3) (<2.3) < % (4,45) (4,5) (3,86) (3,04) (2.53) (<2.3) <200 < % (4,41) (4,85) (3,71) (2,9) (<2.3) (<2.3) <200 < % (4,47) (4,58) (3,34) (3,17) (<2.3) (<2.3) <200 < % (4,38) (4,38) (3,4) (3,07) (<2.3) (<2.3) <200 < % (5,17) (4,61) (3,53) (2,77) (<2.3) (<2.3) <200 < % (4,72) (4,76) (3,82) (3,04) (<2.3) (<2.3) <200 < % (4,64) (4,26) (3,58) (2,99) (<2.3) (<2.3) CÓDIGO ANÁLISIS DE CONCORDANCIA DE LAB* AAS ACS ABS ADS AFS AES** dentro fuera % <200 <200 (4,54) (4,52) (3,53) (2,84) (<2.3) (<2.3)

9 SC <200 < % (4,45) (4,33) (3,37) (3,24) (<2.3) (<2.3) SC <200 < % (4,26) (4,41) (3,17) (3,27) (<2.3) (<2.3) Referencia: media de resultados de laboratorios participantes (tabla 4) (*) Las filas vacías de la tabla representan laboratorios que no han remitido resultados (**) Verdadero control negativo (***) Los valores 2, 51, 54 y 68 se excluyeron del cálculo de promedios SC: Sin código de laboratorio Tabla 3 Resumen de datos de forma cuantitativa para la técnica Amplicor HIV1 Monitor; Ensayo ultrasensible CÓDIGO ESTÁNDARES para técnica ultrasensible Número de copias/ml (log 10 ) ANÁLISIS DE CONCORDANCIA DE LAB* AAS ACS ABS ADS AFS AES** dentro fuera % (4.22) (4.29) (3.33) (2.73) (1.53) (<1.7) % (4.13) (4.25) (3.39) (2.64) (1,77) % (4,45) (4,40) (3,30) (2,72) (1,77) (<1.7) < % (4,46) (4,78) (3,58) (2,59) (2,08) Referencia: datos del laboratorio de referencia CNM (tabla 1) (**) Verdadero control negativo Tabla 4 Resumen de resultados de forma cuantitativa (Amplicor HIV Monitor Ensayo Standar). Estándares Copias/ml media de laboratorios (***) Log 10 media de todos los laboratorios (***) Ds Log 10 % de laboratorios dentro de los márgenes Estándar AAS ,6%

10 Estándar ABS Estándar ACS Estándar ADS Estándar AFS Estándar AES TOTAL ,1% % % <200 < 2,3-91.1% <200 * % 74.9% (*) Verdadero control negativo (***) Los valores 2, 51, 54 y 68 se excluyeron del cálculo de promedios Tabla 5 Resumen de los datos de forma cuantitativa para la técnica QUANTIPLEX HIV-1 V.3. CÓDIGO DE LAB ESTÁNDARES (*) Número de copias/ml (log 10 ) Análisis de concordancia AAS3 ACS3 ABS3 ADS3 AFS3 AES3(**) dentro fuera % , (4,29) (4,39) (3,42) (3,07) (2,59) (1,7) % (4,20) (4,25) (3,37) (2,78) , % (4,33) (4,31) (3,46) (3,10) (2,40) % (4,36) (4,44) (3,50) (2,82) (1,96) % (4,30) (4,41) (3,12) (2,80) (1,92) % (4,47) (4,37) (3,46) (2,90) (2,05) %

11 (4,3) (4,2) (3,4) (2,9) (2,1) % (4,16) (4,19) (3,42) (3,00) (2,13) % (4,27) (4,19) (3,47) (3,00) (2,50) (*) Datos del laboratorio de referencia CNM (**) Verdadero control negativo Gráfico 2. Representación del logaritmo del número de copias RNA obtenidas por cada laboratorio según los diferentes estándares

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